Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula

O objetivo geral deste protocolo é implementar um microscópio de rastreamento de partícula única 3D em tempo real. A principal vantagem dessa técnica é que um único objeto em escala nano difusor pode ser monitorado continuamente com resolução temporal limitada por fótons. Essa técnica pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da virologia, como seguir um único vírion durante todo o processo de infecção.

Prepare o aparelho em uma mesa óptica. Esta configuração está pronta para calibração. Os principais componentes incluem um laser de estado sólido de 488 nanômetros, dois defletores eletro-ópticos que estão ao longo do caminho do feixe, uma lente de gradiente acústico ajustável e um estágio de amostra com micro e nano posicionadores.

Este esquema da configuração fornece detalhes adicionais. Aqui está o caminho do feixe de laser para o estágio de amostra. Os defletores eletro-ópticos e a lente acústica sintonizável estão ao longo do caminho do feixe.

Esses dispositivos acionam dinamicamente o ponto de laser no estágio de amostra. Os fótons da amostra são contados por um fotodiodo de avalanche. Uma câmera monitora a posição da partícula.

A posição da amostra é definida usando micro e nano controladores. Um conjunto de portas programável em campo controla o ponto do laser, o cálculo da posição das partículas em tempo real, o feedback do estágio e a contagem de fótons. Duas amostras devem ser preparadas.

O primeiro requer grânulos fluorescentes de 190 nanômetros diluídos em solução salina tamponada com fosfato. Use uma lamínula para preparar uma amostra de partícula fixa. Coloque 400 microlitros da solução de contas na lamínula.

Agora, produza a amostra de partículas em movimento livre. Requer esferas fluorescentes de 110 nanômetros diluídas em água. Crie uma amostra de partícula em movimento livre colocando 400 microlitros da solução em uma lamínula.

Leve a amostra de partícula fixa ao microscópio para montagem. A amostra está no posicionador nano XY. Ligue o laser, o fotodetector, os controladores para os elementos da linha de feixe e para os posicionadores.

Execute o posicionador Piezo nano em um circuito fechado. Em seguida, remova o filtro de emissão de fluorescência da frente do fotodetector. Em seguida, varie a posição z da amostra com o micro posicionador.

À medida que a posição varia, use o fotodetector para monitorar a intensidade da reflexão do laser. Maximize a intensidade para identificar o plano focal da lente objetiva. Com a amostra no plano focal, substitua o filtro de emissão de fluorescência.

Agora, trabalhe com o software de controle do computador. Use um software personalizado para escanear a amostra. Primeiro, defina um grande alcance de varredura, a diferença entre o início e o fim.

Aqui, o intervalo é de 10 micrômetros em Y e 10 micrômetros em X. Além disso, defina um tamanho de passo grande em cada direção. Aqui, 200 nanômetros. Defina ambos os campos Z para a posição identificada anteriormente do plano focal.

Pressionar a varredura iniciará a varredura de rasterização. Inicie a varredura. O software aciona os defletores eletro-ópticos em um passeio noturno, coleta contagens do fotodetector, aciona o nano posicionador e realiza cálculos de posição.

A varredura encontrará uma partícula identificável no software por meio de uma fluorescência de plataforma. Para cada local na varredura, o software também determinará as estimativas da posição da partícula em X e Y, em relação ao centro da varredura do defletor de objetos elétricos. Depois de encontrar a partícula, reduza o alcance de varredura ao redor dela para dois micrômetros em X e Y. Além disso, diminua o tamanho do passo para ambos para 100 nanômetros.

Adicione uma faixa de varredura na direção Z de dois micrômetros para colocar o foco fluorescente entre parênteses. Defina o tamanho do passo Z para 200 nanômetros. Inicie a varredura de varredura 3D para encontrar o foco fluorescente.

Os dados produzidos a partir da varredura mostram o plano focal antes que a lente de gradiente acústico ajustável seja ligada. Passe a trabalhar com a configuração da lente acústica ajustável em seu software de controle. Primeiro, clique em conectar e, em seguida, ligue.

Vá para a seção de controle de pulso e gating, altere o modo de disparo de saída de RGB para multiplano. Em seguida, altere-o de volta para RGB para permitir a alteração da fase de saída. Use os controles deslizantes para definir a fase de saída entre zero graus, 90 graus e 270 graus.

Em seguida, vá para a seção de controle de frequência. Lá, selecione uma frequência de ressonância de 68.500 hertz. Vá para o topo da tela e clique em avançado.

Em seguida, escolha a guia de configurações. Na nova tela, encontre a frequência máxima da coluna zero. Ajuste-o para alterar a faixa de pesquisa de frequência.

Clique em, salve a calibração e, em seguida, saia da calibração. Retorne aos controles de frequência e altere a frequência de ressonância. Altere-o imediatamente de volta para 68.500 hertz para que a calibração entre em vigor.

Na seção de controle de amplitude, use o controle deslizante para aumentar lentamente a amplitude para 35%Depois disso, clique em bloquear ressonância. Quando a frequência estiver bloqueada, clique em desbloquear ressonância. Retorne ao software de varredura raster.

Insira duas faixas de varredura micrométrica centralizadas na partícula em X e Y.Use um tamanho de passo de 100 nanômetros. Centralize a partícula em uma faixa de quatro micrômetros em Z, com um tamanho de passo de 200 nanômetros. Na imagem de varredura resultante, a região de iluminação que representa a partícula tem cerca de um micrômetro de largura.

Com base nisso, ajuste o parâmetro da escala XY para que as posições estimadas em X e Y variem de menos 0,5 a 0,5 micrômetros. Após um procedimento semelhante com a escala Z, coloque o nano posicionador na posição zero. Desligue a energia do posicionador nano antes de continuar.

Substitua a amostra de partícula fixa pela amostra de partícula em movimento livre. Em seguida, certifique-se de que todo o equipamento esteja ligado. Execute o posicionador Piezo nano em malha aberta.

No computador, defina o software da lente acústica gradiente ajustável como antes. Remova o filtro de emissão de fluorescência do caminho para o fotodetector. Encontre o plano focal variando a posição Z da amostra e maximizando a intensidade da reflexão do laser, a partir da lamínula.

Depois de encontrar o plano focal, aumente a posição de foco em 15 micrômetros na solução. Substitua o filtro de emissão de fluorescência. Abra o software de rastreamento personalizado.

Defina os parâmetros de estimativa de posição para os valores encontrados durante a otimização. Agora, defina as constantes de controle integral, que ditam a velocidade de resposta do posicionador nano. Comece com a constante X.

Insira um valor baixo e aumente-o lentamente. Quando as oscilações começarem na leitura da posição da partícula, observe o valor da constante de controle. Reduza a constante de controle integral para cerca de 70% de seu valor no início da oscilação.

Repita as etapas com as constantes de controle Y e Z. Defina o gatilho para começar a rastrear o limite da pista para três kilohertz. Defina o mínimo de rastreamento, o gatilho para encerrar o rastreamento, em 1,5 kilohertz.

Inicie o experimento clicando em pesquisar e, em seguida, clicando em rastreamento automático. Este filme mostra o resultado do uso do microscópio tridimensional de rastreamento de localização dinâmica de fótons para rastrear o movimento difusivo de uma nanopartícula fluorescente de 110 nanômetros na água. A posição da partícula, medida usando a leitura de posição do nano posicionador, é mostrada nos eixos 3D.

A inserção é a leitura da câmera científica de musgo do mar. Ele demonstra que a partícula é mantida, travada no volume focal, pelo sistema de rastreamento. A partícula foi rastreada e sua posição registrada por mais de dois minutos.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de 50 minutos, se o sistema estiver devidamente alinhado e os parâmetros de calibração definidos. Após seu desenvolvimento, essa técnica ajudará pesquisadores da área de liberação de medicamentos a explorar as vias de internalização e transporte de cargas celulares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como operar um microscópio de rastreamento de partículas únicas 3D de tempo zero.