Detecção visual de vários ácidos nucleicos em uma matriz capilar
15 de novembro de 2017
Este protocolo descreve a fabricação de uma gaveta pequena, ready-to-use que pode ser aplicada para a detecção visual de vários ácidos nucleicos em um teste único, que é fácil de operar. Nesta abordagem, uma matriz capilar foi usado para multiplex e altamente eficiente detecção de alvos de OGM.
O objetivo geral deste procedimento é fabricar um pequeno e pronto para uso que possa ser aplicado para detecção visual de vários ácidos nucléicos em um único teste fácil de operar. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de detecção de ácidos nucleicos multiplex, como organismos geneticamente modificados ou detecção de OGM. Para limpar os capilares, use uniforme de laboratório, óculos de segurança e luvas de proteção química.
Coloque os capilares em um copo. Limpe os capilares com 30 mililitros de acetona por cinco minutos para remover a matéria orgânica. E então, lave os capilares com água deionizada.
Em seguida, prepare a solução de piranha despejando cerca de dez mililitros de peróxido de hidrogênio no copo. Em seguida, adicione 30 mililitros de ácido sulfúrico ao peróxido de hidrogênio com agitação lenta para evitar superaquecimento. Certifique-se de que a solução cubra completamente os capilares por pelo menos 30 minutos.
Em seguida, lave a solução de piranha com uma grande quantidade de água. Lave os capilares com etanol e água deionizada por cinco minutos cada. Seque os capilares em um forno de secagem.
Em seguida, pese os reagentes de base e engrenagem PDMS com uma proporção de um para um em um tubo de 50 mililitros. Normalmente, misture cinco gramas de base de elastômero com cinco gramas de agente de cura de elastômero. Mexa bem a mistura por cerca de cinco minutos com uma haste de vidro.
Coloque o béquer com o PDMS em uma campânula a vácuo por trinta minutos para desgaseificação. Em seguida, despeje o PDMS lentamente no cilindro do molde de aço inoxidável. Deixe o PDMS curar por três horas em um forno de secagem a 60 graus Celsius.
Após a cura do PDMS, remova o molde puxando o molde com cylindar. Remova o PDMS do cilindro cortando a margem do molde com um bisturi. Lave o PDMS três vezes com etanol e água deionizada.
Em seguida, seque o suporte PDMS com nitrogênio. Trate a superfície inferior do suporte PDMS como hidrofóbica mergulhando o suporte PDMS em uma camada super hidrofóbica por um segundo. Em seguida, seque-o por dez minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, insira os capilares de quatro milímetros limpos nos orifícios do suporte PDMS, deixando cinco milímetros de ponto zero dos capilares fora da superfície superior do suporte PDMS. Certifique-se de que as extremidades dos capilares estejam no mesmo nível. Para tratar a superfície externa dos capilares e a superfície superior do suporte PDMS como hidrofóbica, adicione 15 microlitros da camada super hidrofóbica na superfície do suporte PDMS.
Seque ao ar a matriz capilar modificada super hidrofóbica. Em seguida, adicione um vírgula seis microlitros da mistura de fixação de primer de um conjunto de primers para preencher um capilar correspondente da matriz capilar de acordo com uma ordem pré-projetada. Ancore a matriz em um poço transparente de uma placa padrão de fundo plano de 96 poços e seque a matriz a 60 graus Celsius por pelo menos duas horas.
Para montar o, coloque um adaptador de carregamento na parte superior da matriz ancorada. Certifique-se de que o prato do adaptador cubra apenas as partes expostas de todos os dez capilares. Para preparar a mistura de reação LAMP, adicione reagentes à mistura de acordo com o protocolo de texto e vortex a mistura de reação por cinco segundos após a adição de calcina.
Inverta suavemente o tubo vinte vezes após a adição da Bst polimerase. Os traços de DNA que existem no ambiente podem ser eliminados limpando mais cedo com um mol por litro de ácido clorídrico antes de entregar a mistura LAMP. Aspire 20 microlitros da mistura de reação LAMP com uma ponta padrão de 100 microlitros.
Insira a ponta na entrada do adaptador de carregamento para travá-lo. Injete suavemente a mistura de reação no prato do adaptador. A mistura de reação encherá rapidamente o prato e, em seguida, carregará os capilares automaticamente através da força capilar.
Remova o adaptador com a ponta de trava e sele o poço com um filme de vedação transparente compatível com PCR. Em seguida, incube a matriz capilar em uma incubadora a 63 graus Celsius por uma hora. Para adquirir imagens da emissão de fluorescência, use uma lanterna UV para excitar a calcina dissociada para emitir fluorescência.
Capture imagens da parte superior da matriz capilar por uma câmera digital ou um smartphone. Ao tirar uma imagem, certifique-se de que a câmera esteja ampliada na área dos capilares o máximo possível para obter imagens nítidas e de alta qualidade. Em seguida, abra a imagem por software de análise de imagem.
Em seguida, selecione imagem, molde, tons de cinza, sim e imagem, molde, 16 bits, sim. Selecione arquivo, salvar como, formato, TIFF, para converter a imagem para o formato TIFF de 16 bits. Para extrair o valor da intensidade de fluorescência, abra o software de análise de microarray.
Arraste a imagem no formato TIFF de 16 bits para a interface do software e selecione o comprimento de onda de 532 nanômetros e uma cor verde para exibir a imagem. Em seguida, crie um novo bloco para localizar o sinal de fluorescência dos capilares. Selecione ferramentas, novos blocos e, em seguida, coloque o número de colunas e linhas como um para um e dois para cinco nas interfaces de blocos e recursos separadamente.
Clique com o botão direito do mouse e selecione o modelo de recursos. Em seguida, ajuste a localização e o diâmetro para caber na área de fluorescência dos capilares. Selecione analisar para extrair o valor da intensidade de fluorescência.
Por fim, selecione arquivo, salve as configurações como, para salvar os documentos do bloco. Em seguida, selecione, arquive, salve os resultados para salvar os resultados da intensidade de fluorescência. Aqui é mostrado o layout da matriz capilar.
Capilares de um a oito, prefixados com conjuntos de primers LAMP. Os capilares nove e dez representam dois, sem controles de primer. Aqui é mostrada a fotografia fluorescente para a detecção de milho geneticamente modificado, MON863, onde a cor verde representa a amplificação positiva do LAMP.
Amplificação bem-sucedida, apresentada apenas nos capilares esperados um, seis, sete e oito, sem contaminação entre os capilares em branco. Esta fotografia fluorescente é para a detecção da mistura de OGM. A cor verde apresentou a amplificação positiva do LAMP.
A amplificação bem-sucedida só se apresentou nos capilares esperados um, quatro, cinco, seis, sete e oito sem contaminação entre os capilares em branco. A fotografia fluorescente mostrada aqui é para a detecção de milho não geneticamente modificado, com a cor verde apresentando a amplificação positiva do LAMP. A amplificação bem-sucedida só se apresentou no oito capilar esperado e sem contaminação entre os capilares em branco.
Uma vez dominado, esse procedimento de detecção pode ser feito em um ponto cinco horas se for executado corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar capilares para realizar a detecção de vários ácidos nucleicos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a fabricação de um pequeno cassete pronto para uso para a detecção visual de múltiplos ácidos nucleicos em um único teste de fácil operação. Este método é particularmente útil para detectar organismos geneticamente modificados (OGMs) utilizando uma matriz capilar para detecção multiplex.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biotecnologia
- Biologia Molecular
- Engenharia Genética
Antecedentes
- A detecção de múltiplos ácidos nucleicos é crucial em diversas áreas.
- Organismos geneticamente modificados (OGMs) representam desafios significativos para a segurança alimentar.
- São necessários métodos de detecção eficientes para análises rápidas.
- Matrizes capilares podem aumentar as capacidades de detecção multiplex.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um cassete de fácil uso para a detecção de ácidos nucleicos.
- Aprimorar a eficiência da detecção de organismos geneticamente modificados.
- Facilitar a pesquisa em detecção multiplex de ácidos nucleicos.
Métodos Utilizados
- Fabricação de um pequeno cassete para detecção de ácidos nucleicos.
- Uso de matrizes de capilares para detecção multiplex.
- Limpeza de capilares com acetona e água deionizada.
- Métodos de detecção visual para facilitar o uso.
Resultados Principais
- A cassete permite a detecção simultânea de múltiplos ácidos nucleicos.
- Matrizes capilares aumentam a eficiência do processo de detecção.
- O método é simples e de fácil utilização.
- Aplicações potenciais na detecção de OGMs e outras áreas.
Conclusões
- Este protocolo oferece uma abordagem inovadora para a detecção de ácidos nucleicos.
- A cartela desenvolvida é eficaz para testes multiplex.
- A pesquisa futura pode expandir suas aplicações na biotecnologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Esta plataforma permite a detecção multiplex de ácidos nucleicos em um único cartucho, atendendo às necessidades de triagem em alta escala em testes de OGM e monitoramento microbiano. Ao combinar a tecnologia de matriz capilar com amplificação LAMP, reduz a complexidade do ensaio e os requisitos de recursos, mantendo especificidade e sensibilidade. A leitura visual por meio de iluminação UV permite resultados rápidos e sem necessidade de instrumentos, alinhando-se às demandas de testes descentralizados em fluxos de trabalho de biotecnologia farmacêutica e agrícola.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação simultânea de múltiplos alvos genéticos para testes de hipóteses na análise de vias.
- Valor Operacional: Reduz o consumo de reagentes e o tempo de manipulação por meio do carregamento de amostras impulsionado pela força capilar.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Fornece câmaras de reação padronizadas e isoladas para amplificação reprodutível entre alvos.
- Valor Operacional: Permite o processamento paralelo de até oito ensaios com controles internos para validação dos ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a detecção de elementos geneticamente modificados em matrizes complexas, apoiando a avaliação de segurança de OGMs.
- Valor Operacional: Permite testes aplicáveis em campo com equipamentos mínimos, adequados para monitoramento de processos na biomanufatura.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere nos fluxos de trabalho de descoberta inicial a pré-clínico, nos quais o perfilamento rápido de ácidos nucleicos orienta a seleção de alvos e a preparação de ensaios.
- Biologia da Descoberta: Permite o teste paralelo de variantes ou construtos gênicos para esclarecer papéis funcionais em vias biológicas.
- Triagem: Gera dados quantitativos de intensidade de fluorescência para confirmação de hits e comparação entre capilares.
- Análises: As saídas permitem o estabelecimento de limiares de sinal e avaliação de contaminação por meio de controles com capilares vazios.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade desde a identificação de alvos até a validação pré-clínica por meio de leituras consistentes de ácidos nucleicos.
- Reutilização Empresarial: O design do cassete permite reutilização em múltiplos painéis de ácidos nucleicos com reconfiguração dos conjuntos de iniciadores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em ensaios multiplex ao minimizar interferência cruzada e resultados falsos positivos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio da padronização da preparação de capilares e de volumes de reação isolados.
- Valor Estratégico: Reduz o tempo até o resultado em pontos críticos de decisão na detecção de OGMs e no monitoramento microbiano.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em leituras simultâneas de múltiplos parâmetros.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em tratamento de superfícies e montagem de matrizes de capilares para padrões hidrofóbicos/hidrofílicos.
- Depende do acesso a equipamentos de dessurgência a vácuo e cura térmica para a fabricação de microfluídica em PDMS.
- Necessita padronização dos protocolos de fixação de iniciadores entre as matrizes de capilares para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação ao estender além de oito alvos, devido às limitações da matriz de capilares.
- Depende do treinamento do usuário para excitação com UV e captura de imagens consistentes, garantindo a precisão na quantificação da fluorescência.
