Name: Um romance imagens Live In Vitro e fagocitose mediada por ensaio de Astrocyte usando pH sinaptossomas conjugada com indicador (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Aprenda a medir a fagocitose em astrocitos e microglia usando sinaptossomas conjugados com indicador de pH em ensaio de imagem ao vivo in vitro. Este método permite analisar a cinética de englobamento e degradação em tempo real.

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Os autores agradecer Jung Joo Yeon dela apoio experimental durante a purificação de synaptosome e parque de Jungjoo para imagens de sinaptossomas com exposição de PS. Além disso, agradecemos a todos os membros no laboratório de Chung para discussão útil. Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de pesquisa de subvenção de Coreia (NRF), financiada pelo governo coreano (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 e 2016R1C1B3006969-NRF) (W.-S. C).

<ol><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Assemble+Thalamocortical+Synapses+by+Bridging+NRX1alpha+and+NL1+via+Hevin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin.</a> Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).</li>
<li>Allen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+glypicans+4+and+6+promote+formation+of+excitatory+synapses+via+GluA1+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors.</a> Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).</li>
<li>Xu, J., Xiao, N., Xia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+1+accelerates+synaptogenesis+in+hippocampal+neurons+through+neuroligin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).</li>
<li>Chung, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+mediate+synapse+elimination+through+MEGF10+and+MERTK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways.</a> Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
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<li>Iram, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megf10+Is+a+Receptor+for+C1Q+That+Mediates+Clearance+of+Apoptotic+Cells+by+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes.</a> J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).</li>
<li>Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+engage+unique+molecular+programs+to+engulf+pruned+neuronal+debris+from+distinct+subsets+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons.</a> Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).</li>
<li>Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+astrocytic+phagocytosis+is+mediated+by+CD36%2C+CD47+and+RAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+lipid+sensing+sustains+the+microglial+response+in+an+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model.</a> Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).</li>
<li>Sekar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia+risk+from+complex+variation+of+complement+component+4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4.</a> Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Chung, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+allele-dependent+role+for+APOE+in+controlling+the+rate+of+synapse+pruning+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).</li>
<li>Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+glial+clearance+of+degenerating+axons+in+aged+Drosophila+is+due+to+reduced+PI3K%2FDraper+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity.</a> Nat Commun. 7, 12871(2016).</li>
<li>Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+degradation+in+phagocytic+astrocytes+can+be+enhanced+by+lysosomal+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification.</a> Glia. , (2015).</li>
<li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+astrocytic+lysosome+biogenesis+facilitates+Abeta+clearance+and+attenuates+amyloid+plaque+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis.</a> J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).</li>
<li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+degeneration+induces+glial+responses+through+Draper-TRAF4-JNK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling.</a> Nat Commun. 8, 14355(2017).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).</li>
<li>Stigliani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+re-sealed+particles+freshly+prepared+from+adult+rat+brain+are+competent+for+exocytotic+release+of+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate.</a> J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).</li>
<li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste artigo, apresentamos os métodos para um longo prazo de imagem ao vivo em vitro fagocitose ensaio usando células gliais purificadas e sinaptossomas conjugada com indicador de pH. Mostramos que, em comparação com microglia, astrócitos possuem capacidade de absorção e degradação diferente durante a fagocitose de sinaptossomas. Além disso, nossos dados sugerem que fatores astrocyte-secretado, que contêm pontes moléculas como proteínas, GAS6 e MEGE8, são essenciais para a fagocitose eficiente de PS-dependente d...

Células gliais, que se referem às células não-excitáveis no cérebro, são o tipo de células importantes no sistema nervoso central (SNC). Anteriormente, as células gliais foram consideradas como meras células comprovativos que principalmente desempenham um papel passivo na manutenção da sobrevivência neuronal e basais Propriedades sinápticas. No entanto, surgir provas revelou que as células gliais desempenham um papel mais ativo em vários aspectos da neurobiologia, tais como a manutenção da homeostase do cérebro, mediando a sinapse formação1,2,3 e sinapse eliminação de4,5e modulando plasticidade sináptica6,7. Células gliais no SNC incluem astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Entre essas células, astrócitos e microglia têm sido mostrados para desempenhar funções fagocíticas por incorporação de sinapses4,5, de células apoptóticas8, detritos neural9e proteínas patogênicas, tais como beta amyloid placas de10,11. No cérebro em desenvolvimento, astrócitos eliminam sinapses em dorsal geniculado (dLGN) através de de fagocitose dependente MERTK - e MEGF10-4. Da mesma forma, microglia também eliminar sinapses C1q-revestido durante estágios do desenvolvimento até a cascata de complemento clássico5. Curiosamente, tem sido sugerido que defeitos na poda de sinapse podem ser um dos iniciadores de vários distúrbios neurológicos. Por exemplo, ficou demonstrado que mutações no componente do complemento 4 (C4), que aumenta a poda mediada por complemento sinapse por microglia, estão fortemente associadas com a prevalência da esquizofrenia em seres humanos12. Um estudo recente também mostrou que o caminho de complemento clássica é hiperactivos na fase de iniciação da AD e induz a perda precoce da sinapse nesta doença13.
Comparado com fagocitose mediada por microglia, se fagocitose mediada por astrocyte contribui para a iniciação e a progressão de várias doenças neurológicas é menos clara. No entanto, um estudo recente sugere que fatores que alteram a taxa de poda normal sinapse por astrócitos podem perturbar a homeostase do cérebro e contribuir para AD susceptibilidade e patologia14. A taxa de poda sinapse por astrócitos poderosamente é controlada pela ApoE isômeros, com um alelo protetor para AD (ApoE2) fortemente, aumentando a taxa e um alelo de risco para AD (ApoE4), diminuindo significativamente a taxa. Além disso, ratos transgênicos expressando ApoE4 acumularam C1q sináptica muito mais do que controle ou ApoE2 ratos14. Estes dados sugerem que deficientes auditivos fagocitose mediada por astrocyte no início da cérebro AD pode induzir o acúmulo de detritos senescentes C1q-revestido sinapses/sináptica que ativa a fagocitose mediada por complemento microglial, dirigindo a degeneração sináptica . A capacidade fagocitária prejudicada de astrócitos em portadores de ApoE4 também pode contribuir para a descontrolada acumulação de placas de amiloide beta nos cérebros afetados por AD.
Além disso, ficou demonstrado que as células gliais no cérebro envelhecido Drosophila perdem sua capacidade fagocitária devido à diminuição da tradução de Draper, um homólogo de Megf10 que astrócitos usam para fagocitose sinapses. Restaurar níveis Draper resgatou a capacidade fagocitária das células gliais, que eficientemente limpo de detritos axonal danificados no cérebro envelhecido uma medida semelhante que que no cérebro jovem, indicando que envelhecimento induzido por alterações na capacidade fagocítica de astrócitos podem contribuir para interrupção do cérebro homeostase15.
Com base nesses resultados novos, modulando a capacidade fagocitária de astrócitos pode ser uma estratégia terapêutica atraente para prevenir e tratar várias doenças neurológicas. A este respeito, houve várias tentativas de aumentar a capacidade fagocítica dos astrócitos, por exemplo, induzindo a acidificação de lisossomos com nanopartículas de ácido16 e superexpressão do fator da transcrição EB (TFEB), que pode melhorar lisossoma biogênese17. Apesar destas tentativas, é ainda não está claro como astrócitos e células microglial diferem em sua cinética fagocítica e se devemos aumentar ou diminuir sua capacidade fagocitária em várias doenças.
Neste trabalho, apresentamos um ensaio de romance em vitro para detectar a capacidade fagocitária de astrócitos em tempo real. Os dados mostram diferente cinética de absorção e degradação em astrócitos e microglia. Astrocyte-condicionado médio (ACM), que contém fatores secretados de astrócitos, é essencial para a eficaz fagocitose de astrócitos e microglia. Além disso, Megf10, um receptor fagocítica em astrócitos e um homólogo do Ced-1 e Draper, tem um papel crítico na fagocitose mediada por astrocyte8,18.

<table><tbody><tr><td><forte>Purificação de sinaptossomo</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE saúde ciências da vida</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Início rápido Kit de ensaio de proteína Bradford 2</td><td>BIO-RAD</td><td>5000202</td><td></td></tr><tr><td><forte> conjugação do indicador de pH</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>solução</td> <td>de dimetilsulfóxido(DMSO)</td>LPS <td></td><td></td>DMSO100</tr><tr><td>pHrodo vermelho, sondas</td><td>Molecula</td> de éster succinimidílico <td>P36600</td><td></td></tr><tr><td>Immunopanning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Earle' s solução salina balanceada (EBSS)</td><td>Sigma</td><td>E7510</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Bovogen</td><td>BSA025</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirebonuclease 1 (DNase)</td><td>Worthington</td><td>Is002007</td><td></td></tr><tr><td>(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr>(<tr><td>dPBS)</td><td>Welgene</td><td>LB001-02</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Griffonia Simplicifolia Lectina (BSL-1)</td> <td>Vector Labs</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>IgG + IgM (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-044</td><td></td></tr><tr><td>IgM anti-mouse de cabra (cadeia &mu;)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina</td><td>Sigma</td><td>E4643</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo HepaCAM humano</td><td>R & Sistemas D</td><td>MAB4108</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal Integrin beta 5 (KN52)</td> <td>eBioscience</td><td>14-0497-82</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamato</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-citeína (NAC)</td> <td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>O4 hibridoma sobrenadante (camundongo IgM)</td> <td>Bansal et al.23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td></td><td>Worthington Is003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluristrainer 20 &mu; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td></td><td>Sigma P8783</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de putrescina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Rato purificado anti-rato CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>Rato purificado anti-rato CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T9935</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina</td><td>Worthington</td><td>LS003086</td><td></td></tr><tr><td>Tubo ultra-claro (tubo, parede fina, ultra-claro)</td> <td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Collect IP-ACM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrosep Advance Dispositivos centrífugos com membrana Omega (10k)</td><td>PALL</td><td>MAP010C37</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivos centrífugos Macrosep Advance com membrana Omega (30k)</td><td>PALL</td><td>MAP030C37</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytosis live imaging assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Juli stage</td><td>Plug-ins do NanoEntek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Time Series Analyzer V3</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um romance imagens live in vitro e fagocitose mediada por ensaio de astrocyte usando ph sinaptossomas conjugada com indicador

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Astrócitos são o tipo de grandes células no cérebro e contatar diretamente as sinapses e vasos sanguíneos. Embora microglial células foram consideradas as principais células do sistema imunológico e somente os fagócitos no cérebro, estudos recentes têm mostrado que astrócitos também participam de vários processos fagocíticas, tais como eliminação de sinapse desenvolvimento e apuramento das placas de amiloide beta na doença de Alzheimer (AD). Apesar destas constatações, a eficiência de incorporações de astrocyte e a degradação de suas metas é claros comparado com o de micróglia. Esta falta de informação é principalmente devido à falta de um sistema de ensaio em que a cinética de astrocyte e microglia-mediada por fagocitose são facilmente comparáveis. Para atingir este objetivo, temos desenvolvido um longo prazo de imagem ao vivo em vitro fagocitose do ensaio para avaliar a capacidade fagocitária de purificado astrócitos e microglia. Neste ensaio, detecção em tempo real de absorção e degradação é possível usando sinaptossomas conjugada com indicador pH, que emitem fluorescência vermelha brilhante em organelas ácidas, tais como lisossomos. Nosso romance ensaio fornece detecção simples e eficaz de fagocitose através de imagem ao vivo. Além disso, este ensaio de fagocitose em vitro pode ser usado como uma plataforma de triagem para identificar os produtos químicos e compostos que podem melhorar ou inibir a capacidade fagocitária dos astrócitos. Como o mau funcionamento de poda sináptica e acúmulo de proteínas patogênicas foram mostrados para causar distúrbios mentais ou doenças neurodegenerativas, produtos químicos e compostos que modulam a capacidade fagocitária das células gliais devem ser útil no tratamento de várias doenças neurológicas.

Em vitro fagocitose ensaio com imagens de viver a longo prazo, nós usamos sinaptossomas de homogenates de cérebro de rato adulto, que foram separados na solução de gradiente entre solução gradiente de 23% e 10% solução gradiente por ultracentrifugação ( A Figura 3). Depois da preparação, sinaptossomas expostos PS em sua membrana externa (Figura 4), sugerindo que eles perderam a sua função e podem ser reconhecidos por rec...

Este protocolo apresenta um em vitro de imagem live fagocitose ensaio para medir a capacidade fagocitária dos astrócitos. Microglia e astrócitos rat purificados são usados juntamente com sinaptossomas conjugada com indicador de pH. Esse método pode detectar a cinética de absorção e degradação em tempo real e fornece uma plataforma de triagem adequada para identificar fatores modulando a fagocitose de astrocyte.

Um romance imagens Live In Vitro e fagocitose mediada por ensaio de Astrocyte usando pH sinaptossomas conjugada com indicador

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

O objetivo geral deste experimento é detectar a cinética de engolfamento e degradação em tempo real de células gliais, como astrócitos e microglia, por meio de imagens ao vivo in vitro da fagocitose de sinaptossomos conjugados com indicadores de pH. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como como a fagocitose das células gliais é regulada em cérebros saudáveis e doentes. A principal vantagem desta técnica é que podemos monitorar e analisar efetivamente a cinética fagocítica em tempo real das células gliais por meio de imagens ao vivo de células cultivadas in vitro.Este método também pode ser usado para rastrear fatores e compostos que regulam a capacidade de engolfamento e degradação das células gliais. Comece centrifugando as amostras de sinaptossomo descongeladas por três a quatro minutos a 21.092 G e quatro graus Celsius. Após aspirar os sobrenadantes, ressuspender os pellets em 200 microlitros de carbonato de sódio 0,1 molar por tubo, adicionando dois microlitros de indicador de pH a cada amostra após terem sido bem misturados.Após um vórtice suave, proteja as soluções da luz com tampas de papel alumínio e coloque as amostras em um agita

a-novel-vitro-live-imaging-assay-astrocyte-mediated-phagocytosis

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Neste vídeo, realizamos o ensaio de fagocitose microglial para neuroblastoma usando células-tronco pluripotentes induzidas. O ensaio ajuda a avaliar o comprometimento da função microglial em doenças neurodegenerativas.

Ensaio de fagocitose microglial: um ensaio in vitro para estabelecer o modelo de fagocitose microglial para células de neuroblastoma usando macrófagos iPSC

Neste vídeo, avaliamos a capacidade fagocítica de astrócitos purificados in vitro por ensaio de imagem ao vivo. O ensaio serve como uma plataforma de triagem eficaz para identificar compostos químicos que podem aumentar ou inibir a capacidade fagocítica dos astrócitos.

Ensaio de fagocitose in vitro: um método baseado em imagens ao vivo para estudar a faragocitose sinaptossomal mediada por astrócitos em tempo real

Fonte: Funes, S., et. al., Células semelhantes à microglia humana: diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas e ensaio de fagocitose de células vivas in vitro usando sinaptossomos humanos. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um ensaio para estudar a capacidade fagocítica de células semelhantes à microglia usando sinaptossomos marcados com corante fluorescente sensível ao pH.

Ensaio de fagocitose de células vivas de células semelhantes à microglia usando sinaptossomos humanos

Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melhor apreciação da sensibilidade dos receptores...

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Microglia são as células do sistema imunológico residentes do sistema nervoso central (SNC), com uma elevada capacidade de fagocitar ou engolir o material no seu ambiente extracelular. Aqui, um ensaio amplamente aplicável, confiável e altamente quantitativa para visualizar e medir engulfment mediada por microglia de componentes sinápticas é descrito.

Uma imersão Ensaio: Um protocolo para avaliar Interações entre CNS fagócitos e Neurônios

fagocitose microglial é crítica para a manutenção da homeostase do tecido e da função fagocítica inadequada tem sido implicada na patologia. No entanto, a avaliação da função microglia in vivo é tecnicamente desafiador. Nós desenvolvemos uma técnica simples, mas robusta para monitorar com precisão e quantificar o potencial fagocítica da microglia em um ambiente fisiológico.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Aqui nós descrevemos um método vivo-imagem latente in vitro para visualizar o transporte intracelular das organelas e o tráfico de proteínas da membrana de plasma em astrocytes murino. Este protocolo também apresenta uma metodologia de análise de imagem para determinar itinerários de transporte de carga e cinética.

Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos

Doenças neurodegenerativas estão associadas a funções de microglia disreguladas. Este artigo descreve um ensaio in vitro de fagocitose de células neuroblastoma por macrófagos iPSC. As leituras quantitativas de microscopia são descritas tanto para imagens de lapso de tempo de células vivas quanto para imagens de alto conteúdo de células fixas.

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos

Este protocolo descreve o processo de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) em células semelhantes à micróglia para experimentação in vitro . Também incluímos um procedimento detalhado para gerar sinaptossomos humanos a partir de neurônios motores inferiores derivados de iPSC que podem ser usados como substrato para ensaios de fagocitose in vitro usando sistemas de imagem de células vivas.

Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos

Aqui apresentamos dois protocolos para quantificar o engolfamento microglial de sinapses positivas para vGLUT1 e sinaptossomos brutos marcados com pHRodo Red usando citometria de fluxo.

Quantificação do engolfamento microglial de material sináptico usando citometria de fluxo

Aprenda a medir a fagocitose em astrocitos e microglia usando sinaptossomas conjugados com indicador de pH em ensaio de imagem ao vivo in vitro. Este método permite analisar a cinética de englobamento e degradação em tempo real.

Um romance imagens Live In Vitro e fagocitose mediada por ensaio de Astrocyte usando pH sinaptossomas conjugada com indicador

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