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A microscopia eletrônica de varredura, ou SEM, é uma técnica poderosa usada em química e análise de materiais que usa um feixe de elétrons escaneado para analisar a estrutura da superfície e a composição química de uma amostra.
Os microscópios de luz modernos são limitados pela interação de ondas de luz visíveis com um objeto, chamada difração. A menor distância resolúvel entre dois objetos, ou a resolução lateral, varia dependendo do tamanho do padrão de difração em comparação com o tamanho do objeto. Como resultado, os microscópios de luz têm uma ampliação máxima de até 1.000X e uma resolução lateral de até 200 nm em situações ideais.
O SEM não é limitado pela difração, pois usa um feixe de elétrons em vez de luz. Portanto, um SEM pode atingir ampliações de até um milhão de X com resolução lateral subnanométrica. Além disso, o MEV não se limita a características de imagem apenas no plano focal, como na microscopia de luz. Assim, os objetos fora do plano focal são resolvidos, ao contrário da microscopia de luz, onde aparecem borrados. Isso fornece até 300 vezes mais profundidade de campo com SEM.
Os químicos usam amplamente o SEM para analisar a composição da superfície, estrutura e forma de entidades em nanoescala, como partículas de catalisador.
? Este vídeo descreverá os princípios do instrumento SEM e demonstrará os fundamentos da preparação e operação de amostras SEM no laboratório.
No MEV, as amostras devem ser condutoras para imagens convencionais. Amostras não condutoras são revestidas com uma fina camada de metal, como ouro. As imagens são então geradas pela varredura de um feixe focalizado de elétrons de alta energia em toda a amostra.
O feixe de elétrons usado no MEV é gerado por um canhão de elétrons, equipado com um cátodo de filamento de tungstênio. Os elétrons são impulsionados em direção ao ânodo, na direção da amostra, por um campo elétrico.
O feixe de elétrons é então focado nas lentes do condensador e entra na lente objetiva. A lente objetiva deve ser calibrada pelo usuário para focar o feixe de elétrons em uma posição fixa na amostra. O feixe focalizado é então escaneado através da amostra.
Quando os elétrons primários interagem com a amostra, eles fazem um túnel a uma profundidade que depende da energia do feixe de elétrons. Essa interação com a superfície resulta na emissão de elétrons secundários e retroespalhados, que são então medidos por seus respectivos detectores.
A intensidade do sinal dos elétrons secundários emitidos varia dependendo do ângulo da amostra. As superfícies perpendiculares ao feixe liberam menos elétrons secundários e, portanto, parecem mais escuras. Na borda das superfícies, mais elétrons são liberados e a área parece mais brilhante. Esse fenômeno produz imagens com uma aparência 3D bem definida, como mostrado nesta varredura SEM de amianto.
Em contraste, os elétrons retroespalhados são refletidos na direção oposta do feixe de elétrons. A intensidade de detecção aumenta com o aumento do número atômico da amostra, permitindo a aquisição de informações de composição de uma superfície, como mostrado nesta imagem de retroespalhamento de inclusões no vidro.
Agora que os princípios do instrumento SEM foram delineados, a operação básica de um SEM será demonstrada em laboratório.
Para começar, cubra a amostra colocando-a em um toco de amostra. Certifique-se de que a amostra está completamente seca e desgaseificada. Se necessário, pode-se usar fita de carbono condutora de dupla face para colar a amostra ao topo. Coloque a amostra em um sistema de pulverização catódica. Pulverize alguns nanômetros de ouro na amostra. A espessura da camada de ouro varia dependendo se o revestimento interfere na morfologia da amostra.
Remova a amostra do sistema de pulverização catódica. Certifique-se de que haja uma ponte condutora da superfície da amostra para o topo de metal.
Uma vez que a amostra tenha sido revestida, ela está pronta para ser fotografada. Para fazer isso, primeiro ventile a câmara de amostra SEM e deixe a câmara atingir a pressão nominal.
Abra o compartimento de amostra do SEM e remova o estágio de amostra. Coloque o stub no sample stage e aperte o stub no lugar.
Se a distância entre a lente e a amostra, chamada de distância de trabalho, não puder ser controlada pelo software, certifique-se de que a platina e o stub tenham a altura adequada para obter uma imagem.
Coloque o estágio de amostra na câmara de amostra e feche o compartimento.
Ligue as bombas de vácuo e deixe o sistema bombear.
Para começar a criar imagens, abra o software SEM. Selecione a tensão de operação desejada variando de 1?30 kV. Com materiais de alta densidade, tensões de aceleração mais altas devem ser usadas. Selecione baixa tensão de aceleração para materiais de baixa densidade.
A maioria dos softwares SEM inclui um recurso de foco automático. Isso adquirirá um foco da amostra para usar como ponto de partida.
Defina a ampliação para o nível mínimo de zoom de 50X.
O SEM possui diferentes modos de verificação, como verificação rápida e verificação lenta. O modo de verificação mais rápido fornece uma taxa de atualização mais rápida da tela com qualidade inferior. Selecione o modo de varredura rápida para começar, a fim de encontrar a amostra e iniciar o foco grosseiro.
Ajuste o foco do curso até que a imagem fique mais nítida. Em seguida, ajuste o posicionamento do palco para que a região de interesse possa ser vista na tela.
Primeiro, foque na ampliação mais baixa usando o foco grosso. Em seguida, aumente o nível de ampliação até que o recurso desejado seja observado. Ajuste o foco do curso para focar aproximadamente a imagem nessa ampliação. Se necessário, ajuste um foco grosso quando a ampliação aumentar.
Em seguida, ajuste o foco fino para melhorar ainda mais a imagem. Repita essas etapas de foco sempre que a ampliação for aumentada.
Distorções assimétricas do feixe podem causar desfoque da imagem, chamado astigmatismo, mesmo quando a amostra está bem focada. Para diminuir esse efeito, aumente a ampliação para o nível máximo e foque a imagem usando o foco fino. Em seguida, ajuste a estigmatização nas direções x e y para remodelar o feixe.
Continue ajustando as configurações de foco e estigmatização até que a imagem esteja o mais focada possível no nível de ampliação aumentado.
Em seguida, retorne ao nível de ampliação desejado.
A imagem SEM pode ser adquirida no modo "foto lenta" ou "foto rápida". O modo "foto rápida" cria uma imagem de qualidade inferior, mas é adquirida mais rapidamente. O modo "foto lenta" cria uma imagem de maior qualidade, mas pode saturar a superfície com elétrons.
Para medir recursos na imagem capturada, utilize as ferramentas de medição do software.
A maioria dos instrumentos inclui opções de medição, como comprimento, área e ângulo.
Para determinar o comprimento, selecione a distância a ser medida na imagem SEM. Clique na imagem para criar os pontos de referência que serão analisados pelo software.
Quando terminar, desligue o SEM de acordo com as diretrizes do fabricante.
A microscopia eletrônica de varredura é usada para obter imagens de uma ampla gama de amostras.
O SEM pode ser usado para obter imagens de materiais complexos e altamente estruturados, como uma membrana de fibra de carbono.
A amostra apresentou um alto grau de porosidade e estrutura tridimensional; uma propriedade altamente desejável para aplicações como catálise.
O SEM também pode ser usado para obter imagens de amostras biológicas, como bactérias. Neste exemplo, os apêndices semelhantes a cabelos, ou pili, de bactérias intestinais foram fotografados com SEM.
Helicobacter pylori foi cultivado em placas de ágar sangue e a bactéria semeada em lamínulas de vidro.
Amostras totalmente secas foram montadas e revestidas com 5 nm de paládio-ouro para tornar a amostra condutora.
Finalmente, a amostra foi fotografada usando SEM. H. pylori eram facilmente visíveis, com pili mensurável em nanoescala.
Este exemplo descreve como o tecido cerebral pode ser incorporado em uma resina estável e, em seguida, fotografado em três dimensões usando um feixe de íons focalizado e SEM.
Primeiro, o tecido cerebral foi fixado e incorporado em resina. Em seguida, a região de interesse identificada e cortada com um micrótomo.
A amostra foi então inserida no microscópio eletrônico de varredura por feixe de íons focalizado para imagens tridimensionais. O feixe de íons focalizado foi então usado para remover sequencialmente camadas finas da amostra. Cada camada foi fotografada antes da remoção usando SEM de retroespalhamento.
Você acabou de assistir à introdução de JoVE à microscopia eletrônica de varredura. Agora você deve entender os princípios operacionais básicos do SEM e como preparar e analisar uma amostra de SEM.
Obrigado por assistir!
