O efeito do estresse osmótico em vesículas secretoras e exocitose de monitoramento

O objetivo geral desta metodologia analítica combinada é fornecer informações sobre como as vesículas secretoras nas células respondem a uma força física, como a pressão osmótica extracelular, e como os ajustes dessas organelas afetam ainda mais o processo de exocitose. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como, como as vesículas secretoras respondem diretamente às mudanças no ambiente extracelular ou ao tratamento medicamentoso? A principal vantagem dessa abordagem é monitorar os efeitos diretos no conteúdo vesicular das células vivas e saber distinguir a alteração em sua liberação de reh-chemical-ed antes e depois do tratamento da exocitose.

Para obter uma superfície plana do eletrodo de disco, coloque o eletrodo no suporte de um micromoedor e chanfre cada eletrodo de fibra de carbono em um ângulo de 45 graus. Em seguida, marque o capilar para referência futura de como localizar a superfície do eletrodo do disco em um ângulo de 45 graus ao colocar o eletrodo próximo às células para medição de exocitose. Para realizar o registro amperométrico em células individuais, monte o microeletrodo de disco de fibra de carbono recém-chanfrado e testado no suporte do eletrodo do estágio principal que é usado com um potenciostato.

Antes de usar, coloque cada microeletrodo de fibra de carbono em uma solução de teste para monitorar a corrente do estado de estudo usando voltametria cíclica. Para uma varredura de voltametria cíclica, aplique uma forma de onda de potencial triangular de 0,2 volts negativos a 0,8 volts positivos contra um eletrodo de referência de cloreto de prata-prata a 100 milivolts por segundo para garantir uma boa cinética de reação. Para o registro de amperometria da exocitose, coloque a placa de Petri com células cromafins cultivadas em tampão isotônico em um microscópio invertido em uma gaiola de Faraday.

Use um estágio de aquecimento do microscópio para manter uma temperatura de 37 graus Celsius durante os experimentos com células. Em seguida, use um instrumento de patch clamp de baixo ruído para aplicar um potencial constante de 700 milivolts positivos no eletrodo de trabalho. Para registrar a exocitose de células cromafins, digitalize o sinal a 10 kilohertz e aplique um filtro Bessel passa-baixa interno a dois kilohertz para filtrar o sinal registrado.

Observe que o eletrodo de disco oval precisa ser colocado plano no topo das células e paralelo à superfície da placa de Petri. Além disso, os eletrodos são chanfrados no mesmo dia dos experimentos para garantir uma superfície limpa do eletrodo. Para estimular a exocitose celular, posicione uma micropipeta de vidro cheia de solução de cloreto de bário de cinco milimolares a uma distância de pelo menos 20 micrômetros da célula.

Em seguida, aplique um pulso de injeção de cinco segundos de solução de cloreto de bário de cinco milimolares na superfície da célula para estimular a exocitose celular. Coloque a pipeta de haste na solução e estimule a exocitose celular aplicando um pulso de injeção de bário enquanto registra os transientes de corrente amperométrica por aproximadamente três minutos. Para comparar as respostas exocitóticas em condições isotônicas com condições hipertônicas, incube as células por 10 minutos em solução tampão hipertônica.

Em seguida, aplique um pulso de injeção de bário para estimular a exocitose e realize três minutos de registro amperométrico. Para a resposta reversível das células, incubar novamente as células durante 10 minutos numa solução tampão isotónica. Estimule as células aplicando um pulso de injeção de bário e realize três minutos de registro da resposta exocitótica.

Para fabricar os eletrodos para medições de tamanho quântico vesicular, prepare um eletrodo de fibra de carbono com um diâmetro de cinco micrômetros. Sob um microscópio, use um bisturi para cortar a fibra de carbono que está se estendendo para fora da ponta de vidro para que restem apenas 30 a 100 micrômetros. Use uma chama de butano para preparar uma ponta gravada por chama do eletrodo de fibra de carbono.

Para obter uma ponta de eletrodo de formato cilíndrico uniformemente gravada, segure o eletrodo de fibra de carbono de formato cilíndrico enquanto o gira. E coloque a fibra de carbono que se estende do vidro até a borda azul da chama de butano até que a ponta do carbono desenvolva uma cor vermelha. Após o ataque à chama, coloque o eletrodo sob um microscópio para avaliar a ponta do eletrodo.

O tamanho da ponta do eletrodo gravado deve ser de cerca de 50 a 100 nanômetros de diâmetro. Em seguida, insira o microeletrodo de nanoponta cilíndrica na solução epóxi por três minutos, seguido por uma imersão de 15 segundos da ponta do eletrodo na solução de acetona. Isso permite que o epóxi vede o espaço de lacuna potencial entre a fibra de carbono e a parede capilar do gás isolante.

Enquanto a acetona limpa o epóxi da superfície do eletrodo de fibra de carbono gravada. Para curar o epóxi, asse os eletrodos em um forno durante a noite a 100 graus Celsius. Antes de usar, teste a corrente de estado estacionário de cada microeletrodo de fibra de carbono usando voltametria cíclica.

Para experimentos, use apenas eletrodos que exibam uma corrente de platô em torno de 1,5 a 2,5 nanoamperes. Para medições de amperometria intracelular, coloque as células sob o microscópio e use as mesmas configurações experimentais do potenciostato. Evite danos físicos significativos à célula.

Insira o microeletrodo cilíndrico de nanoponta na célula adicionando uma força mecânica suave. Apenas o suficiente para empurrar o eletrodo através da membrana plasmática da célula e para o citoplasma da célula usando um micromanipulador. Após a inserção, e com a membrana celular selada ao redor do eletrodo cilíndrico, inicie o registro amperométrico in-situ na célula viva.

No potencial de oxidação aplicado ao eletrodo, as vesículas adsorvidas à superfície do eletrodo e se rompem estocásticamente. Portanto, não há necessidade de nenhum tipo de estímulo para iniciar esse processo. Para determinar o efeito osmótico no tamanho quântico vesicular, colete as medidas de citometria intracelular de um grupo de células que foram incubadas em tampão isotônico e hipertônico usando a condição experimental.

O efeito da osmolalidade extracelular na atividade de exocitose é apresentado como a frequência de eventos de exocitose quando as células cromafins são estimuladas com solução de bário em condições isotônicas, depois hipertônicas e, finalmente, em isotônicas. Esses dados mostram uma inibição na atividade de exocitose em células que sofrem estresse osmótico e uma recuperação parcial pode ser alcançada após o retorno das células a um ambiente isotônico. O experimento de controle mostra a frequência de eventos de exocitose após três estímulos consecutivos de bário em células cromafins em condições isotônicas.

Isso mostra que a estimulação múltipla de bário dentro do período de tempo usado nesses experimentos está causando uma redução na atividade de exocitose por estimulação celular consecutiva. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar esses métodos analíticos complementares que permitem comparar como as vesículas secretoras e o processo de exocitose são afetados por alterações no ambiente extracelular.