Imobilização local-dirigido da Proteína morfogenética óssea 2 para superfícies sólidas pela química do clique

O objetivo geral deste estudo é a produção robusta e reprodutível de um andaime osteogênico por acoplamento covalente e direcionado ao local de uma variante BMP2 recém-projetada por química de clique. Este método pode ajudar a superar problemas relacionados com técnicas comumente usadas para o tratamento da não cicatrização de defeitos de ossos longos. Os métodos de absorção ou encapsulamento requerem quantidades superfisiológicas de BMP2 que provocam vários efeitos colaterais graves.

A principal vantagem dessa técnica é usar quantidades menores da nova variante BMP2 projetada sendo covalentemente ligada a andaimes de maneira direcionada lateralmente. Propague uma única colônia durante a noite em 50 mililitros de meio LB com 50 microgramas por mililitro de canamicina e 100 microgramas por mililitro de ampicilina a 37 graus Celsius. Dilua as culturas noturnas de um a 20 em 800 mililitros de meio de caldo fantástico suplementado com 50 microgramas por mililitro de canamicina e 100 microgramas por mililitro de ampicilina.

Cultive as culturas a 37 graus Celsius até que uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,7 seja alcançada. Em seguida, adicione propofol L-Licina a uma concentração final de 10 milimolares. Induzir a expressão gênica pela adição de IPTG para uma concentração final de um milimolar.

Cultive a cultura a 37 graus Celsius por 16 horas em um agitador orbital a 180 RPM. Após a incubação, centrifugar toda a cultura a 9 000 vezes g durante 30 minutos. Rejeitar o sobrenadante e voltar a suspender o sedimento bacteriano em 30 mililitros de tampão TBSE.

Pesar um copo de centrifugação vazio e transferir o sedimento ressuspenso para o copo vazio. Em seguida, centrifugue o sedimento ressuspenso a 6.360 vezes g durante 20 minutos. Rejeitar o sobrenadante e pesar o copo com o sedimento.

Subtraia o peso do copo vazio para calcular o peso do pellet. Em seguida, ressuspenda o pellet no tampão STE. Use 200 mililitros de tampão STE para cada 10 gramas de pellet.

Sonicar a suspensão sobre gelo antes de centrifugar a 6.360 vezes g durante 20 minutos. Rejeitar o sobrenadante e pesar o sedimento. Depois de repetir as etapas de sonicação e centrifugação quatro vezes, ressuspenda o pellet em 100 mililitros de tampão TBS.

Centrifugar a 6.360 vezes g durante 20 minutos. Em seguida, rejeitar o sobrenadante e pesar o sedimento. Ressuspenda o pellet em tampão nuclease com nuclease recém-adicionada usando 10 mililitros por grama de pellet.

Incubar a suspensão durante a noite à temperatura ambiente numa placa de agitação a 30 RPM. No dia seguinte, adicione o Triton Buffer à suspensão. O volume do Triton Buffer a ser adicionado corresponde a uma parte de 0,5 volume da suspensão.

Depois de incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente, centrifugar a suspensão a 6.360 vezes g durante 20 minutos. Rejeitar o sobrenadante e pesar o sedimento. Em seguida, ressuspenda o pellet no TE Buffer usando oito mililitros por grama de pellet.

Depois de centrifugar como antes, rejeitar o sobrenadante e pesar o sedimento. Agora ressuspenda o pellet adicionando quatro mililitros por grama de 25 milimolares de acetato de sódio, PH5, e cinco mililitros por grama de seis molares de cloreto de guanidínio com um milimolar de DTT. Incube a suspensão durante a noite a quatro graus Celsius em uma placa de agitação.

Após centrifugação a 75.500 vezes g durante 20 minutos, o sobrenadante contém a proteína BMP2 monomérica desdobrada. Recolher o sobrenadante e concentrar este extracto a uma densidade óptica por mililitro de 20, utilizando uma membrana de corte de peso molecular de três kilodalton numa célula concentrada. Adicione os monômeros concentrados em gotas únicas ao tampão de renaturação enquanto agita.

Em seguida, incubar a solução à temperatura ambiente durante 120 horas na escuridão. Ajuste o pH da solução para 3,0 usando ácido clorídrico concentrado antes de dialisar a solução contra um ácido clorídrico milimolar. Concentrar a solução dialisada utilizando uma membrana de corte de 10 quilodalton de peso molecular numa célula concentradora.

Em seguida, coloque a solução de proteína na coluna equilibrada, dilua as frações usando um gradiente linear de tampão B, coletando duas frações de mililitro. Analise 20 microlitros de cada fração por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS seguida de coloração Coomassie Brilliant Blue para determinar as frações contendo monômeros e as frações contendo dímeros. Em seguida, puxe o dímero contendo frações.

Dialisar a reserva de dímero contendo frações durante a noite a quatro graus Celsius contra cinco litros de ácido clorídrico milimolar. Concentre o produto usando uma unidade de filtro centrífugo concentrador de 10 kilodalton antes de analisar o produto final por SDS-PAGE e coloração Coomassie Brilliant Blue. Combine 20 micromolares do tipo BMP2-K3Plk ou BMP2-while, que é usado como controle negativo, com 20 microlitros de grânulos de agarose ativados por azida no tampão de reação a um volume total de 500 microlitros.

Incubar durante duas horas à temperatura ambiente numa mistura rotativa a 20 RPM. Pare a reação adicionando uma concentração final de cinco EDTA milimolares. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 15 minutos num misturador rotativo a 20 RPM.

Em seguida, centrifugar as amostras a 20 000 vezes g durante um minuto à temperatura ambiente e recolher os sobrenadantes. Em seguida, lave o pellet contendo as esferas com 1.000 microlitros de HBS 500 Buffer. Centrifugar a amostra a 20 000 vezes g durante um minuto à temperatura ambiente e recolher o sobrenadante.

Repita este procedimento de lavagem mais duas vezes com HBS 500 Buffer, três vezes com cloreto de magnésio quatro molares e duas vezes com PBS, coletando o sobrenadante a cada vez. Armazene os grânulos acoplados em 1.000 microlitros de PBS a quatro graus Celsius. Execute o ensaio ALP conforme descrito no protocolo de texto.

Para realizar a coloração ALP, cultive células C2C12 promioblásticas em DMEM com 10% de soro fetal de bezerro, bem como 100 unidades por mililitro de penicilina G e estreptomicina a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada a 5% de dióxido de carbono. Alimente as células C2C12 a uma densidade de 30.000 células por poço em uma microplaca de 96 poços. Depois de deixar as células se ligarem durante a noite, remova o meio e adicione 20 microlitros por poço de contas acopladas PMB2-K3PLK.

Em seguida, adicione 20 microlitros de agarose de baixo ponto de fusão a 0,4% em cada poço. Centrifugue a microplaca de 96 poços a 2.000 vezes g por cinco minutos a 20 graus Celsius. Em seguida, adicione 80 microlitros do mesmo meio.

Incube a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada a 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Após a incubação, remova o meio tomando cuidado para não destacar a 0,4% de agarose solidificada. Adicione 100 microlitros por poço de uma solução sub-reta MBT-BCIP de uma etapa.

Analise a coloração de fosfatidato alcalino usando microscopia de luz imediatamente após a coloração roxa se tornar aparente. Use microscopia de campo claro e tire fotos. A bioatividade da variante BMP2-K3Plk recém-produzida é validada pela indução da expressão gênica da fosfatase alcalina em células C2C12.

O teste in vitro mostra níveis semelhantes de expressão gênica da fosfatase alcalina induzidos por BMP2 ou BMP2-K3Plk. Grânulos revestidos com BMP2-K3Plk via adição de ciclo-alcino de azida catalisada por cobertura produziram fluorescentes quando incubados com o eco-domínio do receptor BMP 1A dimarcado. A ligação do receptor BMP 1A ao BMP2-K3Plk confirma a retenção da bioatividade após o acoplamento.

A bioatividade dos grânulos funcionalizados BMP2-K3Plk foi comprovada por coloração mediada por ALP. A coloração ocorreu apenas nas células que estavam em contato direto com os grânulos funcionalizados BMP2-K3Pck, confirmando que a proteína está de fato ligada covalentemente aos grânulos e não apenas absorvida. Se a proteína fosse liberada na situação absorvida, uma coloração mais espalhada em distâncias maiores teria sido observada, como visto aqui para a coloração de fosfatase alcalina após o tratamento com BMP2-K2Plk solúvel.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar e produzir proteínas biologicamente ativas por expansão genética e como acoplar covalentemente uma proteína fictícia a microesferas por reação química de clique. A geração de variância proteica por expansão genética permite, em princípio, a introdução de aminoácidos artificiais em qualquer posição da sequência primária de proteínas. A introdução de uma mutação na sequência BMP2 pode afetar a eficiência de redobramento e também pode alterar os parâmetros da proteína.

A produção de BMP2-K3Plk exigiu uma modificação do método estabelecido para a expressão do tipo while BMP2. A BMP2-K3Plk produzida apresentou atividade biológica comparável à da proteína do tipo while. Nossa abordagem para acoplar covalentemente a variante BMP2 a um grânulo de agarose fictício azire por química de clique pode ser realizada com alta eficiência, resultando em grânulos fictícios, figurando uma diferenciação genética in vitro.

Deve ser assegurada uma protecção normalizada de acordo com as boas práticas de laboratório.