Name: Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprenda a detectar fosforilação de Rab10 por LRRK2 usando SDS-PAGE com tag de ligação de fosfato. Este método permite estimar a estequiometria da fosforilação em células HEK293 e investigar mutações relacionadas à doença de Parkinson.

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Agradecemos o Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio, Japão) por gentilmente fornecendo os plasmídeos codificação 3xFLAG-LRRK2 WT e mutantes. Agradecemos também o Dr. Dario Alessi (Universidade de Dundee, Reino Unido) para fornecer gentilmente MLi-2 e o plasmídeo codificação HA-Rab10. Este trabalho foi apoiado pela sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHI Grant número JP17K08265 (G.I.).

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Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um método robusto e fácil de detectar a fosforilação de Rab10 por LRRK2 níveis endógenos com base na metodologia do P-marca. Porque o anticorpo atualmente disponível contra fosforilada Rab10 só funciona com proteínas Blumental15, o presente método utilizando P-marca SDS-PAGE é a única maneira de avaliar os níveis endógenos de fosforilação Rab10. Além disso, o presente método permite a estimativa da estequiometria da fosforilação de Rab10 nas células. Porque a metodologia de P-mar...

PD é uma das mais comuns doenças neurodegenerativas, predominantemente, afetando os neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo, resultando em disfunção dos sistemas de motor em idosos1. Enquanto a maioria dos pacientes desenvolvem PD de forma esporádica, há famílias herdar a doença. Mutações em vários genes foram encontradas para ser ligado com FPD2. Um dos genes causadores de FPD é LRRK2, em que oito mutações missense (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S e I2020T), ligadas a um FPD predominantemente hereditária chamada PARK8 até agora têm sido relatados3,4,5. Vários estudos de associação de genoma-larga (GWAS) de pacientes com DP esporádicos também identificaram variações genômicas no locus LRRK2 como um fator de risco para a polícia, sugerindo que a anormalidade na função do LRRK2 é uma causa comum de neurodegeneração em ambos os casos esporádicos e PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 é uma proteína grande (2.527 aminoácidos), consistindo de um domínio de repetição rico em leucina, um Ras-GTP-vinculação do domínio de proteínas complexas (ROC), um C-terminal do domínio, um domínio da quinase serina/treonina proteína e um domínio de WD409ROC (CR). As oito mutações FPD localizar estes domínios funcionais; N1437H e R1441C/G/H/S no domínio do ROC, Y1699C no domínio do CR, G2019S e I2020T no domínio de cinase. Desde que a mutação G2019S, que é o mais frequentemente encontrada mutação em PD pacientes10,11,12, aumenta a atividade da quinase de LRRK2 por 2-3 vezes em vitro13, supor que o aumento anormal da fosforilação de LRRK2 substrate(s) é tóxico para os neurônios. No entanto, tem sido impossível estudar se a fosforilação de substratos LRRK2 fisiologicamente relevantes é alterada em pacientes com DP familiar/esporádicas devido à falta de métodos para avaliá-lo em amostras derivadas de pacientes.
Fosforilação de proteínas é geralmente detectada pelo immunoblotting ou ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando anticorpos especificamente, reconhecendo o estado fosforilado de proteínas ou por análise de espectrometria de massa. No entanto, a estratégia anterior às vezes não pode ser aplicada devido às dificuldades em criar anticorpos específicos de fosforilação. Etiquetando metabólica das células com fosfato radioativo é outra opção para examinar os níveis fisiológicos de fosforilação quando anticorpos específicos fosforilação não estão prontamente disponíveis. No entanto, ele requer uma grande quantidade de materiais radioativos e, portanto, envolve alguns equipamentos especializados para protecção contra as radiações14. Análise de espectrometria de massa é mais sensível em relação a esses métodos imunoquímicos e tornou-se popular na análise de fosforilação de proteínas. No entanto, a preparação da amostra é demorada e caros instrumentos são necessários para a análise.
Um subconjunto da família Rab GTPase, incluindo Rab10 e Rab8 foi relatado recentemente como substratos fisiológicos diretos para LRRK2 com base no resultado de uma análise de phosphoproteomic em grande escala15. Em seguida demonstramos que a fosforilação de Rab10 foi aumentada por mutações FPD em fibroblastos embrionários de rato e nos pulmões de ratos16de knockin. Neste relatório, nós escolhemos a empregar uma eletroforese em gel de poliacrilamida sódio Dodecil sulfato (SDS-PAGE)-método em que uma molécula de P-marca é co polimerizada em geles de SDS-PAGE (P-marca SDS-PAGE) para detectar os níveis endógenos de fosforilação de Rab10, baseado em Porque um altamente sensível anticorpos específicos Rab10 fosforilada ainda estava faltando. Nós não conseguiram detectar a fosforilação de endógena Rab8 devido a seletividade pobre de anticorpos disponíveis atualmente para Rab8 total. Por isso, decidimos focar a fosforilação de Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 em Thr73 localizar no meio da região altamente conservadas "alternar II". Alta conservação dos sítios entre proteínas Rab fosforilação pode ser uma das razões por que os anticorpos phosphospecific reconhecer proteínas Rab distintas são difíceis de fazer.
A fosforilação de Rab8A por LRRK2 inibe a ligação do Rabin8, um fator da troca do nucleotídeo guanina (GEF) que ativa Rab8A trocando o PIB ligado com GTP15. A fosforilação de Rab10 e Rab8A por LRRK2 também inibe a ligação dos inibidores de PIB-dissociação (GDIs), que são essenciais para a ativação de proteínas Rab extraindo as proteínas Rab ligados a PIB de membranas15. Coletivamente, supor que a fosforilação de proteínas Rab por LRRK2 impede que a ativação embora o mecanismo molecular preciso e consequências fisiológicas da fosforilação permanecem obscuros.
P-marca SDS-PAGE foi inventado por Kinoshita et al em 2006: neste método, acrilamida covalentemente foi acoplada com P-tag, uma molécula capturando fosfatos com alta afinidade, que copolymerized em SDS-PAGE geles17. Porque as moléculas de P-etiqueta em um gel de SDS-PAGE seletivamente retardam mobilidade eletroforética de proteínas fosforiladas, P-marca SDS-PAGE pode separar proteínas fosforiladas aqueles não-fosforilada (Figura 1). Se a proteína de interesse é fosforilado em múltiplos resíduos, uma escada de bandas correspondentes às formas diferencialmente fosforiladas será observada. No caso de Rab10, observamos apenas uma banda deslocada, indicando que o Rab10 é phosphorylated apenas em Thr73. A grande vantagem de P-marca SDS-PAGE sobre immunoblotting com anticorpos específicos fosforilação é que Rab10 fosforilada pode ser detectado pelo immunoblotting com anticorpos de fosforilação específico (ou seja, reconhecendo Rab10 total) após ser transferido nas membranas, que é geralmente mais específica, sensível e disponível de fontes comerciais/acadêmico. Outra vantagem de usar P-marca SDS-PAGE é que um pode obter a estimativa aproximada da estequiometria da fosforilação, que é impossível pelo immunoblotting com anticorpos específicos fosforilação ou através da marcação metabólica das células com radioativo fosfatos.
Aparte o uso de barato P-marca acrilamida e algumas pequenas modificações relacionadas a ela, o presente método de detecção de fosforilação de Rab10 por LRRK2 segue um protocolo geral de immunoblotting.Portanto, deve ser simples e facilmente executável em alguns laboratórios onde immunoblotting é uma prática usual, com todos os tipos de amostras, incluindo proteínas purified, lisados celulares e tecido homogenates.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>caseiro</td><td></td><td>150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 em água MilliQ e esterilizado por autoclave</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-34</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato Dissódico de Sódio 12-Água</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrogenofosfato de potássio</td><td>Wako</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>2,5% de tripsina (10X)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td>Diluir 10 vezes com DPBS estéril para preparar a solução</td></tr> <tr><td>de trabalhoMeio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>BioWest</td><td>S1560</td><td>Inativado por calor a 56 &deg; C por 30 min</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (100X)</td> <td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td></td></tr><tr><td>Polietileninina HCl MAX, Linear, Mw 40.000 (PEI MAX 40000)</td> <td>PolySciences, Inc.</td><td>24765-1</td><td>A solução-mãe foi preparada em HEPES-NaOH 20 mM pH 7,0 a 1 mg/mL e o pH foi então ajustado para 7,0 com NaOH</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Wako</td><td></td><td>045-28335</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>STAR</td><td>RSP-THA500G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno (10) Éter octilfenílico</td><td>Wako</td><td>160-24751</td><td>Equivalente a Triton X-100</td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter) -N, N, N ', N'-ácido tetracético (EGTA)</td> <td>Wako</td><td>346-01312</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sódio (V)</td> <td>Wako</td><td>198-09752</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de sódio</td><td>Kanto Chemical</td><td>37174-20</td><td></td></tr> <tr><td>&beta; -Ácido glicerofosfórico Sal dissódico Pentahidratado</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17103-82</td><td></td></tr><tr><td>Sódio pirofosfato decahidratado</td><td>Kokusan Químico</td><td>2113899</td><td></td></tr><tr><td>Microcistina-LR</td><td>Wako</td><td>136-12241</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel completo de inibidores de protease sem EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Dissolva um comprimido em 1 mL de água, que pode ser armazenado a -20 &deg; C por um mês. Use-o na diluição de 1:50 para lise celular</td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proteína Pierce Coomassie (Bradford)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31607-65</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Wako</td><td>075-00616</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Wako</td><td>021-02911</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>25099-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Wako</td><td>056-06967</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako</td><td>136-01837</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida de etiqueta de ligação de fosfato</td><td>Wako</td><td>AAL-107</td><td>Solução de acrilamida P-tag</td></tr><tr><td>40% (p / v)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06119-45</td><td>Acrilamida: Bis = 29: 1</td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td> <td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr>A solução de <td>persulfato de amônio (APS)</td><td>Wako</td><td>016-08021</td><td>10% (p/v) foi preparada dissolvendo o pó de persulfato de amônio em água MilliQ</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>166-04831</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de manganês tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374, 1610373, 1610377</td><td>Marcador de peso molecular usado no protocolo</td></tr><tr><td>WIDE-VIEW Marcador de tamanho de proteína prestado III</td><td>Wako</td><td>230-02461</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-64</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran NC 0,45</td><td>GE Healthcare</td><td>10600007</td><td>Membrana de nitrocelulose</td></tr><tr><td>Filtro de membrana Durapore EMD</td><td>Millipore</td><td>GVHP00010</td> Papéis de filtro de <td>membrana PVDF</td></tr><tr><td>No.1</td><td>Advantec</td><td>00013600</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28322-72</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Wako</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>monolaurato de polioxietilenoorbitano</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Wako</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Difco Laboratories</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Immunostar</td><td>Wako</td><td>291-55203</td><td>Solução ECL (sensibilidade normal)</td></tr><tr><td>Solução Immunostar LD</td><td>Wako</td><td>290-69904</td><td>ECL (alta sensibilidade)</td></tr><tr><td>Solução de coloração CBB</td><td>caseira</td><td></td><td>1 g CBB R-250, 50% (v/v) de metanol, 10% (v/v) de ácido acético em 1 L de água MilliQ</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td></td></tr><tr><td>CBB descoloração solução</td><td>caseira</td><td></td><td>12% (v/v) de metanol, 7% (v/v) de ácido acético em 1 L de água MilliQ</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA anticorpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11583816001</td><td>Usado em 0,2 &mu; g/mL para immunoblotting.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Rab10</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td> <td># 8127</td><td>Usado em 1: 1000 para immunoblotting. A especificidade foi confirmada por CRISPR KO em Ito et al., Biochem J, 2016.</td></tr><tr><td>anti-pSer935 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab133450</td><td>Usado em 1 &mu; g/mL para immunoblotting.</td></tr><tr><td>anti-LRRK2 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab133518</td><td>Usado em 1 &mu; g/mL para immunoblotting.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-&alfa;-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>Usado em 1 &mu; g/mL para immunoblotting.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GAPDH</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-32233</td><td>Usado a 0,02 &mu; g/mL para immunoblotting.</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td>Usado a 0.16 &mu; g/mL para immunoblotting.</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td>Usado a 0.16 &mu; g/mL para immunoblotting.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Inibidores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSK2578215A</td><td>MedChem Express</td><td>HY-13237</td><td>A solução-mãe foi preparada em DMSO a 10 mM e armazenada a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>MLi-2</td><td>Fornecido pelo Dr. Dario Alessi (Universidade de Dundee)</td><td></td><td>A solução de estoque foi preparada em DMSO a 10 mM e armazenada a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Plasmídeos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rab10/pcDNA5 FRT TO HA</td><td>Fornecido pelo Dr. Dario Alessi (Universidade de Dundee)</td><td></td><td>Este plasmídeo expressa Rab10 humano marcado com HA aminoterminal.</td></tr><tr><td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)</td><td></td><td>Ito et al., Bioquímica, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). Este plasmídeo expressa LRRK2 humano de tipo selvagem marcado com amino-terminal 3xFLAG.</td></tr><tr><td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)</td><td></td><td>Ito et al., Bioquímica, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). Este plasmídeo expressa mutante inativo K1906M amino-terminal de LRRK2 humano marcado com quinase 3xFLAG.</td></tr><tr><td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Este artigo. Este plasmídeo expressa o mutante N1437H FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante R1441C FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante R1441G FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante R1441H FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Este artigo. Este plasmídeo expressa o mutante R1441S FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante Y1699C FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante G2019S FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante I2020T FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Forma Série II 3110 Pipeta</td><td></td>Automática com Camisa de Água</tr><tr><td></td><td>Drummond</td><td>Micropipeta Pipet-Aid PA-400</td><td></td></tr><tr><td>P10</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-10</td><td>0.5&ndash; 10 &mu; </td></tr><tr><td>L Micropipeta P200</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-200</td><td>20&ndash; 200 &mu; L</td></tr><tr><td>Micropipeta P1000</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-1000</td><td>100- 1000 &mu; L</td></tr><tr><td>Pontas para micropipeta P10</td><td>STAR</td><td>RST-481LCRST</td><td>Pontas estéreis</td></tr><tr><td>para micropipeta P200</td><td>FUKAEKASEI</td><td>1201-705YS</td><td>Pontas estéreis</td></tr><tr><td>para micropipeta P1000</td><td>STAR</td><td>RST-4810BRST</td><td>Pipeta estéril</td></tr><tr><td>de 5 mL desportável</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td>Pipeta estéril</td></tr><tr><td>de 10 mL desportável</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td>Pipeta desportável estéril</td></tr><tr><td>de 25 mL</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td>Hematocitômetro estéril</td></tr><tr><td></td><td>Sunlead Glass</td><td>A126</td><td>Microscópio Neubeuer aprimorado</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>pratos de 10 cm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>Para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>AGC Techno Glass</td><td>3810-006</td><td>Para cultura</td></tr> <tr><td>de tecidosMisturador de vórtice</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td> Raspadores de células <td></td></tr><tr><td></td><td>Sumitomo Baquelite</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>STAR</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2323-015</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 mL</td><td>Centrífugas AGC Techno Glass</td><td>2343-050</td><td></td></tr><tr><td>TOMY</td><td></td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Greiner</td><td>655061</td><td>Não para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M2e</td><td></td></tr><tr><td>SDS&ndash; Tanques PAGE</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1010</td><td></td></tr><tr><td>Tanques de transferência</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1510B</td><td></td></tr><tr><td>Placas de gel (entalhadas)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Placas de gel (lisas)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-2</td><td></td></tr><tr><td>Espaçadores de silício</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>Pentes de 17 poços</td><td>Nihon Eido</td><td>Feito</td><td></td> sob medida</tr><tr><td>Clipes de fichário</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-15</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 5 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>21G</td><td>Terumo</td><td>NN-2138R</td><td></td></tr><tr><td>Power Station 1000 VC</td><td>ATTO</td><td>AE-8450</td><td>Fonte de alimentação para SDS&ndash; PÁGINA e transferência</td></tr><tr><td>Grandes barcos de pesagem</td><td>Ina Optika</td><td>AS-DL</td><td></td></tr><tr><td>Recipientes de plástico</td><td>AS</td><td>ONE PS CASE No.4</td><td>10 x 80 x 50 mm</td></tr><tr><td>Agitador</td><td>de balanço Titech</td><td>NR-10</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de espuma de estireno</td><td>genérico</td><td></td><td>As dimensões internas devem caber em um tanque de transferência (200 x 250 x 250 mm).</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4000</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Um gerador de imagens equipado com uma câmera CCD refrigerada para detecção de ECL</td></tr></tbody></table>

deteção de fosforilação rab10 pela atividade lrrk2 utilizando sds-page com um tag de ligação de fosfato

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutações no rico em leucina repetição quinase 2 (LRRK2) foram mostradas para ser associada com a doença de Parkinson familiar (FPD). Como ativação anormal da atividade da quinase de LRRK2 tem sido implicada na patogênese da DP, é essencial estabelecer um método para avaliar os níveis fisiológicos da atividade da quinase de LRRK2. Estudos recentes revelaram que LRRK2 fosforila membros da família Rab GTPase, incluindo Rab10, sob condições fisiológicas. Embora a fosforilação de Rab10 endógeno por LRRK2 em pilhas cultivadas pode ser detectada por espectrometria de massa, tem sido difícil detectá-lo pelo immunoblotting devido à sensibilidade pobre de anticorpos de fosforilação específicos disponíveis atualmente para Rab10. Aqui, descrevemos um simples método de detectar os níveis endógenos de fosforilação de Rab10 por LRRK2 baseado na immunoblotting utilizando sódio Dodecil sulfato poliacrilamida electroforese do gel (SDS-PAGE) combinado com uma marca de ligação de fosfato (P-tag), que é N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N «,N «- tris (piridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. O presente protocolo não só fornece um exemplo da metodologia utilizando a tag-P, mas também permite a avaliação de como mutações, bem como inibidor de tratamento/administração ou quaisquer outros fatores alteram a sinalização a jusante de LRRK2 em células e tecidos .

Superexpressão sistema: Fosforilação de HA-Rab10 por 3 × bandeira-LRRK2 em HEK293 de células:
Células HEK293 foram transfectadas com 0.266 µ g de HA-Rab10 selvagem-tipo e 1.066 µ g de 3 × bandeira-LRRK2 (mutante tipo selvagem, quinase-inativo (K1906M), ou mutantes FPD). Fosforilação de Rab10 foi examinada por P-marca SDS-PAGE seguido immunoblotting usando um anti-HA anticorpo (Figura 2). 10 µ g de prot...

O presente estudo descreve um método simples de detectar níveis endógenos de fosforilação de Rab10 pela rica em leucina repetição quinase 2.

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

O objetivo geral deste experimento é detectar a fosforilação de Rab10 por LRRK2 usando SDS-PAGE com uma etiqueta de ligação de fosfato. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa de Parkinson, como como as mutações da doença em LRRK2 afetam a fosforilação de Rab10. A principal vantagem desta técnica é que se pode ter uma estimativa aproximada da estequiometria da fosforilação de Rab10 usando um western blot simples.Muitas das etapas deste protocolo são bastante padronizadas e são descritas com detalhes suficientes pelo protocolo de texto que acompanha este vídeo. Aqui, queremos mostrar as etapas que mais se beneficiam da instrução visual. Prepare placas de células HEK293 transfectadas conforme descrito no protocolo de texto.Com as placas no gelo, aspire e descarte a mídia. Em seguida, adicione cuidadosamente dois mililitros de DPBS no canto de cada placa e balance as placas para espalhar a solução. Em seguida, remova e descarte o DPBS.Em seguida, a cada placa adicione 100 microlitros de tampão de lise. Incline a placa e use um raspador para espalhar o tampão e liberar o lisado celular. Em seguida, aspirar os lisados e transferi-los para tubos de microcentrífugas pré-resfriados em gelo e aguardar 10 minutos.Em seguida, colete lisados de células livres de detritos centrifugando os tubos e transferindo os sobrenadantes para novos tubos no gelo. Em seguida, medir as concentrações de proteínas dos lisados limpos utilizando o ensaio de Bradford. Para os dados de concentração, preparar amostras de 100 microlitros dos lisados para a análise do gel.Prepare lisados mais densos para medir o Rab10 endógeno em comparação com o Rab10 de hemaglutinina superexpresso. Termine a preparação das amostras incubando-as a 100 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, armazene as amostras abaixo de menos 20 graus Celsius até que sejam necessárias por até seis meses ou mais.Para começar, prepare as células SDS-PAGE de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, coloque o gel no tanque e prenda-o com clipes de fichário. Em seguida, encha o tanque com tampão corrido e remova as bolhas de ar nos poços e sob o gel usando uma agulha presa a uma seringa.Agora adicione cloreto de manganês às amostras e gire-as para remover os precipitados. Em seguida, carregue o gel com volumes iguais de amostra, 10 microgramas de proteína para analisar a hemaglutinina Rab10 superexpressa ou 30 microgramas de proteína para analisar o Rab10 endógeno. Carregue as pistas vazias com tampão de amostra contendo cloreto de manganês.Complemente também o marcador de peso molecular com tampão e cloreto de manganês para torná-lo o mesmo volume das amostras. Agora comece a passar o gel a 50 volts. Após a pilha de amostras, aumente a tensão para 120 para obter a separação.Quando a frente do corante atingir o fundo dos géis, mate a voltagem. Em seguida, lave o gel três vezes da seguinte maneira. Coloque o gel de separação em um banho de tampão de transferência limpo com adição de EDTA e SDS.Em seguida, deixe balançar em uma coqueteleira por 10 minutos em temperatura ambiente. Após três lavagens, execute mais uma lavagem usando tampão de transferência com SDS adicionado, mas sem EDTA. Em seguida, transfira o gel usando um tanque úmido.Carregue o tanque em uma caixa de espuma cheia de água gelada, conecte o tanque a uma fonte de alimentação e inicie a transferência. Uma transferência longa com resfriamento eficiente é essencial para o procedimento. Após a transferência, verifique a transferência colorindo a membrana com Ponceau S, seguida de uma lavagem em TBST de acordo com o protocolo de texto.Em seguida, aplique um bloco. Mergulhe a mancha em TBST leitoso e balance a mancha em uma coqueteleira por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, remova e descarte a solução de bloqueio e aplique a solução primária de anticorpos.Agora balance a membrana durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova a solução primária de anticorpos. Em seguida, lave a membrana com TBST fresco três vezes como antes.Após as lavagens, mergulhe o blot em solução de anticorpo secundário e incube a membrana em um balancim por cerca de uma hora em temperatura ambiente. Após a incubação, lave a membrana com TBST três vezes mais uma vez. Agora desenvolva a membrana.Adicione um mililitro de solução ECL a uma folha grande de filme plástico. Em seguida, coloque a membrana no ECL e vire-a rapidamente para molhar os dois lados. Em seguida, levante a membrana e deixe escorrer.Após a drenagem, deixe uma borda tocar em uma toalha de papel por cerca de cinco segundos para ajudar a eliminar o excesso de solução. Em seguida, enrole a membrana em filme transparente rígido sem rugas e transfira-a para uma bandeja preta para obter imagens. As células HEK293 foram transfectadas com hemaglutinina Rab10 do tipo selvagem e 3xFLAG-LRRK2.A quinase do tipo selvagem inativa nas mutações familiares da doença de Parkinson de LRRK2 foi testada. A co-superexpressão de LRRK2 e Rab10 resultou em uma grande mudança de banda no gel P-tag. Em contraste, a co-expressão com um mutante inativo de quinase não resultou em nenhuma alteração na mobilidade de Rab10, implicando a quinase como a causa da mudança de banda.Também como esperado, todas as mutações familiares da DP aumentaram a mudança de banda. O sistema de gel P-tag também foi usado para analisar células de fibroblastos embrionários albinos 3T3-Swiss de camundongos tratados com um inibidor de LRRK2. O deslocamento de banda correspondente ao Rab10 endógeno fosforilado desapareceu quando as células foram tratadas com GSK2578215A.O mesmo teste também foi realizado usando células A549 humanas. Nesses experimentos, a eficácia do inibidor de LRRK2 foi validada usando o anticorpo anti-p serina 935 LRRK2, que é um marcador bem estabelecido de inibição de LRRK2. Uma vez dominada, essa técnica precisa apenas de 14 minutos adicionais em comparação com um procedimento regular de western blotting, que serve para lavar géis antes da transferência.Após este procedimento, outros métodos, como espectrometria de massa, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se os mutantes FPD fosforilam o mesmo resíduo de Rab10. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa de Parkinson explorarem os níveis endógenos de fosforilação de Rab10 em células cultivadas, bem como em tecidos. Não se esqueça de que trabalhar com microcistina adicionada ao tampão de lise pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual adequados devem sempre ser tomadas durante a preparação de lisados celulares.

rab10-phosphorylation-detection-lrrk2-activity-using-sds-page-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Leucina Quinase Repita Rico 2 é uma quinase de vários domínios de grande porte, mutações em que são a causa genética mais comum da doença de Parkinson. Análise da atividade da proteína quinase tem provado ser uma ferramenta crucial na compreensão da biologia e disfunção desta proteína. Neste...

Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro</em

Este vídeo demonstra uma técnica de quantificação sensível de fosforilação de proteínas usando um ensaio pull-down de molécula única. A funcionalização do polietilenoglicol-biotina e o uso de anticorpos marcados aumentam a detecção de tirosina fosforilada com especificidade.

Ensaio pull-down de molécula única para análise de fosforilação de proteínas: uma técnica de alto rendimento para quantificar a fosforilação de proteínas no lisado celular

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são proteínas de vários domínios que codificam tanto GTPase e domínios cinase e que são fosforiladas em células. Aqui, apresentamos um protocolo para rotular LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir seus níveis gerais de fosforilação celular.

Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

Aqui descrevemos um procedimento que permite uma análise detalhada da ativação dependente de fosforilação do fator de transcrição IRF3. Isso é obtido por meio da combinação de um SDS-PAGE de alta resolução e um PAGE nativo acoplado a immunoblots usando vários anticorpos fosfoespecíficos.

Uma resolução alta Método de Monitoramento de Ativação fosforilação dependente de IRF3

Os ensaios de competição de péptidos são amplamente utilizados numa variedade de experiências moleculares e imunológicas. Este artigo descreve um método detalhado para um ensaio de quinase competitiva com oligopéptido in vitro e os procedimentos de validação associados, que podem ser úteis para encontrar locais de fosforilação específicos.

Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

Mutações no rico gene de leucina repetição quinase 2 (LRRK2) causam doença hereditária de Parkinson. Desenvolvemos um método fácil e robusto para avaliar a fosforilação controlada por LRRK2 de Rab10 em neutrófilos de sangue periféricos humanos. Isso pode ajudar a identificar indivíduos com aumento da atividade da via de quinase LRRK2.

Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano para interrogar o Caminho Associado lRRK2 Kinase de Parkinson avaliando rab10 fosforilação

O objetivo do presente protocolo é rotular, enriquecer e identificar substratos de proteína quinase CK2 de uma amostra biológica complexa como um lisado celular ou homogeneizado de tecido. Este método utiliza aspectos únicos da biologia CK2 para essa finalidade.

Identificação de substratos de quinase CK2 novela usando uma abordagem bioquímica versátil

Nós caracterizamos uma proteína nova da quinase usando aproximações bioquímicas robustas: análise ocidental do borrão com um anticorpo específico dedicado em linhas e em tecidos diferentes da pilha, interações por experimentos do coimmunoprecipitação, atividade da quinase detectada por ocidental Blot usando um anticorpo fosho-específico e por γ [32P] rotulagem ATP.

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Este protocolo descreve a quantificação rápida e altamente sensível dos dados do sensor Förster transferência de energia de ressonância (FRET), usando um analisador de FRET portáteis feitos sob medida. O dispositivo foi utilizado para detectar a maltose dentro de uma gama de temperatura crítica que maximiza a sensibilidade de detecção, permitindo a avaliação prática e eficiente do teor de açúcar.

Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

Este estudo descreve técnicas biofísicas, bioquímicos e moleculares que caracterizam a actividade acompanhante de Escherichia coli HdeB sob condições de pH ácido. Estes métodos têm sido aplicados com sucesso para outras chaperonas ácido-protectores, tais como HdeA e pode ser modificado para funcionar com os outros acompanhantes e condições de stress.

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Aprenda a detectar fosforilação de Rab10 por LRRK2 usando SDS-PAGE com tag de ligação de fosfato. Este método permite estimar a estequiometria da fosforilação em células HEK293 e investigar mutações relacionadas à doença de Parkinson.

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

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