Usando a análise filogenética para investigar a origem de genes eucariontes
14 de agosto de 2018
É descrito um método de construção de uma árvore filogenética baseada em homologia de sequência de doces de eucariontes e SemiSWEETs de procariontes. A análise filogenética é uma ferramenta útil para explicar o parentesco evolutivo entre proteínas homólogas ou genes de grupos de organismo diferente.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo fitogenético, como coletar sequências e como selecionar o modelo de computação correto. A principal vantagem dessa técnica é que ela é muito fácil de aprender. Geralmente, aqueles que são novos neste método podem ter dificuldades simplesmente porque não sabem como lidar com os dados devido à falta de conhecimento básico dos princípios e métodos de filogenia.
Este método foi desenvolvido pela primeira vez quando analisamos o alinhamento dos genes SWEET eucarióticos. A demonstração visual desse método é crítica, pois há uma magnitude de escolhas e configurações para diferentes aspectos do alinhamento. Comece este procedimento com a seleção de 35 proteínas SWEET candidatas de organismos eucarióticos unicelulares, conforme descrito no protocolo de texto.
Alinhe as 35 sequências SWEET inserindo-as no Clustal Omega. Copie e cole as sequências de proteínas no formato FASTA na caixa de entrada ou carregue um arquivo de sequência no formato FASTA. Especifique que é uma sequência de aminoácidos clicando no ícone no menu suspenso na seção da etapa um.
Especifique o formato de saída e outros parâmetros na seção da etapa dois, se necessário. Para este estudo, defina o formato de saída como Clustal sem número e deixe os outros parâmetros nas configurações padrão. Na maioria dos casos, os parâmetros padrão funcionam bem sem qualquer especificação.
Envie e execute o alinhamento na seção da etapa três. Pode levar de vários segundos a minutos até que o alinhamento seja concluído. No painel Resumo do resultado, clique com o botão direito do mouse no link no formato Alinhamento no CLUSTAL e salve as sequências alinhadas como 35.clustal.
Para abrir o arquivo de resultado do alinhamento no BioEdit, clique em Sequência e selecione Editar humor no primeiro menu suspenso no painel principal do BioEdit. Em seguida, clique em Editar resíduos no submenu. Selecione as sequências salientes no lado esquerdo do alinhamento com o cursor e clique no ícone Excluir no menu Editar para remover as sequências selecionadas.
Selecione e exclua as sequências no lado direito do primeiro domínio de saliva MtN3 e salve as primeiras sequências de domínio de saliva MtN3 cortadas como 35-1.fas. Da mesma forma, exclua as sequências do lado esquerdo e direito do segundo domínio de saliva MtN3 e salve-o como 35-2.fas. A primeira e a segunda sequências do domínio da saliva MtN3 podem ser previstas com ritmo ou TMHMM com antecedência.
Abra o arquivo 35-1. fas com MEGA e clique em Alinhar quando solicitado. No menu Editar, clique em Selecionar tudo.
Em seguida, clique em Selecionar sequências. Os nomes e sequências dos táxons serão selecionados em preto. Escolha Copiar no menu Editar para copiar as sequências na área de transferência e cole as sequências copiadas em um arquivo doc.
No arquivo doc, substitua todos os sinais numéricos pelo sinal maior que e, em seguida, exclua todos os caracteres não relacionados para convertê-los para o formato FASTA. Adicione 1 no final de cada nome de táxon para marcá-los como as primeiras sequências de domínio de saliva MtN3. Processe as segundas sequências de domínio de saliva MtN3 seguindo o mesmo método e adicione 2 após cada nome de táxon.
Agora combine a primeira e a segunda sequências de domínio de saliva MtN3 no formato FASTA em um arquivo doc. Para fazer isso, carregue as sequências combinadas no Clustal Omega novamente e alinhe as sequências como antes. Salve o resultado como 35reigned.clustal.
Abra o arquivo 35realinhado. clustal no BioEdit. Exclua os resíduos de aminoácidos irregulares em cada extremidade das sequências alinhadas e salve as sequências como 35reigned.fas.
Clique em Sim quando avisado de que alguns caracteres fora do padrão não podem ser salvos. Aberto 35realinhado. fas em MEGA.
Clique no menu Dados e escolha Exportar Alinhamento. Em seguida, salve o alinhamento no formato POP como 35. próximo para uso posterior na Base MR.
Enquanto isso, clique no ícone Modelos no painel principal do MEGA. Escolha Encontrar melhores modelos de proteína de DNA e clique em OK na janela pop-up. Clique em Calcular para iniciar o processo de pesquisa do modelo.
Um novo painel de progresso será aberto. Esse processo dura de vários minutos a vários dias, dependendo da complexidade das sequências carregadas e do desempenho do computador. Uma tabela mostrando os resultados será aberta após a conclusão do processo de pesquisa do modelo.
A menor pontuação BIC será listada primeiro, seguida por uma série de modelos diferentes com pontuações BIC gradualmente crescentes. O primeiro modelo LG+G+F com a menor pontuação BIC é o modelo recomendado para a árvore de ML com base no 35realinhado. arquivo FAS.
Em seguida, clique no ícone Filogenia no painel principal do MEGA. Clique em Construir/Testar a Árvore de Máxima Verossimilhança e, em seguida, clique em Sim no painel pop-up. Uma nova janela será aberta mostrando diferentes parâmetros que precisam ser especificados.
Primeiro, defina o valor de bootstrap no teste da caixa de filogenia. 500 ou 1.000 é adequado na maioria dos casos. No Modelo de substituição, escolha aminoácido como o tipo de substituição.
O objetivo da escolha de um modelo de substituição é estimar a verdadeira diferença entre as sequências com base em seus estados atuais. Selecione LG com Modelo de Frequência na caixa Modelo e Método. Na caixa Taxas e padrões, selecione gama distribuída para descrever as variações de taxa entre sites, como dar mais peso às alterações em sites de evolução lenta.
Na caixa Subconjunto de dados, selecione exclusão completa para remover todas as colunas que contêm hífens. Mantenha todos os outros parâmetros em seus estados padrão. Após a especificação desses parâmetros, clique no ícone Calcular para iniciar o cálculo.
Uma árvore filogenética de ML será apresentada quando a computação usando MEGA for concluída. No menu suspenso do ícone Arquivo no painel Árvore, escolha Salvar sessão atual para salvar o resultado. No presente estudo, o resultado foi salvo como 35.mas.
No painel Árvore, muitos parâmetros, incluindo comprimento do clado, estilo da árvore, topologia da árvore, fonte do nome do táxon, tamanho e cor, são exibidos e podem ser definidos para diferentes opções. Salve o arquivo de árvore final clicando no ícone Imagem e salve a figura em diferentes formatos ou copie a imagem como fonte para edição de fotos. Prossiga com a análise da relação de SWEETs e semiSWEETs, bem como usando a construção da árvore filogenética de alinhamento de sequência com MR Base, conforme detalhado no protocolo de texto.
As árvores filogenéticas mostram que todos os primeiros domínios de saliva MtN3 das 35 sequências SWEET se agruparam como um clado e os segundos domínios de saliva MtN3 das sequências SWEET se agruparam como outro clado. Além disso, os resultados de alinhamento dos SWEETs e semiSWEETs mostram que alguns semiSWEETs de Alpha-Proteobacteria se alinharam com o primeiro domínio de saliva MtN3 das sequências SWEET, enquanto os semiSWEETs de Methanobacteria se alinharam com o segundo domínio de saliva MtN3 das sequências SWEET. Esses resultados juntos sugerem que os dois domínios de saliva MtN3 contendo SWEETs podem ser derivados de uma fusão evolutiva de um semiSWEET bacteriano e um arqueano.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora a vários dias, dependendo da complexidade dos dados. Ao tentar este protocolo, é importante coletar sequências de alta qualidade com antecedência. Após seu desenvolvimento, esse protocolo abriu caminho para pesquisadores em evolução explorarem as relações entre genes homólogos.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir uma árvore filogenética.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para a construção de uma árvore filogenética com base na homologia de sequências de SWEETs de eucariotos e SemiSWEETs de procariotos. A técnica é de fácil utilização e auxilia na compreensão das relações evolutivas entre proteínas ou genes homólogos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Filogenética
- Evolução Proteica
- Análise de Sequência
Contexto
- A análise filogenética ajuda a explicar a relação evolutiva.
- Compreender as proteínas SWEET e SemiSWEET é essencial para estudos evolutivos.
- Recém-chegados podem ter dificuldades com o manuseio de dados devido à falta de conhecimentos básicos.
- Demonstrações visuais aprimoram a compreensão do método.
Objetivo do Estudo
- Fornecer uma metodologia clara para a construção de árvores filogenéticas.
- Facilitar a seleção de modelos computacionais apropriados.
- Auxiliar pesquisadores na coleta e análise de dados de sequência.
Métodos Utilizados
- Seleção de 35 proteínas SWEET candidatas de eucariontes unicelulares.
- Alinhamento dos genes eucariontes SWEET.
- Utilização de diversas configurações para aspectos do alinhamento.
- Demonstrações visuais para orientar os usuários durante o processo.
Resultados Principais
- O método simplifica o processo de análise filogenética.
- Ele fornece uma estrutura para compreender a evolução proteica.
- Os usuários podem lidar eficazmente com dados de sequência com orientação adequada.
- Recursos visuais aumentam significativamente os resultados de aprendizagem.
Conclusões
- Este método é acessível para pesquisadores novos em filogenética.
- Ele preenche a lacuna entre o conhecimento teórico e a aplicação prática.
- Estudos futuros podem se basear nesta metodologia fundamental.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise filogenética de famílias de proteínas, como os transportadores SWEET, permite a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta, esclarecendo as origens evolutivas e a divergência funcional. Essa abordagem auxilia na validação de alvos ao distinguir domínios conservados de inovações específicas de linhagem, reduzindo a ambiguidade na geração de hipóteses. Os conhecimentos sobre eventos de fusão gênica orientam estratégias de biomarcadores translacionais e a seleção de modelos pré-clínicos para vias relacionadas ao transporte.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao rastrear a arquitetura de domínios até ancestrais procarióticos e arqueais.
- Valor Operacional: Esclarece a validação funcional de alvos por meio da conservação evolutiva dos domínios MtN3 saliva em proteínas SWEET.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar regiões com restrição evolutiva, menos suscetíveis a mecanismos compensatórios.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados mediante a definição dos limites dos domínios para a construção de proteínas quiméricas.
- Valor Operacional: Permite a padronização de ensaios por meio de domínios MtN3 alinhados por sequência como leituras quantitativas da atividade de transportadores.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma por meio de pipelines Clustal Omega e MEGA para triagem da família SWEET entre espécies.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao confirmar a conservação de domínios entre eucariotos e procariotos.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao correlacionar a divergência do domínio SWEET com os resultados fenotípicos no transporte de açúcares.
- Avanço com Gestão de Riscos: Orienta decisões de avançar ou interromper ao destacar as restrições evolutivas sobre a tolerância a mutações no alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a testagem da hipótese do alvo até a identificação de compostos iniciais, ao fornecer um contexto evolutivo para a função proteica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao esclarecer se a função observada de SWEET decorre de herança vertical ou transferência horizontal de genes.
- Triagem: Descreve a preparação do ensaio por meio de domínios MtN3 alinhados como unidades estáveis e quantificáveis para triagem em alto rendimento.
- Análises: Destaca as saídas de Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana como medidas estatísticas de confiança do clado para priorização de alvos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao validar a conservação de domínios como um indicador indireto da preservação funcional em modelos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o fluxo de trabalho Clustal Omega-MEGA-MrBayes como uma capacidade reutilizável para reduzir riscos em famílias de transportadores ao longo de diversos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na seleção de alvos por meio da redução de riscos evolutivos em pressupostos mecanicistas.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de parâmetros fixos de alinhamento e critérios de seleção de modelos (LG+G+F).
- Valor Estratégico: Decisões mais eficazes de prosseguir/não prosseguir ao reduzir o risco de falhas em estágios avançados decorrentes da atribuição incorreta do mecanismo do alvo.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base em escores de restrição evolutiva derivados do suporte filogenético de clados.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em alinhamento de sequências, teste de modelos filogenéticos e interpretação de árvores.
- Depende do acesso ao Clustal Omega, MEGA e MrBayes para o alinhamento e construção de árvores.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de curadoria de sequências e seleção de modelos.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar a famílias de proteínas não transportadoras com arquiteturas de domínio diferentes.
- Limitado pela incapacidade de confirmar a equivalência funcional dos estados ancestrais inferidos sem validação experimental.
