In Vitro Ensaio de SUMOylation para estudar a atividade de Ligase E3 sumô
29 de janeiro de 2018
Ao contrário da ubiquitina ligases, foram identificados alguns ligases E3 sumô. Este modificado em vitro protocolo SUMOylation é capaz de identificar o romance sumô E3 ligases por um ensaio de reconstituição em vitro .
O objetivo geral deste experimento é verificar uma proteína de interesse que pode ser SUMOilada ou é uma SUMO E3 ligase. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da SUMOilação, como a identificação da ligase SUMO E3. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser utilizada para investigação da especificidade da ligosa SUMO E3 em diferentes formas iso de SUMO.
Demonstrando o procedimento estará Wan-Shan Young, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para purificar a etiqueta K-bZIP, primeiro incube 10 mililitros de lisado celular com 50 microlitros de esferas magnéticas marcadas com anticorpos em um tubo de polipropileno de 14 mililitros. Em seguida, gire o tubo a 50 rotações por minuto a quatro graus Celsius por três horas em um misturador de suspensão.
Uma vez capturada a proteína, centrifugue a amostra a 800 vezes g por 30 segundos a quatro graus Celsius para pellet as contas. Descarte todos, exceto um mililitro de sobrenadante, para ressuspender as contas. E transfira as contas dissolvidas para um tubo de 1,5 mililitro.
Para lavar as proteínas capturadas, coloque o tubo com as esferas em um suporte magnético. Aguarde cerca de três segundos para que os grânulos adiram às paredes laterais do tubo e, em seguida, remova o sobrenadante. Para lavar as contas, adicione um mililitro de tampão de lise no tubo de 1,5 mililitro.
Em seguida, inverta o tubo dez vezes. Em seguida, coloque o tubo de 1,5 mililitro no suporte magnético e remova o sobrenadante assim que as contas aderirem às paredes. Para lavar as contas novamente, adicione um mililitro de solução salina tamponada com fosfato ao tubo de 1,5 mililitro e inverta-o dez vezes.
Em seguida, transfira o tubo para o suporte magnético e remova o sobrenadante assim que as contas estiverem presas às paredes laterais. Para eluir as proteínas marcadas com K-bZIP das esferas magnéticas marcadas com anticorpos, adicione 100 microlitros a 150 microgramas por mililitro de octapeptídeo diluído em solução salina tamponada com fosfato no tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, gire o tubo em um misturador de suspensão a 50 rotações por minuto por dez minutos à temperatura ambiente.
Transfira o tubo para o suporte magnético. E então colete o K-bZIP contendo sobrenadante. Em seguida, para analisar a etiqueta K-bZIP purificada, submeter de um a cinco microlitros da proteína purificada à página SDS, seguida da coloração com azul de Coomassie.
Colocar 0,5, 1 e 2 microgramas de albumina de soro bovino como padrões no gel para quantificar a concentração de K-bZIP. Durante o processamento da imagem na imagem J.Next, dilua o K-bZIP purificado em solução salina tamponada com fosfato. Atingir uma concentração final de 100 nanogramas por microlitro.
E armazene a 80 graus Celsius negativos em pequenas alíquotas. Adicione três microlitros de 100 nanogramas por microlitro de K-bZIP marcado purificado na reação de mistura mestre de SUMOilação in vitro. Em seguida, misture o conteúdo da mistura principal suavemente e incube a 30 graus Celsius por três horas.
Em seguida, adicione 20 microlitros de página SDS 2X com buffer de carregamento para interromper a reação. Em seguida, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos para desnaturar a proteína. Em seguida, carregue 20 microlitros da amostra em um gel de página 10% SDS.
E execute o gel a 80 volts por cerca de 120 minutos até que o corante atinja o fundo do gel. Terminada a eletroparesia, desconecte o aparelho de gel. E transfira o gel em tampão de transferência semi-seco por cinco minutos.
Em seguida, mergulhe a membrana de PVDF em outro recipiente cheio de metanol por um minuto. Remova a membrana de PVDF do metanol e mergulhe em tampão de transferência semi-seco. Em seguida, agite suavemente a membrana por cinco minutos.
Remova a tampa de segurança do aparelho eletroforético semi-seco. Pré-molhe um papel de filtro. E prepare um sanduíche de gel na parte inferior do ânodo de platina.
Depois de prender a placa catódica na tampa de segurança, execute o borrão a 15 volts de corrente constante por 90 minutos. Em seguida, desligue a fonte de alimentação e retire a membrana PVDF após desconectar o aparelho semi-seco. Agora bloqueie a membrana PVDF com tampão de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente em um agitador orbital a 30 rotações por minuto.
Em seguida, hibridize a membrana de PVDF com anticorpo anti-p53 e tampão de bloqueio por 12 a 16 horas a quatro graus Celsius em um misturador de suspensão a 30 rotações por minuto. Em seguida, retire a membrana de PVDF e transfira para um recipiente cheio de solução salina tamponada com Tris 20. Em seguida, mergulhe a membrana de PVDF em solução salina tamponada com Tris 20 por 30 minutos no agitador orbital a 45 rotações por minuto.
Em seguida, hibridizar a membrana de PVDF com anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano diluída em tampão de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente no misturador de suspensão a 30 rotações por minuto. Em seguida, lave a membrana de PVDF com solução salina tamponada com Tris 20 três vezes. Após a lavagem, embeber a membrana de PVDF em solução salina tamponada com Tris 20 durante 30 minutos no misturador de suspensão a 45 rotações por minuto.
Em seguida, substitua a solução salina tamponada com Tris tween 20 por solução salina tamponada com fosfato. Preservar a membrana de PVDF a quatro graus Celsius por até 12 horas. Em seguida, misture os reagentes de substrato quimioluminescente aprimorados um e dois em uma proporção de um para um.
Em seguida, remova a membrana de PVDF da solução salina tamponada com fosfato e seque brevemente com as bolsas de punção para absorver o excesso de umidade. Adicione imediatamente 400 microlitros do reagente quimioluminescente à superfície da membrana e aguarde de três a cinco minutos. Seque brevemente para drenar o excesso de reagente quimioluminescente, evitando que a membrana seque completamente.
Use o sistema de imagem da Luminescente para expor a mancha. Aqui, a análise de immunoblot foi feita para mostrar a concentração da enzima Ubc9 necessária para SUMOilate os alvos de p53. Isso mostra que 1/2 e 1/5 da concentração da enzima Ubc9 podem suficientemente SUMOilato da enzima p53 em um ensaio de SUMOilação in vitro usando os peptídeos SUMO 1 e SUMO 2.
Para analisar o p53 SUMOilado a membrana foi sondada com anticorpo anti-p53. Uma análise imunoblot semelhante foi feita para mostrar que metade da concentração de E1 e 1/10 das enzimas Ubc9 são necessárias para SUMOilate o alvo p53 em um ensaio de SUMOilação in vitro usando os peptídeos SUMO 1, SUMO 2 e SUMO 3. Aqui, a membrana foi corada com Coomassie para mostrar a proteína K-bZIP purificada.
O sistema de expressão de baculovírus foi usado para expressar o K-bZIP purificado, que foi analisado na página SDS com albumina de soro bovino como padrão para comparação. Análises adicionais de immunoblot também foram feitas, mostrando que, ao aumentar a concentração de K-bZIP, catalisa a SUMOilação de p53 na presença de metade da quantidade de E1 e 1/10 da quantidade de enzimas Ubc9, respectivamente. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se for executada corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todo o reagente para o ensaio de SUMOilação in vitro em gelo e fazer a diluição em série em vez de em uma diluição gigante. Encontre este procedimento, outros métodos, como a superexpressão de SUMOlygase, podem ser realizados para verificar a SUMOilação in vitro. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de SUMOilação explorassem mais SUMOlygase e validassem seu poder de especificidade.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como identificar uma ligase SUMO e3 usando um ensaio de simulação in vitro.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo modificado de SUMOilação in vitro projetado para identificar novas ligases SUMO E3. O método permite investigar a especificidade da ligase SUMO E3 em relação a diferentes isoformas de SUMO.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Modificação de Proteínas
Contexto
- A SUMOilação é um processo de modificação pós-traducional.
- Poucas ligases E3 de SUMO foram identificadas em comparação com as ligases de ubiquitina.
- A identificação de ligases E3 de SUMO é crucial para compreender seus papéis biológicos.
- Este estudo tem como objetivo aprimorar os métodos de identificação dessas ligases.
Objetivo do Estudo
- Verificar proteínas que podem ser SUMOiladas ou atuar como ligases E3 de SUMO.
- Responder perguntas fundamentais no campo da SUMOiliação.
- Desenvolver um método para identificar ligases E3 de SUMO.
Métodos Utilizados
- Ensaio de reconstituição in vitro para SUMOilação.
- Purificação da proteína de fusão K-bZIP utilizando esferas magnéticas marcadas com anticorpo.
- Incubação do lisado celular com esferas magnéticas.
- Rotação do tubo em um agitador rotativo a baixa temperatura.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de novas ligases E3 de SUMO.
- Demonstração da eficácia do protocolo em um ambiente de laboratório.
- Informações sobre a especificidade das ligases E3 de SUMO em relação aos isoformas de SUMO.
- Aplicações potenciais em pesquisas futuras sobre SUMOilação.
Conclusões
- O protocolo modificado é uma ferramenta valiosa para a identificação de ligases E3 de SUMO.
- Ele abre caminhos para pesquisas futuras sobre os mecanismos de SUMOilação.
- Estudos adicionais podem expandir o conhecimento sobre a especificidade das ligases E3 de SUMO.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação das ligases E3 de SUMO e sua especificidade de isoforma é essencial para reduzir os riscos na validação de alvos no estágio inicial de descoberta. Este ensaio de reconstituição in vitro permite a investigação mecanicista de vias de sinalização dependentes de SUMO, oferecendo confiança preditiva nos testes de hipóteses terapêuticas. O método fornece uma abordagem padronizada e escalonável para avaliar a atividade da ligase E3, contribuindo diretamente para decisões de identificação de compostos promissores e triagem de portfólio.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite investigar a função das ligases E3 de SUMO e sua especificidade de substrato, esclarecendo mecanismos de sinalização relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Oferece um sistema reconstituído para validar possíveis ligases E3 utilizando componentes purificados, reduzindo falsos positivos decorrentes da complexidade celular.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos em alvos terapêuticos ao demonstrar atividade enzimática direta sobre substratos conhecidos, como p53, em condições definidas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas da conjugação de SUMO entre parálogos de SUMO (SUMO1/2/3) para caracterizar a preferência de isoformas de ligase.
- Valor Operacional: Utiliza condições e controles padronizados de reação (titulação de E1, Ubc9) para garantir reprodutibilidade entre laboratórios e campanhas de triagem.
- Valor de Escalabilidade: Compatível com formatos de 96 poços para avaliação de média escala de bibliotecas de ligase ou variantes mutantes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a atividade da ligase SUMO E3 a desfechos funcionais em modelos de doenças, validando a modificação de substratos fisiopatológicos.
- Valor Operacional: Permite análise estrutura-função de domínios de ligase por meio de mutagênese orientada por estrutura acoplada a leituras de atividade.
- Valor Traducional: Apoia o desenvolvimento de biomarcadores ao confirmar o estado de SUMOilação de alvos em sistemas pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto líder, fornecendo confirmação bioquímica ortogonal do mecanismo antes da triagem celular ou fenotípica.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses terapêuticas ao confirmar a modulação direta da SUMOilação em alvos oncológicos ou neurodegenerativos.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e dependentes de enzimas, adequadas para confirmação de acertos em triagens de moduladores de ligases E3.
- Análises: Mede a formação de conjugados de SUMO por meio de imunoblot, permitindo a comparação da potência da ligase e da seletividade entre isoformas.
- Pesquisa Translacional: Valida o engajamento do alvo em contextos relevantes para doenças, demonstrando a SUMOilação de substratos clinicamente pertinentes.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para caracterização de ligases E3 de SUMO em múltiplos projetos e classes de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na modulação da via SUMO, aumentando a confiança na seleção de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza a avaliação da atividade de ligases E3, melhorando a reprodutibilidade entre laboratórios e a comparabilidade dos dados.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer evidência direta da compatibilidade entre ligase e substrato, reduzindo a eliminação em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de programas direcionados à SUMO com base em dados mecanicistas validados.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em purificação de proteínas, cinética enzimática e detecção por imunoblot.
- Depende do acesso a isoformas purificadas de SUMO, enzimas E1/E2 e proteínas substrato.
- Necessita de tamponamentos padronizados e controle de temperatura para medições consistentes de atividade.
- Envolve a otimização das concentrações de enzima e substrato para evitar sinais não específicos.
- Limita-se à atividade in vitro; o contexto celular e os mecanismos regulatórios exigem validação complementar.
