Um romance imagens Live In Vitro e fagocitose mediada por ensaio de Astrocyte usando pH sinaptossomas conjugada com indicador

Este protocolo apresenta um em vitro de imagem live fagocitose ensaio para medir a capacidade fagocitária dos astrócitos. Microglia e astrócitos rat purificados são usados juntamente com sinaptossomas conjugada com indicador de pH. Esse método pode detectar a cinética de absorção e degradação em tempo real e fornece uma plataforma de triagem adequada para identificar fatores modulando a fagocitose de astrocyte.

O objetivo geral deste experimento é detectar a cinética de engolfamento e degradação em tempo real de células gliais, como astrócitos e microglia, por meio de imagens ao vivo in vitro da fagocitose de sinaptossomos conjugados com indicadores de pH. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como como a fagocitose das células gliais é regulada em cérebros saudáveis e doentes. A principal vantagem desta técnica é que podemos monitorar e analisar efetivamente a cinética fagocítica em tempo real das células gliais por meio de imagens ao vivo de células cultivadas in vitro.

Este método também pode ser usado para rastrear fatores e compostos que regulam a capacidade de engolfamento e degradação das células gliais. Comece centrifugando as amostras de sinaptossomo descongeladas por três a quatro minutos a 21.092 G e quatro graus Celsius. Após aspirar os sobrenadantes, ressuspender os pellets em 200 microlitros de carbonato de sódio 0,1 molar por tubo, adicionando dois microlitros de indicador de pH a cada amostra após terem sido bem misturados.

Após um vórtice suave, proteja as soluções da luz com tampas de papel alumínio e coloque as amostras em um agitador de torção com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente. No final da incubação, adicione um mililitro de PBS de Dulbecco, ou DPBS, e colete os sinaptossomos por centrifugação, ressuspendendo o pellet em um mililitro de DPBS fresco por lavagem. Após a última centrifugação, ressuspenda o pellet de sinaptossomo não funcional em 200 microlitros de DPBS suplementado com 5% de DMSO.

Para imagens ao vivo do engolfamento do sinaptossomo, primeiro remova o sobrenadante de cada poço de uma cultura de astrócitos confluente e lave rapidamente as células três vezes com um mililitro de DPBS por lavagem. Após a última lavagem, adicione 300 microlitros de meio básico de astrócitos imunopanados e cinco microlitros de sinaptossomos conjugados com indicador de pH, bem como quaisquer fatores adicionais que possam modular a fagocitose das células gliais. Permita que os sinaptossomos se estabeleçam no fundo dos poços e se liguem aos receptores de fosfatidilserina nos astrócitos a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Após 40 minutos, eliminar os sobrenadantes e lavar os alvéolos três vezes com um mililitro de DPBS por lavagem. Após a última lavagem, adicione 500 microlitros de meio fresco suplementado com os fatores de interesse aos poços apropriados e transfira a placa para um instrumento de imagem ao vivo. Selecione as posições de imagem, ajuste o foco, o tempo de exposição, o brilho e a potência do LED e defina o formato da imagem, o intervalo de tempo e o número total de ciclos para imagens ao vivo conforme apropriado experimentalmente.

Em seguida, comece a imagem ao vivo dos experimentos de fagocitose. No ponto final experimental apropriado, abra um programa de análise de imagem e importe a sequência de imagens de lapso de tempo. Converta as imagens em tons de cinza de 8 bits e inicie uma subtração de fundo com um raio de barra rolante de 50 pixels.

Em seguida, abra o plug-in Time Series Analyzer V3 e arraste a região de interesse para o plug-in. Na região do gerenciador de interesse, clique em Adicionar. No plug-in Time Series V3, clique em Obter intensidade total.

Em seguida, salve os resultados e integre os dados. Após sua preparação, os sinaptossomos expressam fosfatidilserina em suas membranas externas, sugerindo uma perda de função, e isso pode ser reconhecido por receptores de fosfatidilserina em astrócitos e micróglia. À medida que os sinaptossomos conjugados com indicadores de pH são fagocitados, eles emitem fluorescentes vermelhas brilhantes.

Para quantificar a fagocitose das células gliais, a área do sinal de fluorescência vermelho, ou índice fagocítico, pode ser medida. Embora os astrócitos sejam eficientes em fagocitar um grande número de sinaptossomos conjugados com indicadores de pH, a microglia é mais rápida em engolir e degradar os sinaptossomos. Curiosamente, os fatores secretados por astrócitos, que estão contidos no meio condicionado de astrócitos, são essenciais para aumentar a fagocitose mediada por astrócitos e micróglias.

Além disso, os astrócitos nocaute MEGF10 de camundongos demonstraram capacidade fagocítica significativamente prejudicada em comparação com células do tipo selvagem. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência e da biologia celular glial explorarem os mecanismos envolvidos na modulação da fagocitose de células gliais como um método potencial para o tratamento de vários distúrbios neurológicos.