Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

O objetivo geral deste experimento é detectar a fosforilação de Rab10 por LRRK2 usando SDS-PAGE com uma etiqueta de ligação de fosfato. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa de Parkinson, como como as mutações da doença em LRRK2 afetam a fosforilação de Rab10. A principal vantagem desta técnica é que se pode ter uma estimativa aproximada da estequiometria da fosforilação de Rab10 usando um western blot simples.

Muitas das etapas deste protocolo são bastante padronizadas e são descritas com detalhes suficientes pelo protocolo de texto que acompanha este vídeo. Aqui, queremos mostrar as etapas que mais se beneficiam da instrução visual. Prepare placas de células HEK293 transfectadas conforme descrito no protocolo de texto.

Com as placas no gelo, aspire e descarte a mídia. Em seguida, adicione cuidadosamente dois mililitros de DPBS no canto de cada placa e balance as placas para espalhar a solução. Em seguida, remova e descarte o DPBS.

Em seguida, a cada placa adicione 100 microlitros de tampão de lise. Incline a placa e use um raspador para espalhar o tampão e liberar o lisado celular. Em seguida, aspirar os lisados e transferi-los para tubos de microcentrífugas pré-resfriados em gelo e aguardar 10 minutos.

Em seguida, colete lisados de células livres de detritos centrifugando os tubos e transferindo os sobrenadantes para novos tubos no gelo. Em seguida, medir as concentrações de proteínas dos lisados limpos utilizando o ensaio de Bradford. Para os dados de concentração, preparar amostras de 100 microlitros dos lisados para a análise do gel.

Prepare lisados mais densos para medir o Rab10 endógeno em comparação com o Rab10 de hemaglutinina superexpresso. Termine a preparação das amostras incubando-as a 100 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, armazene as amostras abaixo de menos 20 graus Celsius até que sejam necessárias por até seis meses ou mais.

Para começar, prepare as células SDS-PAGE de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, coloque o gel no tanque e prenda-o com clipes de fichário. Em seguida, encha o tanque com tampão corrido e remova as bolhas de ar nos poços e sob o gel usando uma agulha presa a uma seringa.

Agora adicione cloreto de manganês às amostras e gire-as para remover os precipitados. Em seguida, carregue o gel com volumes iguais de amostra, 10 microgramas de proteína para analisar a hemaglutinina Rab10 superexpressa ou 30 microgramas de proteína para analisar o Rab10 endógeno. Carregue as pistas vazias com tampão de amostra contendo cloreto de manganês.

Complemente também o marcador de peso molecular com tampão e cloreto de manganês para torná-lo o mesmo volume das amostras. Agora comece a passar o gel a 50 volts. Após a pilha de amostras, aumente a tensão para 120 para obter a separação.

Quando a frente do corante atingir o fundo dos géis, mate a voltagem. Em seguida, lave o gel três vezes da seguinte maneira. Coloque o gel de separação em um banho de tampão de transferência limpo com adição de EDTA e SDS.

Em seguida, deixe balançar em uma coqueteleira por 10 minutos em temperatura ambiente. Após três lavagens, execute mais uma lavagem usando tampão de transferência com SDS adicionado, mas sem EDTA. Em seguida, transfira o gel usando um tanque úmido.

Carregue o tanque em uma caixa de espuma cheia de água gelada, conecte o tanque a uma fonte de alimentação e inicie a transferência. Uma transferência longa com resfriamento eficiente é essencial para o procedimento. Após a transferência, verifique a transferência colorindo a membrana com Ponceau S, seguida de uma lavagem em TBST de acordo com o protocolo de texto.

Em seguida, aplique um bloco. Mergulhe a mancha em TBST leitoso e balance a mancha em uma coqueteleira por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, remova e descarte a solução de bloqueio e aplique a solução primária de anticorpos.

Agora balance a membrana durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova a solução primária de anticorpos. Em seguida, lave a membrana com TBST fresco três vezes como antes.

Após as lavagens, mergulhe o blot em solução de anticorpo secundário e incube a membrana em um balancim por cerca de uma hora em temperatura ambiente. Após a incubação, lave a membrana com TBST três vezes mais uma vez. Agora desenvolva a membrana.

Adicione um mililitro de solução ECL a uma folha grande de filme plástico. Em seguida, coloque a membrana no ECL e vire-a rapidamente para molhar os dois lados. Em seguida, levante a membrana e deixe escorrer.

Após a drenagem, deixe uma borda tocar em uma toalha de papel por cerca de cinco segundos para ajudar a eliminar o excesso de solução. Em seguida, enrole a membrana em filme transparente rígido sem rugas e transfira-a para uma bandeja preta para obter imagens. As células HEK293 foram transfectadas com hemaglutinina Rab10 do tipo selvagem e 3xFLAG-LRRK2.

A quinase do tipo selvagem inativa nas mutações familiares da doença de Parkinson de LRRK2 foi testada. A co-superexpressão de LRRK2 e Rab10 resultou em uma grande mudança de banda no gel P-tag. Em contraste, a co-expressão com um mutante inativo de quinase não resultou em nenhuma alteração na mobilidade de Rab10, implicando a quinase como a causa da mudança de banda.

Também como esperado, todas as mutações familiares da DP aumentaram a mudança de banda. O sistema de gel P-tag também foi usado para analisar células de fibroblastos embrionários albinos 3T3-Swiss de camundongos tratados com um inibidor de LRRK2. O deslocamento de banda correspondente ao Rab10 endógeno fosforilado desapareceu quando as células foram tratadas com GSK2578215A.

O mesmo teste também foi realizado usando células A549 humanas. Nesses experimentos, a eficácia do inibidor de LRRK2 foi validada usando o anticorpo anti-p serina 935 LRRK2, que é um marcador bem estabelecido de inibição de LRRK2. Uma vez dominada, essa técnica precisa apenas de 14 minutos adicionais em comparação com um procedimento regular de western blotting, que serve para lavar géis antes da transferência.

Após este procedimento, outros métodos, como espectrometria de massa, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se os mutantes FPD fosforilam o mesmo resíduo de Rab10. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa de Parkinson explorarem os níveis endógenos de fosforilação de Rab10 em células cultivadas, bem como em tecidos. Não se esqueça de que trabalhar com microcistina adicionada ao tampão de lise pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual adequados devem sempre ser tomadas durante a preparação de lisados celulares.