Name: Imobilização local-dirigido da Proteína morfogenética óssea 2 para superfícies sólidas pela química do clique (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a imobilizar BMP2 em suportes ósseos usando química do clique para promover osteogênese com doses reduzidas. Este método covalente direcionado minimiza efeitos colaterais e melhora a eficácia no reparo de fraturas não consolidadas.

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Os autores agradecer Dr. M. Rubini (Constança) fornecendo o plasmídeo codificação pyrrolysyl-tRNA e fornecer o correspondente aminoacil-tRNA sintetase de codificação pRSFduet-pyrtRNAsynth.

1. produção da variante BMP2 BMP2-K3Plk
<ol><li>Clonagem de BMP2-K3Plk por mutagenesis local-dirigido usando PCR 12<ol>
<li>Amplificar o humano BMP2 maduro (hmBMP2) de um vetor de p25N-hmBMP2 (ver Tabela de materiais) com um primer para a frente (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') e um primer reverso (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') introduzindo um âmbar stop códon ( TAG) na posição da primeira lisina de BMP2´s parte madura. Realizar a reação de PCR usando 33,5 µ l de H2O, 10 µ l da mistura de reação de PCR, 1,5 µ l de 10 µM dNTP solução, 1,5 µ l de primer para a frente (10 pmol / µ l), 1,5 µ l de primer reverso (10 pmol / µ l), 1 µ l de p25N-hmBMP2 (10 ng / µ l) e 1 µ l de DNA polimerase (ver Tabela de materiais) em um termociclador (desnaturação a 95 ° C por 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 1 min, recozimento a 60 ° C por 1 min, alongamento a 72 ° C por 1 min e uma extensão final a 72 ° C por 10 min).</li>
		<li>Purificar o produto do PCR usando um kit disponível comercialmente, seguindo as recomendações do fabricante (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Digerir o produto PCR com a enzima de restrição NdeI a 37 ° C por 45 min usando 16 µ l de H2O, 3 µ l de tampão de digestão, 10 µ l de DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l da enzima de restrição. Calor-inativar a enzima a 65 ° C por 5 min. digerir o produto PCR com a enzima de restrição BamHI a 37 ° C, durante 1 h, usando 16 µ l de H2O, 3 µ l de tampão de digestão, 10 µ l de DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l da enzima de restrição. Calor-inativar enzimas a 80 ° C por 5 min.</li>
		<li>Digerir o vetor de pET11a-pyrtRNA com NdeI a 37 ° C por 2 horas e 45 minutos usando 16 µ l de H2O, 3 µ l de tampão de digestão, 10 µ l de DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l da enzima de restrição. Calor-inativar a 65 ° C por 5 min. digerir o vetor de pET11a-pyrtRNA com BamHI a 37 ° C, durante 1 h, usando 16 µ l de H2O, 3 µ l de tampão de digestão, 10 µ l de DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l da enzima de restrição. Calor-inativar a 80 ° C por 5 min.</li>
		<li>Separar o vetor digerido do vetor não digerido e restos de digestão por agarose gel eletroforese (agarose 0,8%, 60 min a 100 V). Ligate a inserção BMP2-K3TAG digerida com backbone digerido pET11a-pyrtRNA à temperatura ambiente (RT) para 2 h, usando 100 ng de pET11a-pyrtRNA espinha dorsal e 34,5 ng da inserção BMP2-K3TAG (razão molar de 1:3). A mistura de reação contém a espinha dorsal de DNA e inserção, 2 µ l de tampão de ligase, 1 µ l de DNA ligase e H2O para um volume total de 20 µ l.</li>
		<li>Execute uma transformação co de pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk e pyrtRNAsynth-pSRF-dueto em bactérias BL21(DE3):<ol>
<li>Adicionar 50 ng do cada do plasmídeo para as bactérias, coloque a mistura no gelo por 30 min, choque térmico a 42 ° C para 50 s, colocar no gelo por 5 min, adicione 500 µ l de caldo de lisogenia (LB) médio na mistura e agitar a 300 rpm para 60 min.</li>
			<li>Espalhar a 100 µ l da mistura bacteriana em pré-aquecido canamicina (50 µ g/mL) / placas de ampicilina (100 µ g/mL) e incubar durante uma noite a 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Expressão e purificação de BMP2-K3Plk 13 , 14<ol>
<li>Propagar uma única colônia durante a noite em 50 mL de meio LB com 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilina a 37 ° C.</li>
		<li>Diluir uma noite culturas 01:20 em 800 mL de meio de caldo fantástico (TB), suplementado com 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilina e cresce a 37 ° C, até que seja alcançada uma OD600 de 0,7. Adicione propargil-L-lisina para uma concentração final de 10 mM. Recolha uma amostra de 100 µ l da cultura antes da indução (IPTG) de β-D-1-thiogalactopyranoside isopropílico.</li>
		<li>Induzi a expressão do gene através da adição de IPTG para uma concentração final de 1 mM. Cresce a cultura a 37 ° C durante 16 h em um agitador orbital a 180 rpm. Recolha uma amostra de 100 µ l da cultura.</li>
		<li>Centrifugar a cultura toda a 9000 x g durante 30 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado bacteriano em 30 mL de tampão TBSE (10 mM Tris, 150 mM NaCl, ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) com 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoetanol (recém adicionado). Atenção: Lidar com 2-Mercaptoetanol sob a coifa. Evite contato com pele e olhos. Evite a inalação do vapor ou névoa. Execute todas as etapas de ressuspensão com buffers contendo 2-Mercaptoetanol sob a coifa.</li>
		<li>Pesar um copo vazio centrifugar e transferir ressuspenso para o copo vazio. Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar o béquer com a pelota. Subtrai o peso do copo vazio para calcular o peso do sedimento. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Congele a pelota a-20 º C a curto prazo ou a-80 ° C, a longo prazo. Após retomar o protocolo, descongelar a pelota no RT</li>
		<li>Resuspenda o pellet em buffer STE (1 mM EDTA, sacarose 375 mM, pH de 10 mM Tris 8.0; 150 mM NaCl; 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoetanol (recém adicionado)). 200 mL de tampão STE de uso para cada 10g de pelota.</li>
		<li>Proceda à sonicação a suspensão no gelo (10 min com 40 pulso s, freio de s 20 e 30% de amplitude). Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar a pelota. Repita as etapas sonication e centrifugação 4 vezes.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 100 mL de tampão TBS (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar da pelota.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em buffer nuclease (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) com recém adicionado nuclease 80 U/mL (por exemplo, Benzonase) usando 10 mL/g de pelota. Incube durante a noite a suspensão de RT em uma placa de agita (30 rpm).</li>
		<li>Adicionar o buffer de Triton (60 mM EDTA, 1,5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietileno glicol) para a suspensão. O volume de reserva de Triton para adicionar corresponde a uma parte de volume de 0,5 da suspensão. Incube durante 10 minutos a RT (sem agitação). Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar a pelota.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em tampão TE (100 mM Tris, 20 mM de EDTA) usando 8 mL/g de pelota. Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar a pelota.</li>
		<li>Resuspenda o pellet adicionando 4 mL/g de pH de NaAc 25mm 5.0 e 5 mL/g de 6 M GuCl com 1 mM ditiotreitol (DTT) (recém adicionado). Incube a suspensão durante a noite a 4 ° C, em uma placa de agita (30 rpm).</li>
		<li>Centrifugar a 75.500 x g por 20 min. O sobrenadante agora contém a proteína monomérica desdobrada do BMP2. Recolha o sobrenadante e concentrar-neste extrato para OD/20ml usando uma membrana de corte (MWCO) de peso molecular de 3 kDa em uma concentração de células (veja a Tabela de materiais).</li>
		<li>Adicione os monómeros concentrados em única gotas para o buffer de renaturalização (2m LiCl, 50 mM Tris, caps de 25 mM, 5 mM EDTA, dissulfeto de glutationa 1mm (GSSG), 2mm glutationa (GSH)) agitando (30 rpm). Incube a RT por 120 h no escuro. Nota: Durante este período de incubação, reenovelamento occours. A solução desta etapa em diante contém o dobrado dimérica BMP2-K3Plk.</li>
		<li>Ajuste o pH da solução a 3.0 usando concentrado HCl. Dialyze a solução contra 1mm. HCl concentrado a solução dializada usando uma membrana de corte (MWCO) de peso molecular de 10 kDa em uma célula de concentração.</li>
		<li>Equilibrar a solução adicionando reserva um (20mm NaAc, 30% de isopropanol). Adicione um volume de tampão A corresponde a um volume de 30% da solução. Centrifugue a solução a 4700 x g, durante 15 min.</li>
		<li>Equilibrar a coluna de troca iônica em um sistema cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida15 com 150 mL de tampão r. Load solução da proteína para a coluna equilibrada. Eluir frações usando um gradiente linear de buffer B (20mm NaAc, 30% de isopropanol, 2 M NaCl) com 100 mL de frações de mL de tampão B. coletar 2. Nota: Concentre a proteína antes do embarque para a coluna de acordo com o volume total da coluna. O volume final da proteína deve ser < 5% do volume total da coluna.</li>
		<li>Analise 20 µ l de cada fração por SDS poliacrilamida (12%) gel de eletroforese (SDS-PAGE) 16 e de coloração azul brilhante de Coomassie17 (ver Tabela de materiais). Nota: O azul Coomassie brilhante manchado fracções de espectáculos de gel de SDS-PAGE contendo dímeros (26 kDa) e frações contendo monômeros (13 kDa).</li>
		<li>Fracções de dímero-contendo piscina. Dialize da piscina do dímero contendo frações durante a noite a 4 ° C, contra 1 mM HCl (volume de 5 litros). Concentre-se no produto final usando um kDa 10 unidade de filtro centrífugo de concentração (ver Tabela de materiais). Analise o produto final por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (12%) (SDS-PAGE) e coloração azul de Coomassie brilhante. Nota: A banda sobre o azul Coomassie brilhante manchado de SDS-PAGE gel deve mostrar apenas uma banda em 26 kDa. Este é o produto final da BMP2-K3Plk.</li>
	</ol></li>
</ol>2. otimização de cobre (I)-catalisada Alkyne-azida condições de cicloadição (CuAAC)
<ol><li>Efeito de ascorbato de sódio (NaAsc) e sulfato de cobre (II) (CuSO 4 ) no tipo selvagem BMP2 (BMP2-WT)<ol>
<li>Incubar a 20 µM BMP2-WT com diferentes proporções de NaAsc de CuSO4. Usar NaAsc de 0.5 mM e 0,5 mM CuSO4 (concentração de partida) em um volume de 50 µ l. Prossiga com as seguintes proporções de NaAsc de CuSO4: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), mantendo a CuSO4 concentração constante de 0,5 mM e ajustando a concentração de NaAsc adequadamente. Realizar a reação em H2O em um misturador rotativo (20 rpm) durante a noite no RT</li>
		<li>Preparar amostras reduzidas pela adição de tampão de carregamento contendo 5% 2-Mercaptoetanol e incubar a amostra a 95 ° C por 6 min. Analyze reduzido e amostras não-reduzida por SDS poliacrilamida gel (12%) eletroforese (SDS-PAGE) e coloração azul de Coomassie brilhante. O Coomasie manchado geles de SDS-PAGE mostrar bandas na faixa de 13 kDa (condições reduzidas) para 26 kDa e maior peso molecular (condições não-reduzida).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Efeito de Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amina (THPTA) sobre a reação de CuAAC
	<ol>
<li>Incubar a 20 µM BMP2-K3Plk com diferentes proporções de THPTA de CuSO4. Use 5 mM NaAsc e 200 µM 3-Azido-7-Hidroxicumarina (manter NaAsc e 3-Azido-7-Hidroxicumarina constante). Use 50 µM THPTA e 0,5 mM de CuSO4 como concentrações de partida. Usar diferentes rácios de THPTA de CuSO4: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). realizar reação em H2O (volume total de 50 µ l) por 24 h no RT em um misturador rotativo (20 rpm).</li>
		<li>Em cima de acoplamento, 3-Azido-7-Hidroxicumarina torna-se um corante fluorescente. Preparar amostras em condições reduzidas e não reduzida e analisá-los por SDS-PAGE. Visualizar os géis sob o canal da excitação com o comprimento de onda específico para o 3-Azido-7-Hidroxicumarina (λabs = 404 nm; λem = 477 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ligações covalentes acoplamento técnica da BMP2-K3Plk de azida acrescida de Agarose Beads
<ol><li>Incube 20 µM de BMP2-K3Plk ou BMP2-WT (usado como controlo negativo) com 20 µ l de grânulos de agarose azida-ativado em um volume total de 500 µ l no amortecedor da reação (0,1 M HEPES pH 7.0, ureia de 3,9 M, 50 µM CuSO4, 250 µM THPTA, ascorbato de sódio de 5 mM) por 2 h em RT em um rotati misturador de ng (20 rpm). Pare a reação adicionando 5 mM EDTA (concentração final).</li>
	<li>Incube a RT por 15 min em um misturador rotativo (20 rpm). Centrifugar as amostras a 20.000 x g por 1 min a RT. recolher os sobrenadantes.</li>
	<li>Lave o sedimento contendo os grânulos três vezes com 1.000 µ l de tampão de500 HBS (50 mM HEPES, 500 mM de NaCl), três vezes com 1.000 µ l de 4m MgCl2e duas vezes com 1.000 µ l de soro de tampão fosfato (PBS). Em cada etapa de lavagem, centrifugar a 20.000 x g por 1 min em RT e coletar sobrenadantes. Grânulos de armazenamento acoplado em 1.000 µ l de PBS a 4 ° C. Cuidado: Não perturbe a pelota do grânulo ao remover o sobrenadante.</li>
</ol>4. validando a presença e a atividade biológica do imobilizado BMP2-K3Plk usando vermelho Texas rotulado BMP Receptor eu um ectodomínio (BMPR-IA CE )
<ol><li>Incubar a 50 µ l dos grânulos BMP2-K3Plk acrescida com 1 µM de Texas Red rotulada BMPR-IACE com 150 µ l de tampão de500 HBS (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) no RT para 1 h em um misturador rotativo (20 rpm).</li>
	<li>Centrifugue os grânulos a 20.000 x g por 1 min em RT. descartar o sobrenadante. Lave os grânulos com 1000 µ l de tampão de500 HBS. Repita a etapa de lavagem adicional 3 vezes. Centrifugar 20.000 x g por 1 min em RT após cada etapa de lavagem.</li>
	<li>Resuspenda os grânulos em 500 µ l de PBS e Pipetar 50 µ l em um slide de tampa de vidro. Defina o filtro de microscópio entre 561 ou 594 nm. Detectar o Texas Red – BMPR-IACE-BMP2-K3Plk acrescida grânulos usando fluorescente microscopia e tirar fotos.</li>
</ol>5. medição da fosfatase alcalina (FAL ou ALP) expressão para provar a bioatividade In Vitro da BMP2-K3Plk produzido antes e após a reação de acoplamento.
<ol><li>
Ensaio de fosfatase alcalina (FAL ou ALP)
	<ol>
<li>Cultura de células de C2C12 de promyoblastic (ATCC CRL-172) no meio modificado águia de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro Fetal de bezerro (FCS), 100 U/mL penicilina G e estreptomicina 100 µ g/mL a 37 ° C numa atmosfera umidificada no 5% CO2.</li>
		<li>Sementes C2C12 de células em uma densidade de 3 × 104 células/poço em uma microplaca de 96 poços. Deixe células anexar durante a noite. Remover médio e incubar as células C2C12 na presença de 0.5-200 nM de BMP2-WT ou BMP2-K3Plk em 100 µ l/poço de DMEM (FCS 2%, penicilina de U/mL 100 G e 100 µ g/mL Estreptomicina) a 37 ° C numa atmosfera umidificada em 5% de CO2 por 72 h.</li>
		<li>Remover médio e lavam-se células com 100 µ l de PBS por bem. Lyse pilhas no RT por 1h com 100 µ l/poço de lise (1% NP-40, glicina 0,1 M, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1mm ZnCl2) em um tremendo da placa (220 rpm).</li>
		<li>Adicione 100 µ l/poço de buffer de ALP (glicina 0,1 M, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1mm ZnCl2) com 1 mg/mL p-nitrofenilfosfato (recém adicionado) para o lisado celular.</li>
		<li>Medir a absorção no 405 nm em um leitor multiplate depois de adicionar o buffer ALP e cada 5 min até que o desenvolvimento da cor é completo. Gerar curvas dose-resposta e valores CE50 usando um modelo logístico, y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/x0)p).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloração da fosfatase alcalina (FAL ou ALP)
	<ol>
<li>Cultura de células de C2C12 de promyoblastic (ATCC CRL-172) em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com 10% de soro Fetal de bezerro (FCS), 100 U/mL penicilina G e estreptomicina 100 µ g/mL a 37 ° C numa atmosfera umidificada no 5% CO2.</li>
		<li>Sementes C2C12 de células em uma densidade de 3 × 104 células/poço em uma microplaca de 96 poços. Deixe células anexar durante a noite. Médio de remover e adicionar 20 µ l/poço de grânulos BMP2-K3Plk acoplado. BMP2-K3Plk acoplado grânulos estão em 1000 µ l de uma suspensão de PBS.</li>
		<li>Prepare uma solução de agarose de baixo ponto de fusão de 0,4% em DMEM. Derreter no microondas (600 W por 3 min) e deixe arrefecer no banho-maria a 37 ° C até o uso.</li>
		<li>Adicione 20 µ l de agarose de baixo ponto de fusão de 0,4% em cada poço (coberta de grânulos e células). Centrifugação a 2000 x g por 5 min a 20 ° C. Adicione 80 µ l DMEM (FCS 2%, 100 U/mL penicilina G e 100 estreptomicina µ g/mL) e incubar a 37 ° C numa atmosfera umidificada em 5% de CO2 por 72 h.</li>
		<li>Remova médio, tomando cuidado para não destacar o agarose solidificado de 0,4%. Adicionar 100 µ l/poço de 1 passo NBT/solução de substrato BCIP (cloreto de tetrazólio Nitro-azul, sal 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidina).</li>
		<li>Analise a fosfatase alcalina coloração usando microscopia de luz, imediatamente após a coloração roxa torna-se aparente. Usar microscopia de campo claro e tirar fotos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Alborzinia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetics+analysis+of+BMP2+uptake+into+cells+and+its+modulation+by+BMP+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).</li>
<li>Paarmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+endocytosis+of+Bone+Morphogenetic+Protein2+%28BMP2%29+and+its+receptors+is+dispensable+for+the+initiation+of+Smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling.</a> Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).</li>
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</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Gerar variantes da proteína marcados pela expansão de códon genético permite a introdução de vários análogos de aminoácidos não naturais principalmente em qualquer posição da sequência primária da proteína. Em caso de BMPs como BMP2, comum tags como uma marca de 6-histidina (dele) só pode ser introduzido N-terminal, desde o fim de protein´s C-terminal é enterrado dentro da estrutura terciária da proteína e, portanto, não é acessível a partir do exterior. Em outras posições, o tamanho da marca introduziu muito provavelmen...

O objetivo final da regeneração óssea tecido engenharia e osso é superar as desvantagens e limitações ocorrem durante tratamentos comuns de fraturas não-sindicalizados. Auto - ou allo-transplantes são utilizados predominantemente como estratégias de terapia atual, mesmo que ambos têm várias desvantagens. O enxerto ósseo ideal deve induzir osteogênese, osteoindução, bem como osteocondução, levando-à osteointegração do enxerto no osso. Hoje em dia, apenas autotransplante é considerado como o "padrão ouro" uma vez que fornece todas as características de um enxerto ideal. Infelizmente, ele também apresenta importantes aspectos negativos, tais como tempos de cirurgias longas e um segundo local de trauma que normalmente implica mais complicações (por exemplo, dor crônica, formações de hematoma, infecções, defeitos cosméticos, etc.). Enxerto alogênico, por outro lado tem características ideais para todos os aspectos gerais1. Tecnologias de enxerto de osso alternativos foram melhoradas nos últimos anos, com o objectivo de produzir andaimes osteoindutora, osteocondutora, biocompatível, e biorreabsorvível. Desde que muitos biomateriais não mostram todas estas características osteogênicas, diferentes fatores de crescimento, principalmente BMP2 e BMP7, foram incorporadas a fim de melhorar o potencial osteogênico do andaime particular2.
Como um critério essencial, tais sistemas de entrega de fator de crescimento deve fornecer uma liberação de dose controlada ao longo do tempo a fim de facilitar os eventos essenciais como recrutamento celular e acessório, crescimento celular e angiogênese. No entanto, BMPs, bem como outros fatores de crescimento osteogênicos têm sido comumente imobilizada não ligado covalentemente3. Uma armadilha e adsorção técnicas requerem o uso de montantes suprafisiológica da proteína devido a uma liberação de surto inicial, que leva a graves desvantagens em vivo, normalmente afetar os tecidos circunvizinhos através da indução de supercrescimento ósseo, osteólise, inchaço e inflamação4. Assim, a retenção de fatores de crescimento no local da entrega por longos períodos de tempo pode ser alcançada por métodos de imobilização covalente. Quimicamente modificados BMP2 (succinylated5, acetilado6 ou biotinilado7), engenharia de heterodímeros8ou BMP2 derivada oligopeptídeos9 foram concebidos e usados para superar as limitações relacionadas com a absorção. No entanto, a bio-atividade dessas construções não é previsível, desde que o arranjo potencialmente inibe a ligação do ligante imobilizado aos receptores celulares. Como mostrada anteriormente, é essencial que todos os quatro cadeias receptores envolvidas na formação de complexos receptor-ligante ativado interagirem com o imobilizado BMP2 para ativar completamente toda a jusante de cascatas de sinalização10.
Para superar os problemas de um resultado de produto não-homogênea, com limitações em termos de bioatividade, estabilidade e biodisponibilidade do factor de imobilizado, nós projetamos uma variante BMP capaz de ligar covalentemente andaimes de forma local-dirigido. Esta variante, denominado BMP2-K3Plk, é composto por um aminoácido artificial que foi introduzido pelo códon genético expansão11. Esta variante tem sido associada com êxito a andaimes usando uma estratégia de acoplamento covalente, mantendo sua atividade biológica.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Passo NBT/BCIP</td><td>Thermo Fisher</td><td>34042</td><td>Adicione solução às células</td></tr><tr><td>3-Azido-7-hidroxicumarina</td><td>BaseClick</td><td>BCFA-047-1</td><td>Produto químico usado para reação de clique</td></tr><tr><td>Agarose baixo ponto de fusão</td><td>Biozym</td><td>840101</td><td>Agarose para ensaio ALP&nbsp;</td></tr><tr><td>Grânulos de agarose azida</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-1038-2</td><td>Grânulos usados para reação</td></tr><tr><td>BamHI (enzima de digestão rápida)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0054</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>de restrição Receptor BMP IA (BMP-IAEC)</td><td>--</td><td>--</td> <td>Produzido em nosso laboratório</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20279</td><td>Produto químico usado para Coomassie Coloração azul brilhante de SDS PAGE</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II) anidro (CuSO4)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13986</td><td>Produto químico usado para reação de clique</td></tr><tr><td>DNA Polimerase e tampão de reação&nbsp;</td><td>Kapabiosystems</td><td>KK2102</td><td>KAPA HiFi Kit de PCR</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM) GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td>Meio de cultura celular</td></tr> ácido <tr><td>etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>E5134-1kg</td><td>Produto químico usado para parar a reação de clique</td></tr><tr><td>Isopropil &szlig;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2316.5</td><td>Indução de bactérias (concentração final de 1mM)&nbsp;</td></tr><tr><td>NdeI (enzima de digestão rápida)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0581</td><td>Enzima de restrição</td></tr><tr>Texas Red <td>Life technologies</td> ativada<td>por NHS</td><td>T6134</td><td>Acoplado ao receptor</td></tr><tr><td>P- Nitrofenil Fosfato</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>N4645-1G</td><td>Fosfatase Alcalina</td></tr><tr><td>p25N-hmBMP2&nbsp;</td><td>--</td><td>--</td> <td>Plasmídeo gentilmente fornecido por Walter Sebald para J. Nickel</td></tr><tr><td>pET11a-pyrtRNA</td> <td>--</td><td>--</td> <td>Fornecido pela Cátedra de Farmácia e Biofarmácia, Universidade de Wuerzburg</td></tr><tr><td>propargyl-L-lisina (Plk)</td> <td>--</td><td>--</td> <td>Fornecido pela Cátedra de Farmácia e Biofarmácia, Universidade de Wuerzburg</td></tr><tr><td>pSRFduet-pyrtRNAsynth</td> <td>--</td><td>--</td><td>Fornecido pela Cátedra de Farmácia e Biofarmácia, Universidade de Wuerzburg</td></tr><tr><td>Kit de Extração de Gel Qiagen Qiagen</td><td></td><td>28704</td><td>Kit</td></tr> de <tr><td>Purificação de Gel Qiagen Kit de Purificação de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Purificação de PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>L-ascorbato de sódio</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>A7631-100G</td><td>Produto químico usado para reação de clique</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoScientific</td><td>EL0011</td><td>Ligação&nbsp;</td></tr><tr><td>tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (THPTA)</td><td>BaseClick</td><td>BCMI-006-100</td><td>Produto químico usado para reação de clique</td></tr><tr><td>4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>X100-1L</td><td>Triton X 100&nbsp;</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon célula concentradora 400 ml&nbsp;</td>Unidade de <td>Concentração</td> <td>Merck KGaA</td><td>UFSC40001</td></tr><tr><td>Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 Unidade</td><td>Centrífuga de Concentração</td> <td>Merck KGaA</td><td>UFC901024</td> Unidade</tr><tr><td>&Auml; KTA avant FPLC&</td><td>Auml; KTA-</td><td>-</td><td>Máquina FPLC</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>393124</td><td>Centrífuga para cultura bacteriana</td></tr><tr><td>Incubadora de agitação bacteriana</td><td>Infors HT</td><td></td><td>Incubadora de agitação para cultura bacteriana</td></tr><tr><td>FluorChem Q system</td><td>proteinsimple</td><td>--</td><td>Sistema de imagem e análise para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Fluorescente miscroscópio</td><td>Keyence</td><td>BZ-9000 (BIOREVO)</td><td></td></tr><tr><td>Fractogel&reg; EMD SO3- (M)</td><td>Merck KGaA</td><td>116882</td> Material da <td>coluna de cromatografia por troca iônica</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&reg; &nbsp; Placas de 96 poços</td><td>Sigma</td><td>M5811-40EA</td><td>Placas de 96 poços para cultura de células (ALP Assay)</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td>ThermoScientific</td><td>--</td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>M-20 Microplate Rotor de balde oscilante</td><td>ThermoScientific</td><td>75003624</td><td>Rotor para Microcentrífuga para placa durante a coloração ALP</td></tr><tr><td>Microcentrífuga - 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>--</td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>OriginPro 9.1 G&nbsp;</td><td>OriginLab</td><td>--</td><td>software para análise estática de dados de ensaio ALP</td></tr><tr><td>Lâminas de Polisina</td> Lâminas <td>de</td><td>microscópio</td>10143265 <td>ThermoScientific</td></tr><tr><td>Rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>--</td><td>rotor para centrífuga Avanti J-26XP</td></tr><tr><td>Rotor JLA 8.1</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>--</td><td>rotor para centrífuga Avanti J-26XP</td></tr><tr><td>Rotor JA 25.50</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>--</td><td>rotor para centrífuga Avanti J-26XP</td></tr><tr><td>Tecan infinite M200 leitor multiplaca</td><td>Tecan Deutschland GmbH</td><td>--</td><td>leitor multiplaca para termociclador de ensaio ALP</td></tr><tr><td>- Labcycler Gradient</td><td>SensoQuest GmbH</td><td>--</td><td>PCR</td></tr><tr><td>TxRed - filtro de microscópio</td><td>Filtro Keyence</td><td></td><td>para microscópio fluorescente&nbsp;</td></tr><tr><td>Discos de celulose regenerada por ultrafiltração 3 kDa</td><td>Merck KGaA</td><td>PLBC04310</td><td>usado com célula de concentração de amicon 400ml</td></tr><tr><td>Discos de celulose regenerada de ultrafiltração 10 kDa</td><td>Merck KGaA</td><td>PLGC04310</td><td>usado com célula de concentração de amicon 400ml</td></tr></tbody></table>

imobilização local-dirigido da proteína morfogenética óssea 2 para superfícies sólidas pela química do clique

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Diferentes estratégias terapêuticas para o tratamento de não-cura ossos longos defeitos foram intensamente investigadas. Atualmente usado tratamentos presentes várias limitações que conduziram ao uso de biomateriais em combinação com fatores de crescimento osteogênicos, tais como proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs). Métodos comumente usados de absorção ou encapsulamento requerem quantidades supra fisiológicos de BMP2, geralmente resultando em um efeito de lançamento do chamado surto inicial que provoca vários graves efeitos colaterais. Uma estratégia possível para superar esses problemas seria casal covalentemente a proteína para o cadafalso. Além disso, acoplamento deve ser realizado de forma específica a fim de garantir um resultado de produto reprodutível. Por isso, criámos uma variante BMP2, em que um aminoácido artificial (propargil-L-lisina) foi introduzido a parte madura da proteína BMP2 pela expansão de uso de códon (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk foi acoplado ao funcionalizados grânulos através de cobre catalisada azida-alquino cicloadição (CuAAC). A atividade biológica da BMP2-K3Plk acoplado foi comprovada em vitro e a atividade osteogênica dos grânulos BMP2-K3Plk-acrescida foi comprovada em ensaios de célula com base. Os grânulos funcionalizados em contacto com células de C2C12 foram capazes de induzir a expressão de fosfatase alcalina (FAL ou ALP) na proximidade localmente restrita do cordão de. Assim, por esta técnica, funcionalizados andaimes podem ser produzidos que podem desencadear a diferenciação celular, no sentido de uma linhagem osteogênica. Além disso, doses mais baixas de BMP2 são suficientes devido à orientação controlada do local-dirigido BMP2 acoplado. Com este método, BMPs são sempre expostos aos seus receptores na superfície das células na orientação adequada, que não é o caso, se os factores são acoplados através de técnicas de acoplamento non-local-dirigido. O resultado do produto é altamente controlável e, portanto, resulta em materiais com propriedades homogêneas, melhorando sua aplicabilidade para a reparação do tamanho crítico óssea defeitos.

Neste artigo, descrevemos um método para covalentemente acoplar uma nova variante BMP2, BMP2-K3Plk, grânulos de agarose acrescida de azida comercialmente disponíveis (Figura 1). A bioatividade da variante BMP2-K3Plk produzido foi validada pela indução da expressão do gene da fosfatase alcalina (FAL ou ALP) nas células C2C12. O teste in vitro mostra níveis semelhantes de ALP expressão induzidos pelo tipo selvagem BMP2 (BMP2-WT) e BMP2-K3Plk (<strong c...

Biomateriais dopados com 2 de Proteína morfogenética óssea (BMP2) utilizaram-se como uma nova estratégia terapêutica para curar fraturas não-união óssea. Para superar os efeitos secundários resultantes de uma incontrolável liberação do fator, propomos uma nova estratégia para o site-imobilizar diretamente o fator, criando assim materiais com capacidade osteogênica melhorada.

Imobilização local-dirigido da Proteína morfogenética óssea 2 para superfícies sólidas pela química do clique

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

O objetivo geral deste estudo é a produção robusta e reprodutível de um andaime osteogênico por acoplamento covalente e direcionado ao local de uma variante BMP2 recém-projetada por química de clique. Este método pode ajudar a superar problemas relacionados com técnicas comumente usadas para o tratamento da não cicatrização de defeitos de ossos longos. Os métodos de absorção ou encapsulamento requerem quantidades superfisiológicas de BMP2 que provocam vários efeitos colaterais graves.A principal vantagem dessa técnica é usar quantidades menores da nova variante BMP2 projetada sendo covalentemente ligada a andaimes de maneira direcionada lateralmente. Propague uma única colônia durante a noite em 50 mililitros de meio LB com 50 microgramas por mililitro de canamicina e 100 microgramas por mililitro de ampicilina a 37 graus Celsius. Dilua as culturas noturnas de um a 20 em 800 mililitros de meio de caldo fantástico suplementado com 50 microgramas por mililitro de canamicina e 100 microgramas por mililitro de ampicilina.Cultive as culturas a 37 graus Celsius até que uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,7 seja alcançada. Em seguida, adicione propofol L-Licina a uma concentração final de 10 milimolares. Induzir a expressão gênica pela adição de IPTG para uma concentração final de um milimolar.Cultive a cultura a 37 graus Celsius por 16 horas em um agitador orbital a 180 RPM. Após a incubação, centrifugar toda a cultura a 9 000 vezes g durante 30 minutos. Rejeitar o sobrenadante e voltar a suspender o sedimento bacteriano em 30 mililitros de tampão TBSE.Pesar um copo de centrifugação vazio e transferir o sedimento ressuspenso para o copo vazio. Em seguida, centrifugue o sedimento ressuspenso a 6.360 vezes g durante 20 minutos. Rejeitar o sobrenadante e pesar o copo com o sedimento.Subtraia o peso do copo vazio para calcular o peso do pellet. Em seguida, ressuspenda o pellet no tampão STE. Use 200 mililitros de tampão STE para cada 10 gramas de pellet.Sonicar a suspensão sobre gelo antes de centrifugar a 6.360 vezes g durante 20 minutos. Rejeitar o sobrenadante e pesar o sedimento. Depois de repetir as etapas de sonicação e centrifugação quatro vezes, ressuspenda o pellet em 100 mililitros de tampão TBS.Centrifugar a 6.360 vezes g durante 20 minutos. Em seguida, rejeitar o sobrenadante e pesar o sedimento. Ressuspenda o pellet em tampão nuclease com nuclease recém-adicionada usando 10 mililitros por grama de pellet.Incubar a suspensão durante a noite à temperatura ambiente numa placa de agitação a 30 RPM. No dia seguinte, adicione o Triton Buffer à suspensão. O volume do Triton Buffer a ser adicionado corresponde a uma parte de 0,5 volume da suspensão.Depois de incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente, centrifugar a suspensão a 6.360 vezes g durante 20 minutos. Rejeitar o sobrenadante e pesar o sedimento. Em seguida, ressuspenda o pellet no TE Buffer usando oito mililitros por grama de pellet.Depois de centrifugar como antes, rejeitar o sobrenadante e pesar o sedimento. Agora ressuspenda o pellet adicionando quatro mililitros por grama de 25 milimolares de acetato de sódio, PH5, e cinco mililitros por grama de seis molares de cloreto de guanidínio com um milimolar de DTT. Incube a suspensão durante a noite a quatro graus Celsius em uma placa de agitação.Após centrifugação a 75.500 vezes g durante 20 minutos, o sobrenadante contém a proteína BMP2 monomérica desdobrada. Recolher o sobrenadante e concentrar este extracto a uma densidade óptica por mililitro de 20, utilizando uma membrana de corte de peso molecular de três kilodalton numa célula concentrada. Adicione os monômeros concentrados em gotas únicas ao tampão de renaturação enquanto agita.Em seguida, incubar a solução à temperatura ambiente durante 120 horas na escuridão. Ajuste o pH da solução para 3,0 usando ácido clorídrico concentrado antes de dialisar a solução contra um ácido clorídrico milimolar. Concentrar a solução dialisada utilizando uma membrana de corte de 10 quilodalton de peso molecular numa célula concentradora.Em seguida, coloque a solução de proteína na coluna equilibrada, dilua as frações usando um gradiente linear de tampão B, coletando duas frações de mililitro. Analise 20 microlitros de cada fração por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS seguida de coloração Coomassie Brilliant Blue para determinar as frações contendo monômeros e as frações contendo dímeros. Em seguida, puxe o dímero contendo frações.Dialisar a reserva de dímero contendo frações durante a noite a quatro graus Celsius contra cinco litros de ácido clorídrico milimolar. Concentre o produto usando uma unidade de filtro centrífugo concentrador de 10 kilodalton antes de analisar o produto final por SDS-PAGE e coloração Coomassie Brilliant Blue. Combine 20 micromolares do tipo BMP2-K3Plk ou BMP2-while, que é usado como controle negativo, com 20 microlitros de grânulos de agarose ativados por azida no tampão de reação a um volume total de 500 microlitros.Incubar durante duas horas à temperatura ambiente numa mistura rotativa a 20 RPM. Pare a reação adicionando uma concentração final de cinco EDTA milimolares. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 15 minutos num misturador rotativo a 20 RPM.Em seguida, centrifugar as amostras a 20 000 vezes g durante um minuto à temperatura ambiente e recolher os sobrenadantes. Em seguida, lave o pellet contendo as esferas com 1.000 microlitros de HBS 500 Buffer. Centrifugar a amostra a 20 000 vezes g durante um minuto à temperatura ambiente e recolher o sobrenadante.Repita este procedimento de lavagem mais duas vezes com HBS 500 Buffer, três vezes com cloreto de magnésio quatro molares e duas vezes com PBS, coletando o sobrenadante a cada vez. Armazene os grânulos acoplados em 1.000 microlitros de PBS a quatro graus Celsius. Execute o ensaio ALP conforme descrito no protocolo de texto.Para realizar a coloração ALP, cultive células C2C12 promioblásticas em DMEM com 10% de soro fetal de bezerro, bem como 100 unidades por mililitro de penicilina G e estreptomicina a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada a 5% de dióxido de carbono. Alimente as células C2C12 a uma densidade de 30.000 células por poço em uma microplaca de 96 poços. Depois de deixar as células se ligarem durante a noite, remova o meio e adicione 20 microlitros por poço de contas acopladas PMB2-K3PLK.Em seguida, adicione 20 microlitros de agarose de baixo ponto de fusão a 0,4% em cada poço. Centrifugue a microplaca de 96 poços a 2.000 vezes g por cinco minutos a 20 graus Celsius. Em seguida, adicione 80 microlitros do mesmo meio.Incube a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada a 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Após a incubação, remova o meio tomando cuidado para não destacar a 0,4% de agarose solidificada. Adicione 100 microlitros por poço de uma solução sub-reta MBT-BCIP de uma etapa.Analise a coloração de fosfatidato alcalino usando microscopia de luz imediatamente após a coloração roxa se tornar aparente. Use microscopia de campo claro e tire fotos. A bioatividade da variante BMP2-K3Plk recém-produzida é validada pela indução da expressão gênica da fosfatase alcalina em células C2C12.O teste in vitro mostra níveis semelhantes de expressão gênica da fosfatase alcalina induzidos por BMP2 ou BMP2-K3Plk. Grânulos revestidos com BMP2-K3Plk via adição de ciclo-alcino de azida catalisada por cobertura produziram fluorescentes quando incubados com o eco-domínio do receptor BMP 1A dimarcado. A ligação do receptor BMP 1A ao BMP2-K3Plk confirma a retenção da bioatividade após o acoplamento.A bioatividade dos grânulos funcionalizados BMP2-K3Plk foi comprovada por coloração mediada por ALP. A coloração ocorreu apenas nas células que estavam em contato direto com os grânulos funcionalizados BMP2-K3Pck, confirmando que a proteína está de fato ligada covalentemente aos grânulos e não apenas absorvida. Se a proteína fosse liberada na situação absorvida, uma coloração mais espalhada em distâncias maiores teria sido observada, como visto aqui para a coloração de fosfatase alcalina após o tratamento com BMP2-K2Plk solúvel.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar e produzir proteínas biologicamente ativas por expansão genética e como acoplar covalentemente uma proteína fictícia a microesferas por reação química de clique. A geração de variância proteica por expansão genética permite, em princípio, a introdução de aminoácidos artificiais em qualquer posição da sequência primária de proteínas. A introdução de uma mutação na sequência BMP2 pode afetar a eficiência de redobramento e também pode alterar os parâmetros da proteína.A produção de BMP2-K3Plk exigiu uma modificação do método estabelecido para a expressão do tipo while BMP2. A BMP2-K3Plk produzida apresentou atividade biológica comparável à da proteína do tipo while. Nossa abordagem para acoplar covalentemente a variante BMP2 a um grânulo de agarose fictício azire por química de clique pode ser realizada com alta eficiência, resultando em grânulos fictícios, figurando uma diferenciação genética in vitro.Deve ser assegurada uma protecção normalizada de acordo com as boas práticas de laboratório.

site-directed-immobilization-bone-morphogenetic-protein-2-to-solid

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A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem

Substratos de cultura de células funcionalizados com padrões em microescala de ligantes biológicos têm imensa utilidade no campo da engenharia de tecidos. Aqui, demonstramos a fabricação versátil e automatizada de substratos de cultura de tecidos com várias escovas de poli (etilenoglicol) micropadronizadas apresentando químicas ortogonais que permitem a imobilização espacialmente precisa e específica do local de ligantes biológicos.

Fabricando substratos de cultura complexos usando Robotic microcontact Printing (R-μCP) e substituição nucleofílica Sequential

Um processo genérico passo a passo para criar um modelo semelhante a um osso com microcanais projetados é apresentado. As altas capacidades de absorção e retenção do molde são demonstradas pela ação capilar por meio de microcanais.

Modelos distintivo ação capilar por micro-canais em Osso-como pode aumentar o recrutamento de células para a Restauração da Grande Bony Defeito

Complexos polieletrolíticos automontados (PEC) fabricados a partir de heparina e protamina foram depositados em grânulos de alginato para aprisionar e regular a liberação de fatores de crescimento osteogênicos. Essa estratégia de entrega permite uma redução de 20 vezes da dose de BMP-2 em aplicações de fusão espinhal. Este artigo ilustra os benefícios e a fabricação de PECs.

Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio

Neste método, utilizamos a fotopolimerização e técnicas de química clique para criar padrões de proteína ou peptídeo na superfície de hidrogel de polietileno glicol (PEG), fornecendo imobilizada sinais bioativos para o estudo da resposta celular em vitro .

Padronização bioativas proteínas ou peptídeos em hidrogel usando fotoquímica para aplicações biológicas

Descrevemos um procedimento simples de litografia para a imobilização de moléculas de DNA do gene-comprimento sobre uma superfície, que pode ser usada para realizar experiências de expressão do gene sem célula em biochips.

Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

Aqui, apresentamos protocolos para analisar a remodelagem óssea dentro de uma plataforma lab-on-a-chip. Um dispositivo de carregamento mecânico impresso em 3D pode ser emparelhado com a plataforma para induzir a mechanostransdução de osteócitos, deformando a matriz celular. A plataforma também pode ser usada para quantificar os resultados funcionais de remodelação óssea de osteoclastos e osteoblastos (reabsorção/formação).

Uma plataforma lab-on-a-chip para estimular a mecanotransdução de osteócitos e analisar resultados funcionais da remodelagem óssea

Este protocolo descreve uma técnica de impressão 3D para fabricar estruturas semelhantes a ossos, depositando uma tinta de fosfato de cálcio em um suporte granular à base de gelatina. Os análogos ósseos impressos são depositados em forma livre, com flexibilidade para a colheita direta da impressão ou reticulação dentro de uma matriz celular viva para construções multifásicas.

Bioimpressão Cerâmica Omnidirecional em Suspensões Carregadas de Células para a Geração de Análogos Ósseos

Aprenda a imobilizar BMP2 em suportes ósseos usando química do clique para promover osteogênese com doses reduzidas. Este método covalente direcionado minimiza efeitos colaterais e melhora a eficácia no reparo de fraturas não consolidadas.

Imobilização local-dirigido da Proteína morfogenética óssea 2 para superfícies sólidas pela química do clique

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