Detecção visual de vários ácidos nucleicos em uma matriz capilar
November 15th, 2017
Este protocolo descreve a fabricação de uma gaveta pequena, ready-to-use que pode ser aplicada para a detecção visual de vários ácidos nucleicos em um teste único, que é fácil de operar. Nesta abordagem, uma matriz capilar foi usado para multiplex e altamente eficiente detecção de alvos de OGM.
O objetivo geral deste procedimento é fabricar um pequeno e pronto para uso que possa ser aplicado para detecção visual de vários ácidos nucléicos em um único teste fácil de operar. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de detecção de ácidos nucleicos multiplex, como organismos geneticamente modificados ou detecção de OGM. Para limpar os capilares, use uniforme de laboratório, óculos de segurança e luvas de proteção química.
Coloque os capilares em um copo. Limpe os capilares com 30 mililitros de acetona por cinco minutos para remover a matéria orgânica. E então, lave os capilares com água deionizada.
Em seguida, prepare a solução de piranha despejando cerca de dez mililitros de peróxido de hidrogênio no copo. Em seguida, adicione 30 mililitros de ácido sulfúrico ao peróxido de hidrogênio com agitação lenta para evitar superaquecimento. Certifique-se de que a solução cubra completamente os capilares por pelo menos 30 minutos.
Em seguida, lave a solução de piranha com uma grande quantidade de água. Lave os capilares com etanol e água deionizada por cinco minutos cada. Seque os capilares em um forno de secagem.
Em seguida, pese os reagentes de base e engrenagem PDMS com uma proporção de um para um em um tubo de 50 mililitros. Normalmente, misture cinco gramas de base de elastômero com cinco gramas de agente de cura de elastômero. Mexa bem a mistura por cerca de cinco minutos com uma haste de vidro.
Coloque o béquer com o PDMS em uma campânula a vácuo por trinta minutos para desgaseificação. Em seguida, despeje o PDMS lentamente no cilindro do molde de aço inoxidável. Deixe o PDMS curar por três horas em um forno de secagem a 60 graus Celsius.
Após a cura do PDMS, remova o molde puxando o molde com cylindar. Remova o PDMS do cilindro cortando a margem do molde com um bisturi. Lave o PDMS três vezes com etanol e água deionizada.
Em seguida, seque o suporte PDMS com nitrogênio. Trate a superfície inferior do suporte PDMS como hidrofóbica mergulhando o suporte PDMS em uma camada super hidrofóbica por um segundo. Em seguida, seque-o por dez minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, insira os capilares de quatro milímetros limpos nos orifícios do suporte PDMS, deixando cinco milímetros de ponto zero dos capilares fora da superfície superior do suporte PDMS. Certifique-se de que as extremidades dos capilares estejam no mesmo nível. Para tratar a superfície externa dos capilares e a superfície superior do suporte PDMS como hidrofóbica, adicione 15 microlitros da camada super hidrofóbica na superfície do suporte PDMS.
Seque ao ar a matriz capilar modificada super hidrofóbica. Em seguida, adicione um vírgula seis microlitros da mistura de fixação de primer de um conjunto de primers para preencher um capilar correspondente da matriz capilar de acordo com uma ordem pré-projetada. Ancore a matriz em um poço transparente de uma placa padrão de fundo plano de 96 poços e seque a matriz a 60 graus Celsius por pelo menos duas horas.
Para montar o, coloque um adaptador de carregamento na parte superior da matriz ancorada. Certifique-se de que o prato do adaptador cubra apenas as partes expostas de todos os dez capilares. Para preparar a mistura de reação LAMP, adicione reagentes à mistura de acordo com o protocolo de texto e vortex a mistura de reação por cinco segundos após a adição de calcina.
Inverta suavemente o tubo vinte vezes após a adição da Bst polimerase. Os traços de DNA que existem no ambiente podem ser eliminados limpando mais cedo com um mol por litro de ácido clorídrico antes de entregar a mistura LAMP. Aspire 20 microlitros da mistura de reação LAMP com uma ponta padrão de 100 microlitros.
Insira a ponta na entrada do adaptador de carregamento para travá-lo. Injete suavemente a mistura de reação no prato do adaptador. A mistura de reação encherá rapidamente o prato e, em seguida, carregará os capilares automaticamente através da força capilar.
Remova o adaptador com a ponta de trava e sele o poço com um filme de vedação transparente compatível com PCR. Em seguida, incube a matriz capilar em uma incubadora a 63 graus Celsius por uma hora. Para adquirir imagens da emissão de fluorescência, use uma lanterna UV para excitar a calcina dissociada para emitir fluorescência.
Capture imagens da parte superior da matriz capilar por uma câmera digital ou um smartphone. Ao tirar uma imagem, certifique-se de que a câmera esteja ampliada na área dos capilares o máximo possível para obter imagens nítidas e de alta qualidade. Em seguida, abra a imagem por software de análise de imagem.
Em seguida, selecione imagem, molde, tons de cinza, sim e imagem, molde, 16 bits, sim. Selecione arquivo, salvar como, formato, TIFF, para converter a imagem para o formato TIFF de 16 bits. Para extrair o valor da intensidade de fluorescência, abra o software de análise de microarray.
Arraste a imagem no formato TIFF de 16 bits para a interface do software e selecione o comprimento de onda de 532 nanômetros e uma cor verde para exibir a imagem. Em seguida, crie um novo bloco para localizar o sinal de fluorescência dos capilares. Selecione ferramentas, novos blocos e, em seguida, coloque o número de colunas e linhas como um para um e dois para cinco nas interfaces de blocos e recursos separadamente.
Clique com o botão direito do mouse e selecione o modelo de recursos. Em seguida, ajuste a localização e o diâmetro para caber na área de fluorescência dos capilares. Selecione analisar para extrair o valor da intensidade de fluorescência.
Por fim, selecione arquivo, salve as configurações como, para salvar os documentos do bloco. Em seguida, selecione, arquive, salve os resultados para salvar os resultados da intensidade de fluorescência. Aqui é mostrado o layout da matriz capilar.
Capilares de um a oito, prefixados com conjuntos de primers LAMP. Os capilares nove e dez representam dois, sem controles de primer. Aqui é mostrada a fotografia fluorescente para a detecção de milho geneticamente modificado, MON863, onde a cor verde representa a amplificação positiva do LAMP.
Amplificação bem-sucedida, apresentada apenas nos capilares esperados um, seis, sete e oito, sem contaminação entre os capilares em branco. Esta fotografia fluorescente é para a detecção da mistura de OGM. A cor verde apresentou a amplificação positiva do LAMP.
A amplificação bem-sucedida só se apresentou nos capilares esperados um, quatro, cinco, seis, sete e oito sem contaminação entre os capilares em branco. A fotografia fluorescente mostrada aqui é para a detecção de milho não geneticamente modificado, com a cor verde apresentando a amplificação positiva do LAMP. A amplificação bem-sucedida só se apresentou no oito capilar esperado e sem contaminação entre os capilares em branco.
Uma vez dominado, esse procedimento de detecção pode ser feito em um ponto cinco horas se for executado corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar capilares para realizar a detecção de vários ácidos nucleicos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a fabricação de uma pequena cassette pronta para uso para a detecção visual de múltiplos ácidos nucleicos em um único teste fácil de operar. Este método é particularmente útil para detectar organismos geneticamente modificados (OGMs) usando uma matriz capilar para detecção múltipla.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biotecnologia
- Biologia Molecular
- Engenharia Genética
Fundamentos
- A detecção de múltiplos ácidos nucleicos é crucial em vários campos.
- Organismos geneticamente modificados (OGMs) apresentam desafios significativos na segurança alimentar.
- Métodos eficientes de detecção são necessários para análise rápida.
- Matrizes capilares podem melhorar as capacidades de detecção múltipla.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver uma cassette fácil de usar para detecção de ácidos nucleicos.
- Melhorar a eficiência da detecção de OGMs.
- Facilitar a pesquisa em detecção múltipla de ácidos nucleicos.
Métodos Utilizados
- Fabricação de uma pequena cassette para detecção de ácidos nucleicos.
- Uso de matrizes capilares para detecção múltipla.
- Limpeza de capilares com acetona e água desionizada.
- Métodos de detecção visual para facilidade de uso.
Principais Resultados
- A cassette permite a detecção de múltiplos ácidos nucleicos simultaneamente.
- Matrizes capilares aumentam a eficiência do processo de detecção.
- O método é simples e fácil de usar.
- Aplicações potenciais na detecção de OGMs e em outros campos.
Conclusões
- Este protocolo fornece uma abordagem inovadora para detecção de ácidos nucleicos.
- A cassette desenvolvida é eficaz para testes múltiplos.
- Pesquisas futuras podem expandir suas aplicações em biotecnologia.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This platform enables multiplex nucleic acid detection in a single cassette, supporting high-throughput screening needs in GMO testing and microbial monitoring. By combining capillary array technology with LAMP amplification, it reduces assay complexity and resource requirements while maintaining specificity and sensitivity. The visual readout via UV illumination allows rapid, instrument-free results, aligning with decentralized testing demands in biopharma and agricultural biotechnology workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables simultaneous interrogation of multiple genetic targets for hypothesis testing in pathway analysis.
- Operational Value: Reduces reagent consumption and hands-on time through capillary-force-driven sample loading.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized, isolated reaction chambers for reproducible amplification across targets.
- Operational Value: Supports parallel processing of up to eight assays with internal controls for assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates detection of genetically modified elements in complex matrices, supporting GMO safety assessment.
- Operational Value: Enables field-deployable testing with minimal equipment, suitable for process monitoring in biomanufacturing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where rapid nucleic acid profiling informs target selection and assay readiness.
- Discovery Biology: Allows parallel testing of gene variants or constructs to clarify functional roles in biological pathways.
- Screening: Generates quantitative fluorescence intensity data for hit confirmation and cross-capillary comparison.
- Analytics: Outputs enable signal threshold setting and contamination assessment via blank capillary controls.
- Translational Research: Supports continuity from target identification to preclinical validation through consistent nucleic acid readouts.
- Enterprise Reuse: Cassette design allows reuse across multiple nucleic acid panels with reconfiguration of primer sets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in multiplex assays by minimizing cross-talk and false positives.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized capillary preparation and isolated reaction volumes.
- Strategic Value: Reduces time-to-result for critical decision points in GMO detection and microbial monitoring.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on simultaneous multi-parameter readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface treatment and capillary array assembly for hydrophobic/hydrophilic patterning.
- Depends on access to vacuum degassing and thermal curing equipment for PDMS microfluidic fabrication.
- Necessitates standardization of primer fixation protocols across capillary arrays for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending beyond eight targets due to capillary array limitations.
- Relies on user training for consistent UV excitation and image capture to ensure fluorescence quantification accuracy.
