Name: Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a implementar um microscópio de rastreamento 3D em tempo real de partícula única para virologia. Este método permite monitorar continuamente nanosondas fluorescentes e virions individuais com resolução temporal limitada por fótons.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, dos institutos nacionais de saúde, sob número de prêmio R35GM124868 e pela Duke University.

1. configuração de Layout e alinhamento
<ol>
	<li>Instalação e colimação de excitação o rastreamento a laser<ol>
		<li>Apor o laser à tabela óptico usando um monte de casa construída. A montagem é uma placa de alumínio simples com furos para a cabeça do laser e óptica mesa de montagem. O laser deve ser firmemente presa para um monte de metal para a estabilidade e a dissipação de calor. Para este trabalho, use um 488 nm laser de estado sólido para iluminação (Figura 1), embora o comprimento de onda pode ser selecionado para atender um determinado fluoróforo ou experimentar. Um fator crítico é que o comprimento de onda do laser se encaixam a escala de trabalho 2D-EOD, que é determinada principalmente pela placa de onda entre os dois defletores (Figura 1: W2). O laser de 488 nm efetivamente pode excitar a verde ou amarela proteína fluorescente (GFP/YFP), que são comuns etiquetas fluorescentes em experimentos de células vivas.</li>
		<li>Ajustar a altura do feixe de laser e direção usando um par de espelhos dieléctricos (Figura 1: M). Certifique-se de que o feixe de laser é paralelo à tabela óptica e ajustá-lo a uma altura adequada. Nota: A altura deve ser escolhida com base na plataforma do microscópio. Esta altura deve ser mantida para todos os espelhos subsequentes utilizados neste protocolo, embora isso não vai ser declarado explicitamente.</li>
		<li>Desbloqueem o feixe com um par de lentes (Figura 1: L1 e L2). As distâncias focais das lentes deve ser escolhidas com cuidado para evitar o ponto do laser sendo cortado pela abertura da 2D-EOD. Recorte é evidente por uma mudança na forma feixe do laser após a passagem com a 2D-EOD. A qualidade da colimação aqui é muito importante porque as aberrações vão ser amplificadas por lentes subsequentes e qualquer divergência deteriora o desempenho da deflexão 2D-EOD. Idealmente, Desbloqueem o feixe, centrando-se o raio de um ponto de pelo menos 20 metros de distância.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque uma pinhole (Figura 1: PH) de tamanho apropriado no foco da primeira lente de colimação (Figura 1: L1).<ol>
		<li>Escolha um tamanho adequado pinhole. O tamanho do pinhole pode ser escolhido com base no seguinte cálculo: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Onde λ é o comprimento de onda do laser, f é a distância focal da lente primeira, e D é o diâmetro do feixe de entrada.</li>
		<li>Monte o pinhole num palco 3D tradução para que ele pode ser colocado precisamente no foco da primeira lente de colimação.</li>
		<li>Ajuste a posição do pinhole. Coloque um medidor de energia do laser após o pinhole e ajustar a posição de pinhole na XYZ para maximizar a leitura do medidor de energia. Se for observado um anel de difração, bloqueá-lo com uma íris colocada antes a 2D-EOD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalação do polarizador de Glan-Thompson<ol>
		<li>Colocar o polarizador de Glan-Thompson (Figura 1: GP) após a segunda lente de colimação (Figura 1: L2) para limpar a polarização do feixe de laser. Gire o polarizador para encontrar a máxima de transmissão com o medidor de energia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalação de EODs<ol>
		<li>Use 2 EODs (Figura 1: EOD1 &amp; EOD2) para desviar o laser nas direções X e Y. Maximize a transmissão do laser, ajustando a guinada, o passo e a altura de cada EOD.</li>
		<li>Alinhe os dois EODs em relação uns aos outros usando o marcador de alinhamento fornecido pelo fabricante do lado de cada defletor.</li>
		<li>Aplica um teste padrão para o controlador da EOD-2D para inspecionar a saída da EOD. Isso pode ser visita do cavaleiro (Figura 2) via o FPGA descrito abaixo ou uma onda de seno simples fornecida por um gerador de função. Para o melhor desempenho, a deflexão por cada defletor deve ser paralela à direção X ou Y de nanopositioner o piezo. Neste sentido é ditado pela direção angular dos defletores sobre o eixo de transmissão. Para girar a direção de deflexão sem mover a 2D-EOD, coloque um prisma pomba após a EOD-2D para alinhar os eixos de deflexão para os eixos de nanopositioner piezo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalação da placa de meia onda<ol>
		<li>Coloque uma placa de meia onda (Figura 1: W1) entre o polarizador de Glan-Thompson (Figura 1: GP) e a EOD-2D para ajustar o laser entrado feixe de polarização com os eixos de deflexão da 2D-EOD. Coloque uma lente longa focal (300 mm) após a 2D-EOD e uma câmera de sCMOS no foco do laser. Em seguida, ligue o EOD-2D para gerar visita do cavaleiro descrita a seguir (Figura 2). Gire a placa de meia onda até uma distribuição uniformemente quadrado do laser é observada na câmera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalação de um feixe de gastar lente par e par de lente do relé<ol>
		<li>Colocar um par de lentes (Figura 1: L3 e L4) após a EOD-2D para expandir o feixe para preencher a abertura traseira da lente objetiva (Figura 1: OL) e outro par de lentes (Figura 1: L5 e L6) para relé do plano focal para o objectivo de microscópio. Não se esqueça de deixar espaço suficiente entre estes dois pares de lentes, como a lente de TAG será instalada entre eles em uma etapa posterior.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instale o filtro dicroico, divisor de feixe 10/90, com foco, lente, APD, objectiva e filtro de emissão de fluorescência para completar o percurso da deteção.<ol>
		<li>Instale o filtro dicroico (Figura 1: DC) para refletir o laser em direção da lente objetiva. Ajustar o laser para ir em linha reta através do centro da lente objetiva usando duas íris na parte superior e inferior de um tubo de lente longa.</li>
		<li>Instalar um divisor de feixe 10/90 (Figura 1: BS) por que 10% da luz é refletida para geração de imagens por uma câmera de sCMOS (descritas abaixo) e 90% de passes através da APD para rastreamento.</li>
		<li>Alinhe a APD. Concentre-se o laser sobre uma lamela pela lente objetiva. Use o reflexo da lamela para alinhar elementos tudo a jusante, colocando uma lamela no foco objetivo e verificar a intensidade da leitura do APD. Depois o divisor de feixe, instalar a APD lente de focalização (Figura 1: L7) seguido da APD em uma cena 3D tradução. Colocar a lente forma a reflexão do laser do objectivo atravessa o centro da lente.</li></ol></li></ol>A posição da APD pode ser otimizada ajustando a posição 3D para maximizar a intensidade da reflexão do laser sobre a lamela. A posição da APD está na posição ideal quando uma mudança da posição do detector em qualquer direção diminui a intensidade.
		<li>Instalar um filtro de emissão de fluorescência longpass (Figura 1: F) antes do divisor de feixe para remover a luz refletida e dispersa.</li>
	
	
	<li>Instalação da lente TAG<ol>
		<li>Colocar a TAG lente entre os dois pares de lentes (entre Figura 1: L4 e L5) como mencionado antes e mostrado na Figura 1. Ajuste a guinada, densidade, altura e posição lateral de forma a que o feixe passa perpendicularmente através das lentes do centro da TAG.</li>
	</ol>
	</li>

2... preparação da amostra.
<ol>
	<li>Preparação de partículas fixas<ol>
		<li>Diluir a 190 grânulos fluorescentes de nm para ~ 5 × 108 grânulos/mL em PBS. Adicionar solução de grânulos 400 µ l sobre uma lamela e montagem no suporte da amostra da fase piezoeléctrico (o volume de contas dependerá do porta-amostras; o diâmetro da câmara de titular de amostra usado aqui é de 18 mm). Para os grânulos usados aqui, PBS faz com que as partículas depositar na lamela.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação de partículas em movimento livre<ol>
		<li>Diluir a 110 grânulos fluorescentes de nm para ~ 5 × 108 grânulos/mL com água. Adicionar 400 µ l de solução de grânulos no sentido uma lamela e monte no porta-amostras da fase piezoelétrico.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. otimizar parâmetros de controle
<ol>
	<li>Raster scan partículas fixas<ol>
		<li>Colocar uma amostra de partículas fixas no microscópio.</li>
		<li>Liga o laser, micropositioner controlador, piezo nanopositioner controlador, controlador de lente de TAG e controlador de EOD. Observe que a ordem não é crítica. Execute o nanopositioner piezo em circuito fechado.</li>
		<li>Raster scan a amostra em XYZ usando um personalizado varredura programa de software (Figura S3, software disponível mediante solicitação dos autores), que dirige a 2D-EOD em uma visita cavaleiro (Figura 2), recolhe contagens da APD, dirige o piezo nanopositioner e realiza o cálculo de posição (Figura S2). O tamanho do passo é 40 nm e o intervalo de varredura é de 2 µm.<ol>
			<li>Para colocar a lamela no foco do objectivo, retire o filtro de emissão de fluorescência e usar a reflexão do laser da lamela para maximizar a intensidade do sinal em função da posição Z da micropositioner. Depois de colocar a amostra no plano focal, coloque de volta o filtro de emissão de fluorescência.</li>
			<li>Abra o programa de digitalização. Defina o intervalo de varredura e o tamanho do passo, digitando o número em 'start', 'Concluir' e 'passo'. Primeiro defina um grande intervalo de varredura e o tamanho do passo para localizar uma partícula (por exemplo, 10 x 10 µm escala com tamanho de passo 200 nm). Depois de encontrar a partícula, o intervalo de varredura de encolher e diminuir o tamanho do passo (por exemplo, 2 x 2 µm escala com tamanho de passo de 100 nm). Clique no botão de 'digitalizar' para executar uma varredura de quadriculação 3D para encontrar o foco fluorescente.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configurações de lente de marca (ver também Figura 3)<ol>
		<li>Clique sobre o software de controle de lente de TAG. Clique em 'conectar', 'alimentação ligada' sequencialmente.</li>
		<li>Para alterar a fase de saída dos sinais de gatilho, é necessário alterar o modo de gatilho de saída. Primeiro, altere o modo de 'RGB' para 'Multiplane' e depois mudar de volta. Agora a fase pode ser alterado (Figura 3b).</li>
		<li>Defina a fase de saída a ser 0 °, 90 ° e 270 °. Enquanto podem ser usadas qualquer três fases que cobrem o espaço de fase, estes três são encontrados para trabalhar bem empiricamente (Figura 3C).</li>
		<li>Selecione a configuração de frequência de 68.500 Hz.</li>
		<li>Para encontrar a frequência ideal é muitas vezes necessário alterar o intervalo de pesquisa de frequência. Clique em 'avançadas', 'configuração'. Alterar o ' Max. Freq(Hz)' da coluna 0 de 70.000 Hz Hz 71.500. Isto pode ser ajustado para qualquer faixa de frequência é apropriada. Clique em 'Salvar calibração', 'Exit calibração' (Figura 3d).</li>
		<li>Para tornar a nova calibração eficaz, alternar a ressonância para outra frequência (por exemplo, 189.150 Hz) e então volta para a configuração de frequência de 68.500 Hz (Figura 3e).</li>
		<li>Mude gradualmente a amplitude de 35%. Clique em 'Bloquear ressonância'. Após a frequência estiver bloqueada, clique em 'Desbloquear ressonância' (Figura 3e). A lente de TAG está pronta para usar agora.</li>
		<li>Para calibrar, alterar os parâmetros que são usados na estimativa para tornar a posição estimada igual à posição real, como mostrado na Figura 4e, f. entrada do intervalo de varredura de x, y, e z e, em seguida, clique o 'scan' botão para digitalizar a amostra em XYZ para mover o partícula através o ponto do laser em movimento. A posição da partícula como digitalização através do foco do laser deve concordar com a posição de partícula estimada determinada pelo loop de estimativa de posição (Figura S1). A relação entre a posição estimada e a verdadeira posição (Figura 4D) pode ser extraída imagens posição estimada (Figura 4f). Se as posições não concordar, ajuste os valores de posição do laser (ck) usado no loop de estimativa de posição (Figura S1).</li>
		<li>Alinhar a lente de TAG<ol>
			<li>Quando o controlador de lente TAG está desligado, o raster imagens de partícula (descritas abaixo) tiradas antes de instalar o lente de TAG e depois instalando lente TAG deve olhar idêntico digitalizadas. Em seguida, execute a pilha de partícula fluorescente Z digitalização movendo o objectivo com o nanopositioner de z para ajustar a posição e o ângulo da lente de TAG (Figura 4). Ajuste a posição da lente TAG até que não haja nenhum desvio nas imagens de partícula no plano XY na direção Z, que é alcançada quando não há alteração na posição XY da partícula em função da posição Z (Figura 4D). O sistema de rastreamento é pronto para uso após o alinhamento da lente TAG.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalação da câmera de sCMOS para o monitoramento de partículas<ol>
		<li>Instale uma câmera sCMOS para visualizar as partículas enquanto eles estão sendo controlados. Instale o sCMOS somente depois que todos os componentes do sistema de rastreamento foram instalados e otimizados.</li></ol></li></ol>Carregar uma amostra de partículas fluorescentes fixo sobre o microscópio e execute o programa de rastreamento para bloquear uma partícula do volume focal objectiva. Em seguida, instale a lente de distância focal de 100 mm (Figura 1: L8) e sCMOS. Ajuste a posição de sCMOS para que a imagem da partícula é focada para o ponto de menor e mais brilhante.
	
	

4. em tempo real 3D Tracking de difundir livremente nanopartículas
<ol>
	<li>Coloque o 110 nm livre movendo-se a amostra de partículas no microscópio.</li>
	<li>Liga do laser, posicionador micro controlador, piezo nanopositioner controller, controlador de lente de TAG e controlador de EOD. Execute o nanopositioner piezo em malha aberta. Defina o TAG lente software conforme item 3.2.</li>
	<li>Abrir e executar o software de rastreamento (disponível mediante solicitação dos autores). Defina a posição de parâmetros de avaliação para seus valores otimizados, que foram encontrados na secção 3.</li>
	<li>Para colocar a lamela no foco do objectivo, retire o filtro de emissão de fluorescência e usar a reflexão do laser da lamela para maximizar a intensidade do sinal em função da posição Z da micropositioner. Depois de encontrar a lamela, aumente o foco posição 15 µm para focalizar o laser longe a lamela e para a solução. Coloque de volta o filtro de emissão de fluorescência.</li>
	<li>Defina as constantes de controle integral. As constantes de controle integral podem ser definidas, começando com um valor baixo e lentamente aumentando até oscilações podem ser vistas em leituras de posição da partícula. Uma vez que as oscilações são observadas, defina as constantes de controle integral para 80% do valor causando as oscilações. Valores típicos será em torno de 0,012 para o 'ganho integral' de XY e 0,004 para o Z 'ganho integral'.</li>
	<li>Definir os limiares de rastreamento em 'Limite de faixa' e 'Mínimo faixa' e começar o experimento de controle, clicando em 'Search' e 'Auto Track'. O limiar para o rastreamento de terminação é definido ligeiramente superior ao nível de plano de fundo e o limiar para desencadeamento de rastreamento é cerca de duas vezes superior ao fundo. Aqui, o limiar para desencadeamento de rastreamento é de 3 kHz e o limiar para acabar com a trajetória é 1,5 kHz.</li>
</ol>

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<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Embora muitas variedades de 3D única partícula métodos de rastreamento têm surgido nos últimos anos, robusto acompanhamento em tempo real de difusão 3D de alta velocidade em taxas de contagem de fótons de baixa com uma configuração simples ainda é um desafio, o que limita sua aplicação biológica importante problemas. O método 3D-DyPLoT descrito em endereços este protocolo estes desafios de várias maneiras. Em primeiro lugar, as vias de excitação e deteção são simplificadas muito comparado a outras implementações fazendo ...

O surgimento de técnicas avançadas de imagem abriu uma janela para ver a estrutura cada vez mais detalhada de fenômenos celulares, todo o caminho até o nível molecular. Métodos como reconstrução óptica estocástico microscopia (Tempestade)1,2,3, localização de foto-ativado microscopia (PALM)4,5,6,7 , estruturada iluminação microscopia (SIM)8,9,10,11e estimulou a emissão depleção microscopia (STED)12,13, 14 tem ido muito além do limite de difração para entregar detalhe sem precedentes na estrutura e função das células vivas. No entanto, completo entendimento de como esses sistemas se comportam requer informações dinâmicas, bem como informações estruturais. Os métodos de super-resolução listados acima envolvem um trade-off entre resolução espacial e resolução temporal, limitando a precisão temporal com os quais processos dinâmicos podem ser sondados. Um método que fornece alta precisão espacial e resolução temporal é RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,,27,28,29. Aqui, podemos estabelecer uma distinção entre 3D-SPT tradicional30 e RT-3D-TSC tradicional 3D-SPT requer simplesmente uma séries de dados de imagem tridimensional (que podem ser adquiridos ou usando um microscópio confocal ou um microscópio de epifluorescência dada a configuração certa). 3D-SPT tradicional, as coordenadas da partícula são determinadas após a coleta de dados localizando a partícula em cada pilha de imagem e concatenando os locais em sucessivos volumes para criar uma trajetória. Para esses métodos, a resolução temporal final é determinada pela taxa de imagem volumétrica. Para microscópios confocal, isto é facilmente a escala de segundos para dezenas de segundos. Para métodos de epifluorescência, onde o caminho óptico é manipulado para que as informações de localização axial podem ser extraídas, a resolução temporal é limitada pelo tempo de exposição ou leitura a câmera. Esses métodos de epifluorescente são limitados no intervalo durante o qual axiais informações podem ser coletadas, embora recentes progressos na fase de avião de Fourier máscaras design e óptica adaptativa está ampliando esses intervalos de 10 µm ou mais31,32 , 33 , 34.
Em contraste, RT-3D-SPT não se baseia na aquisição de uma pilha de imagem 3D e encontrar partículas após o fato. Em vez disso, informações de localização em tempo real são extraídas através de detectores de ponto único e gabarito é aplicado para efetivamente "bloquear" a partícula no volume focal da lente objetiva, através do uso de um palco piezoelétrico de alta velocidade. Isto permite a medição contínua da posição da partícula limitada somente por quantos fótons podem ser coletados. Além disso, esse método permite interrogatório espectral da partícula, enquanto se move ao longo de intervalos de tempo. RT-3D-SPT em vigor as forças funciona semelhante a uma armadilha óptica força-livre para objetos de nanoescala, no qual a partícula é continuamente analisada e medida em tempo real sem a necessidade de poderes grandes do laser ou óptico. Dado que o RT-3D-SPT fornece um meio para interrogatório contínuo de objetos rápido difusiva (até 20 µm2/s)25,29 em três dimensões no fóton baixa contagem taxas20,29, 35, ele deve fornecer uma janela em processos biológicos rápidos ou transitórios como transporte intracelular, ligação ao ligante-receptor e a dinâmica extracelular dos virions único. No entanto, a este ponto, a aplicação do RT-3D-SPT tem sido limitada a um punhado de grupos de trabalho para o avanço desta tecnologia.
Uma barreira é a complexidade do layout óptico exigido por métodos de RT-3D-SPT, que são variados. Para a maioria dos métodos, o gabarito ótico é fornecido por um estágio piezoelétrico. Como os partícula faz pequenos movimentos em X, Y, ou Z, leituras de ponto único detectores são convertidos para funções de erro e alimentados em alta velocidade para um nanopositioner piezoeléctrica, que em sua vez move a amostra para neutralizar o movimento da partícula, efetivamente bloqueando-a no lugar em relação a lente objetiva. Para medir pequenos movimentos posicionais em X, Y e Z, vários pontos de excitação ou de múltiplos detectores (4 ou 5 dependendo da implementação)15,18,21 (2-4, o mais baixo do que pode ser aplicado se um bloqueio-em amplificador é usado para extrair o X e Y posição usando um giro laser ponto)25,28 são aplicadas. A sobreposição desses múltiplos pontos de deteção e emissão de dificultar os sistemas alinhar e manter.
Neste documento, apresentamos um método 3D-SPT-mira de alta velocidade com um design óptico simplificado chamado 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT usa um 2D-EOD e um TAG lente36,37,38 para mover dinamicamente um ponto laser focalizado através do volume focal objectivo em uma taxa elevada (50 kHz XY, 70 kHz Z). Combinando a posição do foco do laser e o tempo de chegada do fóton permite que a posição da partícula 3D rapidamente obtidos até no taxas de contagem de fótons de baixa. A 2D-EOD dirige o foco do laser em turnê padrão39 com um tamanho quadrado de 1 x 1 µm no plano X-Y de um cavaleiro e a lente de TAG move o foco do laser no sentido axial, com um intervalo de 2-4 µm. A posição da partícula 3D é obtida com uma estimativa de posição otimizado algoritmo29,40 em 3D. O controle do 3D dinamicamente movente do laser ponto, fotão contando do fotodiodo avalanche (APD), cálculo de posição de partículas em tempo real, gabarito estágio piezoelétrico e gravação de dados são executadas em uma disposição de porta programável do campo (FPGA).Neste protocolo, descrevemos como construir um microscópio 3D-DyPLoT passo a passo, incluindo alinhamento óptico, calibração com partículas fixas e finalmente livre de rastreamento de partículas. Como demonstração, grânulos de fluorescente 110 nm foram rastreados continuamente na água por minutos a uma hora.
O método descrito aqui é uma escolha ideal para qualquer aplicação onde se deseja monitorar continuamente uma sonda fluorescente velozes em níveis baixos de luz, incluindo vírus, nanopartículas e vesículas como endossomos. Em contraste com os métodos anteriores, há apenas uma única excitação e caminho único deteção, fazendo o alinhamento e manutenção simples. Além disso, a área grande de detecção permite que este microscópio facilmente buscar difundir rapidamente partículas, enquanto a capacidade de controlar o nível de sinal baixo (até 10KHz) faz com que este método ideal para aplicações de baixa luminosidade,29.

<table><tbody><tr><td>Defletor Eletro-óptico 2D&nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2</td></tr><tr><td>necessária Fonte de alimentação para EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>Converte saída FPGA para alta tensão para EOD</td></tr><tr><td>TAG&nbsp; Lente</td><td>TAG Optics</td><td>TAG 2.0</td><td>Usada para desviar o laser ao longo da direção axial</td></tr><tr><td>XY piezoelétrico nanoposicionador</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Usado para mover a amostra para travar a partícula no volume focal objetivo em&nbsp;</td></tr><tr><td>Z piezoelétrico nanoposiitoner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>Usado para mover a lente objetiva para seguir a partícula difusora</td></tr><tr><td>Micropositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>Usado para posicionar grosseiramente a amostra e avaliar a lente</td></tr><tr><td>objetiva</td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td><td>Alta abertura numérica necessária para melhor sensibilidade. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS câmera</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Usado para monitorar a posição da partícula</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Contagens escuras mais baixas benéficas</td></tr><tr><td>Matriz de portas programáveis em campo</td><td>National Instruments</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Laser de excitação de rastreamento</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>Lente AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td></td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarizador</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>Placa de meia onda</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lente</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>Lente</td><td>ThorLabs</td><td>Lente AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td></td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>Lente L5</td></tr><tr><td></td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>Espelho Dicróico</td><td>Chroma</td><td>ZT405 / 488/561 / 640rpc</td><td>DC</td></tr><tr><td>Filtro de Emissão de Fluorescência</td><td>Chroma</td><td>D535 / 40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 divisor de feixe</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 nm nanopartículas fluorescentes</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F / 9942</td><td></td></tr><tr><td>110 nm nanopartículas fluorescentes</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F / 10617</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo para rastreamento em tempo real 3d única partícula

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Partícula de única tridimensional em tempo real (RT-3D-SPT) de rastreamento tem o potencial de lançar luz sobre os processos rápidos, 3D em sistemas celulares. Apesar de vários métodos de RT-3D-SPT têm sido apresentados nos últimos anos, alta velocidade de rastreamento 3D difusão de partículas em taxas de contagem de fótons de baixa continua a ser um desafio. Além disso, as configurações de RT-3D-SPT são geralmente complexos e difíceis de implementar, limitando sua aplicação generalizada de problemas biológicos. Este protocolo apresenta um sistema de RT-3D-SPT chamado 3D dinâmica fóton localização de rastreamento (3D-DyPLoT), que pode acompanhar a partículas com alta velocidade difusiva (até 20 µm2/s) em taxas de contagem de fótons de baixa (abaixo de 10 kHz). 3D-DyPLoT emprega um defletor de electro-óptica 2D (2D-EOD) e uma lente gradiente acústico sintonizável (TAG) para conduzir um único foco laser ponto dinamicamente em 3D. Combinada com um algoritmo de estimativa de posição otimizada, 3D-DyPLoT pode travar em partículas única com acompanhamento de alta velocidade e localização de alta precisão. Devido à sua excitação única e layout de caminho único deteção, 3D-DyPLoT é robusto e fácil de configurar. Este protocolo discute como construir 3D-DyPLoT passo a passo. Primeiro, o layout óptico é descrito. Em seguida, o sistema é calibrado e otimizado por raster um grânulo de fluorescente 190 nm com o nanopositioner piezoeléctrica de digitalização. Finalmente, para demonstrar o 3D em tempo real, capacidade de rastreamento, grânulos de fluorescente 110 nm são controlados em água.

Partícula fixa digitalização (Figura 4) e difunde livremente 110 nm fluorescente partícula de controle (Figura 5) foram realizados seguindo o protocolo acima. A digitalização de partícula foi realizada movendo os fótons nanopositioner e bin piezoelétricos enquanto simultaneamente cálculo da partícula calcula a posição em cada ponto no scan. A imagem de varredura mostra um quadrado de intensidade mesmo (figura...

Este detalhes de protocolo a construção e operação de um microscópio de rastreamento em tempo real 3D única partícula capaz de rastreamento nanoescala fluorescente sondas em alta velocidade difusiva e taxas de contagem de fótons de baixa.

Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

O objetivo geral deste protocolo é implementar um microscópio de rastreamento de partícula única 3D em tempo real. A principal vantagem dessa técnica é que um único objeto em escala nano difusor pode ser monitorado continuamente com resolução temporal limitada por fótons. Essa técnica pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da virologia, como seguir um único vírion durante todo o processo de infecção.Prepare o aparelho em uma mesa óptica. Esta configuração está pronta para calibração. Os principais componentes incluem um laser de estado sólido de 488 nanômetros, dois defletores eletro-ópticos que estão ao longo do caminho do feixe, uma lente de gradiente acústico ajustável e um estágio de amostra com micro e nano posicionadores.Este esquema da configuração fornece detalhes adicionais. Aqui está o caminho do feixe de laser para o estágio de amostra. Os defletores eletro-ópticos e a lente acústica sintonizável estão ao longo do caminho do feixe.Esses dispositivos acionam dinamicamente o ponto de laser no estágio de amostra. Os fótons da amostra são contados por um fotodiodo de avalanche. Uma câmera monitora a posição da partícula.A posição da amostra é definida usando micr

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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