Name: In Vitro Ensaio de SUMOylation para estudar a atividade de Ligase E3 sumô (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda o ensaio de SUMOilação in vitro para identificar novas ligases E3 SUMO e estudar sua especificidade por isoformas SUMO. Este método avança a pesquisa em modificação de proteínas.

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Este trabalho foi financiado por doações do Ministério da ciência e tecnologia (a maioria, 105-2320-B-010-007-MY3 a PCC), do Instituto Nacional de pesquisa de saúde (INDH-EX105-10215BC, a PCC), do Ministério da ciência e tecnologia (mais 105-2314-B-400-019 para HJK) e do Instituto Nacional de pesquisas saúde (INDH MG-105-SP-10, INDH MG-106-SP-10 para HJK). Este trabalho também foi financiado em parte com a Universidade Nacional de Yang-Ming na publicação do manuscrito para o PCC. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou reparação do manuscrito.

1. preparação de Baculovirus expressão constrói
<ol><li>
Purificar o sumô E3 ligase K-bZIP por clonagem do cDNA de K-bZIP19 em um vetor de baculovirus expressão dual (ver tabela de materiais) com uma epítopo-tag do N-terminal. Temos tido sucesso usando uma marca de Octapeptídeo (indicada em todo o protocolo como vetor-marca-K-bZIP). Nota: O modelo de DNA para clonagem de reação em cadeia (PCR) K-bZIP polimerase é cDNA reverso transcrito de RNA isolado de células de TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 doxiciclina tratamento20a seguir.<ol>
<li>Transferi o longa-metragem de cDNA K-bZIP19 para o vetor de expressão dupla com Cpoeu clonagem de sites. CPO Eu digerir o produto do PCR e 1 µ g do vetor de expressão dual a 37 ° C por 3 h21.</li>
		<li>Separar e extrair o DNA digerido após eletroforese em gel de agarose 0,8%22. Ligate a inserção (K-bZIP) e vector por T4 DNA ligase a 16 ° C por 30 min, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Adicionar 5 µ l de DNA de ligadura a 50 µ l competentes de Escherichia coli células "A" (ver Tabela de materiais) em um tubo de 1,5 mL. Ponha gelo durante 30 min. Em seguida, incubar o tubo de 1,5 mL em um banho de água de 42 ° C durante 45 s e imediatamente colocar o tubo no gelo por 3 min.</li>
		<li>Adicione 600 médio de S.O.C µ l (extrato de levedura 0,5% (p/v), triptona de 2% (p/v), 10 mM de NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM de MgSO4e 4% (p/v) glicose) para dentro do tubo e incubar a 37 ° C, durante 1 h. Em seguida, centrifugar o tubo em temperatura ambiente por 3 min a 600 x g.</li>
		<li>Remover o sobrenadante, resuspenda o pellet com meio de Luria-Bertani 60 µ l (LB; triptona 1% (p/v), 0,5% (p/v) do fermento extrato e 85 mM de NaCl) e distribuídos em placas de ágar LB contendo 100 ampicilina µ g/mL. Incube a placa de ágar a 37 ° C, durante 16 h23,24.</li>
		<li>Selecione 1 colônia para inocular em meio de LB de 5 mL contendo 100 µ g/mL ampicilina e cultura a 37 ° C durante 16 h com 250 rpm a tremer. Em seguida, extrair o plasmídeo, vetor-marca-K-bZIP, por um kit de extração de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gerar o bacmid recombinante, abrigando a marca-K-bZIP pela transformação do vetor-marca-K-bZIP competentes de Escherichia coli células "B" (ver tabela de materiais).
	<ol>
<li>Misture o plasmídeo de vetor-marca-K-bZIP 0,2 µ g e 100 µ l competentes E. células de coli "B" em um tubo de 1,5 mL e colocar no gelo por 30 min. incubam o tubo em banho de água a 42 ° C por 45 s e imediatamente colocar o tubo no gelo por 3 min.</li>
		<li>Adicionar 900 µ l de meio S.O.C no tubo e incubar a 37 ° C por 4 h, com rotação a 50 rpm. Em seguida, tomar 10 µ l do meio, adicionar um adicionais 50 µ l de meio S.O.C para espalhar em placas de ágar LB contendo 50 µ g/mL canamicina, gentamicina 7 de µ g/mL, 10 tetraciclina µ g/mL, substrato de galactosidase 100 µ g/mL e 40 µ g/mL isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ) e incubar as placas por 48 h a 37 ° C.</li>
		<li>Inocule uma colônia branca em 5 mL de meio de LB contendo 50 µ g/mL canamicina, gentamicina 7 de µ g/mL e 10 tetraciclina µ g/mL. Incube a 37 ° C com 250 rpm agitação por 16 h.</li>
		<li>Isolar o bacmid recombinante DNA abrigando a marca-K-bZIP, quantificar e ressuspender em uma concentração de 1 µ g / µ l25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gere baculoviruses recombinante expressando marca-K-bZIP por transfecting, 1 µ g de bacmid recombinante DNA contendo marca-K-bZIP Sf9 células em um poço de uma placa de 6.
	<ol>
<li>Semente de 2 x 106 Sf9 células (ver Tabela de materiais) de 2ml Grace inseto médio fornecido com 10% de soro fetal bovino (FBS) e gentamicina 1% em cada um bem de uma placa bem 6 e, em seguida, incubam a 27 ° C, durante 1 h.</li>
		<li>Manter uma cultura de fase de registo de células Sf9 da Grace inseto médio fornecido com 10% FBS, gentamicina 1% e 1% de detergente C (ver Tabela de materiais) a 27 ° C em suspensão orbital a 140 rpm. Contar as células usando um hemocytometer e mancha azul trypan; viabilidade celular deve exceder 95%. Manter as células usando uma proporção de subcultura de 1:3 a cada 2-3 dias (densidade mínima ~0.5 x 106 células/mL).</li>
		<li>Adicionar 2 µ l bacmid DNA (1 µ g / µ l) e 98 µ l reduzidos meios de soro (ver Tabela de materiais) para um tubo de 2 mL. Em seguida, adicionar o reagente de transfeccao 4 µ l (veja a Tabela de materiais) para o tubo e misture bem. Incube a temperatura ambiente por 15 min.</li>
		<li>Adicione esta mistura de transfeccao (104 µ l) em cada poço e incubar a 27 ° C, durante 12-16 h.</li>
		<li>Remova a mídia exausta com aspiração suave e substitua com 2 mL do meio de inseto da Grace fresca fornecido com Gentamicina FBS e 1% de 10%. As células Sf9 aderem frouxamente a superfície da placa e não será perturbadas com aspiração suave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Depois de transfeccao baculovirus recombinante e amplificam baculovirus para obter alta-título estoques (P1) para novas experiências.
	<ol>
<li>72 h depois de mudar o meio, raspar o Sf9 células usando um levantador de pilha de estéril, recolher o sobrenadante de cada poço individual em um tubo de 1,5 mL e vórtice por 10 s.</li>
		<li>Centrifugar a 4 ° C por 3 min em 150 g. x sobrenadante cobrar como P0 baculovirus e alíquota em tubos de 1,5 mL (1 mL em cada tubo de baculovirus). Loja a-80 ° C.</li>
		<li>Semente de 1 x 107 Sf9 células inseto médio de 10ml Grace fornecido com Gentamicina FBS e 1% de 10% em uma placa de Petri de 10 cm e incuba a 27 ° C, durante 1 h.</li>
		<li>Para a amplificação de baculoviruses recombinante expressando marca-K-bZIP, adicionar 0,5 mL P0 baculovirus às células Sf9 semeadas e incubar a 27 ° C por 48 h.</li>
		<li>Recolha o sobrenadante como P1 baculovirus em uma loja a 4 ° C e o tubo de 15 mL até 1 mês.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificação de K-bZIP
<ol><li>Manter uma cultura de fase de registo de células Sf9 da Grace inseto médio fornecido com 10% FBS, gentamicina 1% e 1% de detergente C a 27 ° C em suspensão orbital a 140 rpm conforme descrito na etapa 1.3.2.</li>
	<li>No dia de transdução, adicione 1 mL do sobrenadante contendo baculovirus (P1) em 250 mL de Sf9 células com uma densidade de 2 x 106 células/mL.</li>
	<li>Incubar as células Sf9 por 72 h a 27 ° C em um agitador orbital com 140 rpm a tremer e, em seguida, recolher por centrifugação a 2.740 x g, durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e lyse pelotas de célula em 10 mL de tampão de lise (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M de NaCl, 1% de detergente um (ver Tabela de materiais), 2% glicerol, coquetel de inibidor de protease) e gira a 50 rpm usando um misturador de suspensão a 4 ° C por 30 min.</li>
	<li>Lisado em 15.000 x g, durante 15 min recolher o sobrenadante celular de centrífuga.</li>
	<li>Para purificar a marca-K-bZIP, incubar os lisados celulares (10 mL) com 50 µ l de anticorpo marcado grânulos magnéticos em tubos de polipropileno de 14 mL e gira a 50 rpm por 3 h a 4 ° C, utilizando um misturador de suspensão. Após a captura de proteína, granular os grânulos em 800 x centrifugação g por 30 s a 4 ° C. Remover a maior parte do sobrenadante, re-suspender os grânulos do volume residual de cerca de 1 mL e transferir para um tubo de 1,5 mL para lavar.</li>
	<li>Lave a proteína capturada, colocando o tubo contendo os grânulos num suporte magnético e remover o sobrenadante, uma vez que os grânulos magnéticos aderiram totalmente ao lado do tubo.</li>
	<li>
Lave os grânulos com Lise quatro vezes.
	<ol>
<li>Adicionar 1 mL de tampão de Lise para tubos de 1,5 mL e inverter os tubos 10 vezes. Coloque o tubo de 1,5 mL num suporte magnético e remover o sobrenadante, conforme descrito em 2.7.</li>
		<li>Repita a etapa anterior outro 3 vezes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lave os grânulos com solução salina tamponada fosfato (PBS) uma vez.
	<ol>
<li>Adicione 1 mL de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8mm Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4) para tubos de 1,5 mL e inverter os tubos 10 vezes.</li>
		<li>Colocar o tubo de 1,5 mL num suporte magnético e em seguida, remover o sobrenadante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluir marca-K-bZIP proteína de grânulos magnéticos anticorpo marcado pela adição de 100 µ l de 150 Octapeptídeo µ g/mL, diluído em PBS em um tubo de 1,5 mL. Gire o tubo por 10 min a 50 rpm pelo misturador de suspensão em temperatura ambiente. Em seguida, coloque o tubo de volta a depor magnético e recolher o sobrenadante contendo K-bZIP em um tubo limpo 1,5 mL.</li>
	<li>Analise a 1-5 µ l purificado marca-K-bZIP proteína por SDS-PAGE seguido de azul de Coomassie coloração26. Carga de 2 µ g, 1 µ g, e 0,5 µ g amostras de albumina de soro bovino (BSA) no mesmo gel e usá-lo para quantificação com um programa de processamento de imagem, como o ImageJ. Estime a concentração de K-bZIP em comparação com os padrões de BSA.</li>
	<li>O K-bZIP purificado está agora pronto para ser usado em cada ensaio de SUMOylation. Diluir o K-bZIP em PBS para uma concentração final de 100 ng / µ l e loja em pequenas alíquotas a-80 ° C.</li>
</ol>3. ensaio de SUMOylation
<ol><li>Adicione 3 µ l de 100 ng / µ l da marca-K-bZIP purificada na mistura mestre de cada em vitro reação SUMOylation. Componentes na mistura mestre contêm tampão de proteína 1 µ l, 1 x buffer de SUMOylation, proteína de p53 0,5 µ l (0,5 mg/mL), 25 nM de E1 enzima de activação (conc. estoque: 1 µM), 50 nM de E2 enzima de conjugação (conc. estoque: 10 µM) e 250 nM cada dos peptides sumô (sumô-1 , Sumô-2, ou SUMO-3; conc. estoque: 5 µM) até um volume final de 17 µ l.</li>
	<li>Misturar o conteúdo suavemente e incubar a reação a 30 ° C por 3 h. pare a reação adicionando 20 µ l de 2x do amortecedor do carregamento SDS-PAGE (pH 100 mM Tris-HCL 6,8, 200mm β-Mercaptoetanol, azul de bromofenol 0,2% (p/v), 20% (v/v) glicerol e 4% de sódio Dodecil sulfato) e Desnature as amostras a 95 ° C por 5 min.</li>
	<li>
Amostras separadas em SDS-PAGE, transferir as proteínas separadas em membrana PVDF usando um aparelho de transferência eletroforética semi-seca e analisar por Western blot utilizando anticorpo anti-p53.
	<ol>
<li>Configurar o aparelho de gel como na etapa 2.11 e carregar 20 µ l de amostra no gel de poços.</li>
		<li>Funcione o gel de 10% em uma constante corrente à 80 V por cerca de 120 min (até a banda de corante atinge a parte inferior do gel). Após a conclusão da electroforese, desligue a fonte de alimentação.</li>
		<li>Desligue o aparelho de gel e gel de fitas para tirar o gel e flutuar o gel em buffer de transferência semi secos (48 mM Tris-HCl, glicina 39 milímetros, 20% metanol) por 5 min.</li>
		<li>Pegue outra vasilha e mergulhe a membrana PVDF em metanol por 1 min. Em seguida, tirar PVDF metanol e colocar no buffer de transferência semi secos. Agite suavemente a membrana por 5 min.</li>
		<li>Remova a tampa de segurança do aparelho eletroforética semi seco.</li>
		<li>Papel de filtro previamente molhado e preparar um sanduíche de gel no ânodo inferior platina como segue: papel de filtro, membrana PVDF, gel e papel de filtro.</li>
		<li>Cobertura de placa e segurança seguro de cátodo, e em seguida fugiu do borrão na corrente de 90 min. vire de 15 constante V fonte de alimentação, desconecte o aparelho semi seco e tirar a membrana PVDF.</li>
		<li>Membrana de PVDF de bloco com tampão de bloqueio (5% leite desnatado no buffer TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, detergente 0,1% B (ver Tabela de materiais), pH 7,6)) à temperatura ambiente durante 1 h com 30 rpm tremendo pelo agitador orbital.</li>
		<li>Cruzar a membrana PVDF com anti-p53 anticorpo diluído (1:1, 000) em tampão de bloqueio para 12-16 h a 4 ° C com agitação de 30 rpm usando um misturador de suspensão.</li>
		<li>Pegue a membrana PVDF em um recipiente e coloque em TBST. Lave a membrana PVDF com TBST mais duas vezes.</li>
		<li>Mergulhe a membrana PVDF no TBST por 30 min com 45 rpm tremendo pelo agitador orbital.</li>
		<li>Cruzar a membrana PVDF com anticoelho anticorpo conjugado com peroxidase de rábano (HRP) diluído (1:4, 000) em tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente com 30 rpm usando um misturador de suspensão a tremer.</li>
		<li>Lave a membrana PVDF com TBST 3 vezes, conforme descrito na etapa 3.4.10.</li>
		<li>Mergulhe a membrana PVDF no TBST por 30 min com 45 rpm agitação usando um misturador de suspensão. Remover TBST e adicionar PBS para preservar a membrana PVDF a 4 ° C por até 12 h.</li>
		<li>Misture o reagente substrato quimioluminescente melhorado (substrato ECL) 1 e 2 (1:1) (ver Tabela de materiais). Retire a membrana PVDF a PBS, borre brevemente com uma toalha de papel ou limpador de ligeiros para absorver o excesso de umidade e imediatamente adicionar 400 µ l de reagente ECL à superfície de cada membrana para remover excesso ECL 3-5min reagente borrando brevemente, mas não permita que o m embrane para completamente seco.</li>
		<li>Expor a mancha usando um sistema de imagem de luminescência ou autoradiografia filme27.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Os autores não divulgar nenhuma potenciais conflitos de interesse.

O em vitro SUMOylation protocolo descrito aqui é rotineiramente utilizado para estabelecer o status SUMOylation de substratos de Ubc9 identificados. A limitação principal usando o protocolo padrão para estudar a função de SUMOylation de sumô E3 ligase é a abundância de ativação de sumô E1 e E2 conjugação enzimas Ubc9 que maximizam a conjugação de sumô em sistemas em vitro . Considerando esse desafio, nós acreditamos que essa titulação da quantidade de enzimas sumô E1 e E2 para o nível que um mal pode de...

Modificação de sumô foi inicialmente identificada como uma modificação pós-traducional reversível (PTM) que regula a proteína estabilidade1. Além de conjugação direta, sumô também pode ser anexado a uma proteína através de interação não-covalente de sumô interação motivos (SIMs)2. Semelhante a vinculação de correntes-fosforilação por moléculas abrigando Src homologia 2 (SH2) ou ligação phosphotyrosine (PTB) domínios3,4, modificação de sumô fornece uma plataforma de interação adicional para seletiva recrutamento de SIM-contendo effector proteínas5,6. Além do Regulamento de transdução de sinal, SUMOylation de fatores transcricionais e cromatina remodelação moléculas servem para modular a expressão de gene7,8. Estudos dos padrões de SUMOylation de todo o genoma revelaram que a modificação de sumô está associada com positivo9,10 ou negativo10,11,12 transcrição Regulamento, em parte devido à especificidade de paralogue de SUMOylation.
Existem três principais isoformas de sumô para proteína, conjugando presente em células de mamíferos; Estes incluem SUMO-1 e altamente homólogos sumô-2 e 3-sumô (referido como SUMO-2/3)13. SUMÔ é normalmente conjugado com o resíduo de lisina (K) dentro do motivo de ψKxD/E consenso na proteína alvo. O cartão SIM no sumô E3 ligases é responsável para a especificidade de paralogue14. Em contraste com os caminhos da ubiquitination contendo centenas de E3 ligases, somente há alguns sumô E3 ligases identificados15. Ligases E3 de sumô são definidos pelas propriedades, incluindo a sua capacidade de (i) ligar Ubc9, (ii) ligar moiety sumô via um domínio SIM e (iii) melhorar a transferência SUMO de Ubc9 em carcaça. Ligase E3 não é absolutamente necessário para sumô conjugação16, mas fornece o substrato e a especificidade de sumô-paralogue. Desde geralmente apenas uma pequena fração da proteína total do substrato é sumô-modificado, detecção de SUMOylated proteínas na vivo é sempre um desafio. Portanto, ensaios precisos e reprodutíveis são necessárias a fim de elucidar a função precisa de modificação de sumô.
O em vitro ensaio de SUMOylation, que avalia a capacidade de Ubc9 purificado para catalisar SUMOylation das proteínas do substrato, é um ensaio bem aceitado para o estudo de modificação de sumô17. No entanto, a atividade de ligase E3 de sumô na maioria dos casos não pode ser detectada ou só pode ser detectada com mutantes ligase do sumô com alta atividade de ligase E3 de sumô e baixa especificidade pelo protocolo padrão devido à presença de uma quantidade abundante de Ubc918 . O sucesso deste teste depende em grande parte à titulação cuidadosa de Ubc9 purificado. O ensaio SUMOylation em vitro descrito aqui é modificado de uma SUMOylation padrão protocolo (consulte Tabela de materiais). A observação de aumento global modificação de sumô durante a reativação de herpesvírus associado sarcoma de Kaposi (KSHV) levou-na identificar o ligase E3 sumô viral que pode ser responsável para a regulação da SUMOylation. Após uma triagem em pequena escala das proteínas de interação de viral sumô E3 ligase do K-bZIP, p53 foi identificado como um substrato de romance. Neste protocolo, mostramos detalhadamente em células de inseto as etapas envolvidas na expressão e purificação do selvagem-tipo K-bZIP, uma ligase E3 sumô viral com especificidade de sumô-2/3. A capacidade do K-bZIP purificado de aumentar SUMOylation de p53, um substrato de sumô bem conhecido, é avaliada na presença de quantidades reduzidas de enzimas E1 e E2. Usando este ensaio SUMOylation modificado, investigadores podem confiantemente definir as habilidades de sumô E3 ligase do SUMOylate romance ou substratos conhecidos, que é uma etapa preliminar no estudo da proteína SUMOylation. Além disso, esse método ajuda a identificar romance sumô E3 ligases com ligase baixa atividade, mas alta especificidade.

<table><tbody><tr><td>pFastBac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>vetor de baculovírus de dupla expressão</td></tr><tr><td>vetor pCR2.1-TOPO vetor</td><td>de produto de PCR</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>célula competente&nbsp; E. coli DH5&alpha;</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYE678-80VL</td><td>competente E. coli células A</td></tr><tr><td>E. coli DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>competente E. coli células B</td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Roche</td><td>04709705001</td><td>reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>meio de soro reduzido</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NOVA INGLATERRA BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>CpoI (RsrII)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0741</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1690</td><td>substrato de galactosidase</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Inseto Médio</td><td>Gibco</td><td>11605094</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0254-20ML</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>caldo Merk</td> 1,10285,0500 do LB de <td>Sigma-Aldrich</td><td>87128-25G</td><td></td>do tetracyclin</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Hepes</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk</td><td>1,04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sódio</td><td>Merk</td><td>1.13760.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (Base)</td><td>J.T.Baker</td><td>4109-06</td><td></td></tr><tr><td>Leite desnatado</td><td>Fonterra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>J.T.Baker</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>detergente A</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-500ML</td><td>detergente B</td></tr><tr><td>Poloxamer 188 solução</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556-100ML</td><td>detergente C</td></tr><tr><td>Inibidor de Protease Cocktail Tablet</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>3x Sinalizador peptídeo</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>contas magnéticas anti-FLAG m2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8823</td><td>contas magnéticas marcadas com anticorpos</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-1 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40120</td><td>protocolo padrão SUMOilação&nbsp;</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40220</td><td>padrão SUMOylation protocol&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit de plasmídeo QIAGEN</td> Kit de <td>extração de plasmídeo</td><td>QIAGEN</td><td>12123</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Petri Plate</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Corning</td><td>CNG3008</td><td></td></tr><tr><td>Ponta de carregamento</td><td>Sorenson BioScience</td><td>28480</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF1002</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro de mata-borrão</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini aparelho de gel de placa (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001 EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Célula de transferência eletroforética semi-seca</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting</td><td>Thermo</td><td>32106</td><td>ECL misturador de suspensão de reagente</td></tr><tr><td></td><td>Digisystem laboratory instruments&nbsp; Inc.</td><td>SM-3000</td><td></td></tr><tr><td>agitador orbital</td><td>Kansin instruments Co.</td><td>OS701</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 imageador biomolecular</td><td>GE Healthcare</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Thermo Scientific</td><td>B82501</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-p53</td><td>Cell Signaling</td><td>#9282</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-coelho</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ensaio de sumoylation para estudar a atividade de ligase e3 sumô

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Modificação de pequenos ubiquitin-como modificador (SUMO) é uma importante modificação pós-traducional (PTM) que medeia a transdução de sinal, principalmente através de interações da proteína-proteína de modulação. Semelhante à modificação da ubiquitina, SUMOylation é dirigido por uma cascata de enzima sequencial incluindo enzima E1-ativando (SAE1/SAE2), enzima E2-conjugação (Ubc9) e E3-ligase (i.e., família de PIAS, RanBP2 e Pc2). No entanto, diferente da ubiquitination, uma ligase E3 é não-essenciais para a reação, mas não fornecem precisão e eficácia para conjugação de sumô. Modificado por SUMOylation de proteínas podem ser identificadas por ensaio na vivo através da imunoprecipitação com anticorpos específicos do substrato e immunoblotting com anticorpos específicos de sumô. No entanto, a demonstração da atividade de ligase E3 sumô proteína requer em vitro reconstituição dos ensaios SUMOylation usando enzimas purificadas, substrato e proteínas de sumô. Desde que nas reações em vitro , geralmente SAE1/SAE2 e Ubc9, só são suficientes para conjugação de sumô, realce de SUMOylation por um putativo ligase E3 nem sempre é fácil de detectar. Aqui, descrevemos um modificado em vitro protocolo de SUMOylation que identifica consistentemente a modificação de sumô usando um sistema em vitro reconstituído. Um protocolo passo a passo para purificar cataliticamente ativo K-bZIP, um viral ligase E3 de sumô-2/3, também é apresentado. As atividades de SUMOylation da K-bZIP purificada são mostradas na p53, um destino bem conhecido do sumô. Este protocolo pode não apenas ser empregado para elucidar o romance sumô E3 ligases, mas também por revelar a sua especificidade de paralog de sumô.

De acordo com as informações fornecidas pelo fabricante, a quantidade padrão de enzima E1 e E2 no ensaio de SUMOylation é de 50 nM e 500 nM, respectivamente. Primeiro, a quantidade mínima de E2, conjugando a enzima Ubc9 que é capaz de SUMOylate p53 foi determinada por um ensaio de SUMOylation em vitro . Tão baixo como um quinto da quantidade de Ubc9 usado no padrão em vitro SUMOylation protocolo de ensaio foi capaz de forma eficiente SUMOylate p53 (F...

Ao contrário da ubiquitina ligases, foram identificados alguns ligases E3 sumô. Este modificado em vitro protocolo SUMOylation é capaz de identificar o romance sumô E3 ligases por um ensaio de reconstituição em vitro .

In Vitro Ensaio de SUMOylation para estudar a atividade de Ligase E3 sumô

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

O objetivo geral deste experimento é verificar uma proteína de interesse que pode ser SUMOilada ou é uma SUMO E3 ligase. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da SUMOilação, como a identificação da ligase SUMO E3. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser utilizada para investigação da especificidade da ligosa SUMO E3 em diferentes formas iso de SUMO.Demonstrando o procedimento estará Wan-Shan Young, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para purificar a etiqueta K-bZIP, primeiro incube 10 mililitros de lisado celular com 50 microlitros de esferas magnéticas marcadas com anticorpos em um tubo de polipropileno de 14 mililitros. Em seguida, gire o tubo a 50 rotações por minuto a quatro graus Celsius por três horas em um misturador de suspensão.Uma vez capturada a proteína, centrifugue a amostra a 800 vezes g por 30 segundos a quatro graus Celsius para pellet as contas. Descarte todos, exceto um mililitro de sobrenadante, para ressuspender as contas. E transfira as contas dissolvidas para um tubo de 1,5 mililitro.Para lavar as proteínas capturadas, coloque o tubo com as esferas em um suporte magnético. Aguarde cerca de três segundos para que os grânulos adiram às paredes laterais do tubo e, em seguida, remova o sobrenadante. Para lavar as contas, adicione um mililitro de tampão de lise no tubo de 1,5 mililitro.Em seguida, inverta o tubo dez vezes. Em seguida, coloque o tubo de 1,5 mililitro no suporte magnético e remova o sobrenadante assim que as contas aderirem às paredes. Para lavar as contas novamente, adicione um mililitro de solução salina tamponada com fosfato ao tubo de 1,5 mililitro e inverta-o dez vezes.Em seguida, transfira o tubo para o suporte magnético e remova o sobrenadante assim que as contas estiverem presas às paredes laterais. Para eluir as proteínas marcadas com K-bZIP das esferas magnéticas marcadas com anticorpos, adicione 100 microlitros a 150 microgramas por mililitro de octapeptídeo diluído em solução salina tamponada com fosfato no tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, gire o tubo em um misturador de suspensão a 50 rotações por minuto por dez minutos à temperatura ambiente.Transfira o tubo para o suporte magnético. E então colete o K-bZIP contendo sobrenadante. Em seguida, para analisar a etiqueta K-bZIP purificada, submeter de um a cinco microlitros da proteína purificada à página SDS, seguida da coloração com azul de Coomassie.Colocar 0,5, 1 e 2 microgramas de albumina de soro bovino como padrões no gel para quantificar a concentração de K-bZIP. Durante o processamento da imagem na imagem J.Next, dilua o K-bZIP purificado em solução salina tamponada com fosfato. Atingir uma concentração final de 100 nanogramas por microlitro.E armazene a 80 graus Celsius negativos em pequenas alíquotas. Adicione três microlitros de 100 nanogramas por microlitro de K-bZIP marcado purificado na reação de mistura mestre de SUMOilação in vitro. Em seguida, misture o conteúdo da mistura principal suavemente e incube a 30 graus Celsius por três horas.Em seguida, adicione 20 microlitros de página SDS 2X com buffer de carregamento para interromper a reação. Em seguida, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos para desnaturar a proteína. Em seguida, carregue 20 microlitros da amostra em um gel de página 10% SDS.E execute o gel a 80 volts por cerca de 120 minutos até que o corante atinja o fundo do gel. Terminada a eletroparesia, desconecte o aparelho de gel. E transfira o gel em tampão de transferência semi-seco por cinco minutos.Em seguida, mergulhe a membrana de PVDF em outro recipiente cheio de metanol por um minuto. Remova a membrana de PVDF do metanol e mergulhe em tampão de transferência semi-seco. Em seguida, agite suavemente a membrana por cinco minutos.Remova a tampa de segurança do aparelho eletroforético semi-seco. Pré-molhe um papel de filtro. E prepare um sanduíche de gel na parte inferior do ânodo de platina.Depois de prender a placa catódica na tampa de segurança, execute o borrão a 15 volts de corrente constante por 90 minutos. Em seguida, desligue a fonte de alimentação e retire a membrana PVDF após desconectar o aparelho semi-seco. Agora bloqueie a membrana PVDF com tampão de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente em um agitador orbital a 30 rotações por minuto.Em seguida, hibridize a membrana de PVDF com anticorpo anti-p53 e tampão de bloqueio por 12 a 16 horas a quatro graus Celsius em um misturador de suspensão a 30 rotações por minuto. Em seguida, retire a membrana de PVDF e transfira para um recipiente cheio de solução salina tamponada com Tris 20. Em seguida, mergulhe a membrana de PVDF em solução salina tamponada com Tris 20 por 30 minutos no agitador orbital a 45 rotações por minuto.Em seguida, hibridizar a membrana de PVDF com anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano diluída em tampão de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente no misturador de suspensão a 30 rotações por minuto. Em seguida, lave a membrana de PVDF com solução salina tamponada com Tris 20 três vezes. Após a lavagem, embeber a membrana de PVDF em solução salina tamponada com Tris 20 durante 30 minutos no misturador de suspensão a 45 rotações por minuto.Em seguida, substitua a solução salina tamponada com Tris tween 20 por solução salina tamponada com fosfato. Preservar a membrana de PVDF a quatro graus Celsius por até 12 horas. Em seguida, misture os reagentes de substrato quimioluminescente aprimorados um e dois em uma proporção de um para um.Em seguida, remova a membrana de PVDF da solução salina tamponada com fosfato e seque brevemente com as bolsas de punção para absorver o excesso de umidade. Adicione imediatamente 400 microlitros do reagente quimioluminescente à superfície da membrana e aguarde de três a cinco minutos. Seque brevemente para drenar o excesso de reagente quimioluminescente, evitando que a membrana seque completamente.Use o sistema de imagem da Luminescente para expor a mancha. Aqui, a análise de immunoblot foi feita para mostrar a concentração da enzima Ubc9 necessária para SUMOilate os alvos de p53. Isso mostra que 1/2 e 1/5 da concentração da enzima Ubc9 podem suficientemente SUMOilato da enzima p53 em um ensaio de SUMOilação in vitro usando os peptídeos SUMO 1 e SUMO 2.Para analisar o p53 SUMOilado a membrana foi sondada com anticorpo anti-p53. Uma análise imunoblot semelhante foi feita para mostrar que metade da concentração de E1 e 1/10 das enzimas Ubc9 são necessárias para SUMOilate o alvo p53 em um ensaio de SUMOilação in vitro usando os peptídeos SUMO 1, SUMO 2 e SUMO 3. Aqui, a membrana foi corada com Coomassie para mostrar a proteína K-bZIP purificada.O sistema de expressão de baculovírus foi usado para expressar o K-bZIP purificado, que foi analisado na página SDS com albumina de soro bovino como padrão para comparação. Análises adicionais de immunoblot também foram feitas, mostrando que, ao aumentar a concentração de K-bZIP, catalisa a SUMOilação de p53 na presença de metade da quantidade de E1 e 1/10 da quantidade de enzimas Ubc9, respectivamente. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todo o reagente para o ensaio de SUMOilação in vitro em gelo e fazer a diluição em série em vez de em uma diluição gigante. Encontre este procedimento, outros métodos, como a superexpressão de SUMOlygase, podem ser realizados para verificar a SUMOilação in vitro. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de SUMOilação explorassem mais SUMOlygase e validassem seu poder de especificidade.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como identificar uma ligase SUMO e3 usando um ensaio de simulação in vitro.

in-vitro-sumoylation-assay-to-study-sumo-e3-ligase-activity

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Biologia

Este vídeo demonstra o método in vitro para SUMOilação de proteínas de substrato usando uma cascata enzimática sequencial. Além disso, o status SUMOilado da proteína é identificado usando a técnica de eletroforese e immunoblotting.

Ensaio de SUMOilação: Uma Técnica In Vitro para Detectar o Status de SUMOilação de Proteínas de Substrato por Immunoblotting

Este manuscrito descreve a detecção de sumoylation e ubiquitinação de proteínas cinetócoro, Ndc10 e Ndc80, na levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento.

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

Família proteínas pequenas relacionadas à ubiquitina modificador (SUMO) são conjugadas aos resíduos de lisina das proteínas alvo regular de vários processos celulares. Este artigo descreve um protocolo para a detecção da proteína do retinoblastoma (Rb) SUMOylation sob condições endógenas e exógenas em células humanas.

Na Vivo Detecção e análise de SUMOylation de proteína Rb em células humanas

SUMO é um essencial e altamente conservado, pequena ubiquitina-like modificador de proteína. Neste protocolo nós estamos descrevendo o uso de uma proteína de SUMO-aprisionamento recombinante stress-tolerante (kmUTAG) para visualizar os conjugados nativos, Untagged de SUMO e sua localização em uma variedade de tipos da pilha.

Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes

Aqui, apresentamos um protocolo para enriquecer, isolar, identificar e caracterizar proteínas modificadas pelo SUMO in vivo tanto a partir de células de hepatoma humano quanto de tumores hepáticos obtidos a partir de modelos de camundongos de carcinoma hepatocelular usando entidades vinculantes ao SUMO (SUBEs).

Entidades vinculantes ao SUMO (SUBEs) como ferramentas para enriquecimento, isolamento, identificação e caracterização do Proteome SUMO em Câncer de Fígado

O objetivo deste manuscrito é apresentar um esboço para os estudos bioquímicos e funcionais abrangentes das ligaduras de ubiquitina ring-tipo E3. Este pipeline multipasso, com protocolos detalhados, valida uma atividade enzimática da proteína testada e demonstra como vincular a atividade à função.

Caracterização funcional do RING-Tipo E3 Ubiquitin Ligases In Vitro e In Planta

O presente estudo fornece protocolos de ensaio de on-lona in vitro detalhados para a análise da atividade catalítica da ubiquitina E3. Proteínas recombinantes foram expressas usando sistemas procarióticos como a cultura Escherichia coli.

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

Fornecemos um protocolo detalhado para um ensaio de ubiquização de um substrato específico e uma ubiquitina-ligase E3 em células mamíferas. As linhas celulares HEK293T foram utilizadas para superexpressão de proteínas, o substrato poliubiquizado foi purificado a partir de lisestês celulares por imunoprecipitação, e resolvido em SDS-PAGE. A imunoblotação foi usada para visualizar esta modificação pós-translacional.

Avaliação da Ubiquização substrato por E3 Ubiquitin-ligase em Lysates de Células Mamárias

O presente protocolo destaca um método modificado para detectar e quantificar ligações cruzadas DNA-proteína (DPCs) e suas modificações pós-traducionais (MPTs), incluindo ubiquitilação, SUMOilação e ADP-ribosilação induzida por inibidores de topoisomerase e por formaldeído, permitindo assim o estudo da formação e reparo de DPCs e suas MPTs.

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

A ubiquitinação é um regulador crítico das funções intracelulares das proteínas. Aqui, descrevemos dois métodos de lise celular para detectar os níveis de ubiquitinação de proteínas do substrato em células de mamíferos e comparamos sua eficácia na análise dos níveis de ubiquitinação. A superexpressão proteica em células HEK293T foi induzida por transfecção transitória, e proteínas ubiquitinadas foram detectadas por análise western blot.

Estratégias comparativas para detecção de ubiquitinação em lisados celulares de mamíferos usando SMAD2/SMURF2 como modelo

Este protocolo descreve um método para ubiquitinar Streptococcus pneumoniae usando lisado celular de mamífero ou complexo enzimático puro de ubiquitina, seguido de tratamento com complexo proteico purificado VCP/p97-UFD1-NPLOC4 para avaliar sua atividade bacteriolítica, possibilitando o estudo de efetores imunes dependentes de ubiquitina.

In vitro Reconstituição da Ubiquitinação Bacteriana e Eliminação Mediada por VCP/p97

Aprenda o ensaio de SUMOilação in vitro para identificar novas ligases E3 SUMO e estudar sua especificidade por isoformas SUMO. Este método avança a pesquisa em modificação de proteínas.

In Vitro Ensaio de SUMOylation para estudar a atividade de Ligase E3 sumô

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