Caracterização de extensões da membrana celular e estudando seus papéis na dinâmica de adesão celular câncer
26 de março de 2018
Este estudo demonstra a utilidade e a facilidade de medição de extensão quantitativa da membrana celular e sua correlação com capacidade adesiva de células. Como um exemplo representativo, mostramos aqui essa proteína relacionada ao Dickkopf 3 (DKK3) promove aumento lobopodia formação e aderência de célula em carcinoma adrenocortical em vitrode células.
O objetivo geral é determinar o efeito de alterações experimentais no repertório de extensão celular e como isso se relaciona com a função de adesão celular no câncer. Este método pode ajudar a identificar os principais papéis do repertório de extensão da membrana celular na modulação do comportamento celular, como adesão, motilidade e invasão celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela é relativamente simples de executar e pode ser facilmente adaptada a várias condições experimentais.
As implicações dessa técnica se estendem à nossa terapia ou diagnóstico de cânceres localmente avançados ou metastáticos, pois ajuda a quantificar com precisão as mudanças no repertório de extensão celular associadas a alterações nas células tumorais nas capacidades adesivas e invasivas. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como a regulação do canal iônico, que é conhecida por desempenhar um papel importante na formação da extensão celular e nos processos fisiológicos normais. A demonstração visual e o registro desse método são críticos, pois a contagem das etapas de extensão celular é difícil de aprender devido às sutilezas de sua aparência às vezes.
Um dia antes da imagem, conte as células SW 13, SW Neo e SW DKK3 cultivadas em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e cinco por cento usando um hemocitômetro. Coloque lamínulas de vidro estéreis em poços individuais de três placas de seis poços. Use uma placa separada para cada linha celular e coloque as três linhas celulares com uma densidade de 5.000 células por poço nessas placas de seis poços.
Coloque as células em uma incubadora a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, de cada poço aspirar o meio de crescimento. Em seguida, lave as células em um mililitro de PBS quente.
Posteriormente, adicione um mililitro de formaldeído a 3,7% em cada poço para fixar as células. Deixe as células no fixador por 10 minutos. Após a fixação, aspire o formaldeído.
Adicione um mililitro de violeta cristal a 0,05% em cada poço para corar as células por 30 minutos. Em seguida, limpe o excesso de mancha lavando as células com um mililitro de água deionizada por poço três vezes. Em seguida, coloque uma gota de reagente de montagem transparente em uma lâmina de vidro rotulada.
Em seguida, usando uma pinça de ponta fina, recupere suavemente as lamínulas e coloque-as voltadas para baixo sobre os reagentes de montagem. Depois de montar todas as lamínulas coradas nas lâminas, sob um microscópio óptico, escolha 20 visualizações aleatórias de células não sobrepostas de cada lamínula. Tire micrografias fotográficas de 400 de ampliação de força para cada campo de visão.
Em seguida, observe e conte o número de tipos de extensão em cada uma das 20 células representativas. Use as definições e o protocolo de texto para orientar sua classificação da extensão da membrana como filopódio, lobopódios ou lamellipodia. Ao contar pela primeira vez os tipos de extensão de célula, pode ser útil manter uma imagem de referência disponível para revisão.
Se possível, a contagem cega em relação às suas amostras experimentais fornecerá objetividade adicional. Determinar o número médio de extensões de cada tipo por célula em cada uma das três linhagens celulares examinadas. Use uma anova de sentido único para testar a diferença na porcentagem média de extensões de membrana celular entre os diferentes tipos de células é estatisticamente significativa.
Um dia antes do ensaio, usando um hemocitômetro, conte as células SW 13, SW Neo e SW DKK3. Plaquear essas células com densidade de 100.000 células por poço em seis placas de poços usando uma placa para cada um dos seis pontos de tempo designados que serão testados. Coloque as células em uma incubadora a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono durante a noite.
No dia seguinte, remova a placa da incubadora e lave as células uma vez com PBS quente. Em seguida, adicione 0,5 mililitro de solução de dissociação celular não enzimática de força única em cada poço. Agite suavemente as placas para espalhar uniformemente a solução adicionada.
Incube as placas com a solução por tempos definidos. Aspirar a placa designada no final de cada ponto de tempo. Logo após cada aspiração, lave as células com um mililitro de PBS quente.
Em seguida, bata suavemente na placa para soltar as células frouxamente presas. Repita a lavagem junto com o batimento intermitente mais duas vezes. Finalmente, aspire qualquer PBS restante e fixe as células que permaneceram na placa com um mililitro de formaldeído a 3,7%.
Após a fixação, aspire o formaldeído. Em seguida, adicione um mililitro de violeta cristal a 0,05% em cada poço para corar as células. Quando a coloração estiver concluída, limpe o excesso de mancha lavando as células com um mililitro de água deionizada por poço três vezes.
Usando um microscópio óptico com ampliação de 100 forças, conte as células restantes em cada poço para cada placa. Em seguida, determine a porcentagem de células que permaneceram destacadas durante os diferentes pontos de tempo para as três linhagens celulares que foram testadas. Usando uma anova de duas vias, o teste das diferenças e as taxas de descolamento celular entre as três linhagens celulares são estatisticamente significativos.
As células SW 13 e SW Neo de controle coradas com cristal violeta formaram principalmente filopódios e lamellipodia. Em contraste, as células que expressam DKK3 formaram mais lobopódios com ausência quase completa de lamelipódios e muito poucos filopódios. Além disso, observe as diferenças de polaridade entre as células que expressam DKK3 e as linhas celulares de controle.
O gráfico mostra a proporção de diferentes extensões celulares nas três linhagens celulares testadas. Observe a proporção significativamente maior de lobopódios em células que expressam DKK3. Os gráficos de linhas mostram a porcentagem de células que permaneceram presas à placa após o tratamento com a solução de dissociação para os pontos de tempo indicados no eixo X.
Em todos os momentos de até 10 minutos, as células que expressam DKK3 mostraram força de fixação celular significativamente maior em comparação com as células de controle. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um período de um a dois dias, dependendo da configuração experimental, se for executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de avaliar como as mudanças na morfologia da extensão celular afetam a capacidade adesiva.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar com precisão as extensões celulares em relação às mudanças nas características de adesão das células cancerígenas. Boa sorte e obrigado por assistir.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo investiga a relação entre extensões da membrana celular e adesão celular em células cancerígenas. Especificamente, destaca como a proteína relacionada ao Dickkopf 3 (DKK3) potencializa a formação de lobopódios e a adesividade celular em células de carcinoma adrenocortical in vitro.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Biologia celular
- Pesquisa sobre câncer
- Mecanismos de adesão celular
Antecedentes
- As extensões da membrana celular desempenham um papel crucial no comportamento celular.
- Compreender essas extensões pode fornecer insights sobre a motilidade e invasão de células cancerígenas.
- Técnicas de medição quantitativa são essenciais para o estudo do comportamento celular.
- Sabe-se que DKK3 influencia as propriedades de adesão celular.
Objetivo do Estudo
- Avaliar o impacto das extensões da membrana celular na adesão de células cancerígenas.
- Avaliar o papel da DKK3 na promoção da formação de lobopódios.
- Desenvolver um método para quantificar extensão celular e adesão.
Métodos Utilizados
- Medição quantitativa de extensões da membrana celular.
- Experimentos in vitro com células de carcinoma adrenocortical.
- Análise da correlação entre a formação de lobopódios e a adesão celular.
- Demonstrações visuais para auxiliar na compreensão da técnica de medição.
Resultados Principais
- DKK3 aumenta significativamente a formação de lobopódios em células cancerígenas.
- Observou-se adesividade celular aumentada com extensões da membrana mais pronunciadas.
- O método desenvolvido é simples e adaptável a diversas condições experimentais.
- A análise quantitativa auxilia na compreensão do comportamento das células tumorais.
Conclusões
- As extensões da membrana celular são fundamentais para compreender o comportamento das células cancerígenas.
- O DKK3 desempenha um papel significativo na promoção da adesão celular por meio dos lobopódios.
- Essa técnica pode ser aplicada a outras áreas de pesquisa, incluindo a regulação de canais iônicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite que pesquisadores de biofármacos relacionem quantitativamente fenótipos de extensão da membrana celular em células cancerígenas com resultados funcionais de adesão, fornecendo uma leitura mecanicista para a validação de alvos na descoberta de fármacos oncológicos. Ao correlacionar a formação de lobopódios com o aumento da força de adesão celular, o ensaio oferece confiança preditiva na avaliação de moduladores do comportamento celular, como DKK3 ou vias relacionadas. A abordagem oferece uma plataforma escalável e reprodutível para reduzir riscos em hipóteses iniciais sobre mecanismos de metástase e invasão.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Interroga hipóteses terapêuticas ao quantificar como alterações moleculares específicas afetam os repertórios de extensão da membrana associados à adesão e motilidade de células cancerígenas.
- Valor Operacional: Fornece um sistema de classificação cego e objetivo para filopódios, lobopódios e lamelipódios, reduzindo o viés do observador em triagens fenotípicas.
- Valor Preditivo: Permite a redução de riscos mecanicistas ao vincular fenótipos de extensão a ensaios funcionais de adesão, apoiando decisões de seguir ou não seguir adiante na priorização de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Gera saídas padronizadas e quantitativas (contagens de tipos de extensão e porcentagens de adesão) adequadas para fluxos de trabalho de triagem de alto conteúdo.
- Reprodutibilidade: Utiliza protocolos definidos de fixação, coloração e aquisição de imagens para garantir resultados consistentes entre diferentes condições experimentais e pontos temporais.
- Utilidade da Plataforma: Adaptável a diversos modelos de câncer e perturbadores, permitindo reutilização em diferentes projetos de descoberta que visem vias de adesão ou motilidade celular.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela diretamente as capacidades adesivas e invasivas em um sistema in vitro estabelecido para carcinoma adrenocortical, um tipo de câncer clinicamente relevante.
- Continuidade Tradutiva: Conecta perturbações moleculares (por exemplo, expressão de DKK3) a alterações fenotípicas nas extensões da membrana e na adesão funcional, apoiando a validação de alvos alinhada a biomarcadores.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia a tomada de decisões pré-clínicas ao fornecer métricas quantitativas estatisticamente significativas (por meio de ANOVA unidirecional e bidirecional) sobre proporções de extensão e taxas de desprendimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando a validação de alvos por meio de triagem fenotípica e permitindo acompanhamento translacional em modelos pré-clínicos ao associar efetores moleculares a comportamentos relacionados à adesão.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao quantificar como alterações experimentais (por exemplo, superexpressão de DKK3) modificam fenótipos de extensão da membrana e se correlacionam com mudanças funcionais na adesão.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas prontas para ensaios sobre tipos de extensão e força de adesão celular, permitindo avaliação confiável de compostos ou perturbações genéticas.
- Análises: Utiliza testes estatísticos (ANOVA unidirecional para proporções de extensão, ANOVA bidirecional para taxas de desprendimento) para determinar diferenças significativas entre condições, auxiliando a análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta mecanismos moleculares a resultados fenotípicos em um sistema relevante para doenças, apoiando a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Projetada como uma técnica simples e adaptável, aplicável a diversas linhagens celulares e configurações experimentais, promovendo padronização e utilidade entre projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao vincular mecanicamente fenótipos de extensão da membrana à função de adesão de células cancerígenas.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de contagem cega, protocolos de coloração definidos e validação estatística.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção ao reduzir a ambiguidade biológica na avaliação inicial de alvos, aumentando a eficiência do capital.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em dados quantitativos e reprodutíveis que associam efetores moleculares a comportamentos malignos relacionados à adesão.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular, microscopia e classificação morfológica de extensões da membrana.
- Depende de microscopia óptica e equipamento de captura de imagens para visualização em 400x e avaliação de adesão em 100x.
- Necessita padronização entre as equipes para contagem cega e aplicação consistente das definições de extensões (filópodes, lobópodes, lamelipódios).
- As considerações para adaptação incluem variações nas linhagens celulares, tempos de incubação e concentrações da solução de dissociação, mantendo a integridade do protocolo.
- As limitações práticas incluem a subjetividade na classificação das extensões sem treinamento adequado e imagens de referência, conforme observado no material original.
