Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

O objetivo geral deste protocolo é visualizar a formação de biofilme de Candida albicans em tempo real sob condições fisiológicas do hospedeiro. Este método permite a observação da formação de biofilme à medida que se desenvolve em tempo real e pode ser usado para testar a eficácia de agentes antimicrobianos ou para avaliar mutantes genéticos. Essa técnica pode ser usada para rastrear potenciais terapêuticas quanto à atividade contra biofilmes de maneira de alto rendimento e sua eficácia pode ser medida, visualizada e comparada aos tratamentos atuais.

A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para testar a formação de biofilme sob várias condições diferentes que são de interesse para os pesquisadores. Embora este método tenha sido desenvolvido especificamente para estudar a formação de biofilme de Candida albicans, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos formadores de biofilme, incluindo outras espécies de fungos e bactérias. Para começar, prepare culturas de colônia única de diferentes cepas de C. albicans a partir de células plaqueadas em extrato de levedura peptona dextrose ou ágar médio YPD seguindo práticas microbiológicas padrão.

Em seguida, ligue o sistema microfluídico que inclui o controlador, as duas fontes de alimentação, o microscópio, a câmera e o computador conectados ao sistema. Depois que o computador carregar, abra o software que controla o sistema. Localize o número do código de barras da placa em uso e insira o número quando solicitado pelo software.

Em seguida, no módulo de controle, defina a temperatura do sistema microfluídico para 37 graus Celsius. Em seguida, clique nos poços de entrada I1, I7, I13 e I19 e flua o ar estéril através dos tubos da placa de interface por cinco minutos para remover qualquer condensação. Quando toda a condensação evaporar, coloque a placa microfluídica de 48 poços 0-20 dinas no microscópio stage.

Para um experimento de formação de biofilme de 12 horas, comece adicionando 600 microlitros de meio pré-aquecido aos poços de entrada. Abaixe lentamente a placa de interface limpa em cima da placa microfluídica de 48 poços. Em seguida, deslize a placa de interface ligeiramente para a esquerda até que os tubos estejam posicionados na parte superior dos poços de entrada e saída e estejam travados na posição.

Na seção de controle de cisalhamento do software, defina o modo de fluxo como constante e defina o cisalhamento máximo para uma dinastia por centímetro quadrado. Em seguida, clique nos poços de entrada com mídia para iniciar o fluxo de mídia dos poços de entrada para a saída, a fim de preparar o canal. Após cinco minutos de fluxo, clique no botão de parada na seção de controle de placa de poço do software.

Em seguida, remova a placa de interface e observe os poços da placa microfluídica. Apenas uma pequena gota de mídia deve ser visível nos poços de saída. Para testar cepas de C.albicans selvagens e mutantes, adicione 50 microlitros de cultura de células SC5314 de tipo selvagem em meio de aranha a dois poços de saída, adicione o mutante bcr1 em meio de aranha a dois poços de saída e adicione o mutante EFG1 em meio de aranha a dois poços de saída.

Coloque a placa de interface de volta na placa microfluídica e trave a tampa no lugar. De volta à seção de controle de cisalhamento do software, defina o modo de fluxo como constante e defina o cisalhamento máximo para dois dinos por centímetro quadrado. Clique nos poços de saída com células para iniciar o fluxo de mídia da saída para os poços de entrada para iniciar a semeadura de C. albicans.

Após três segundos, clique no botão de parada na seção de controle da placa do poço para evitar que as células entrem nos poços de entrada. Deixe as células permanecerem estacionárias sem fluxo por 10 a 20 minutos no canal de visualização para a adesão inicial da célula. Na janela do módulo de imagem, abra o módulo de aquisição multidimensional e clique na guia do estágio no menu do lado esquerdo.

Na seção de estágio, carregue a lista de estágio mestre para a placa microfluídica de 48 poços de 0-20 dinas. Em seguida, abra o ajuste de recarga de amostra e mova o estágio para os módulos de posição absoluta. No módulo de ajuste de recarga de amostra, pressione o botão ao vivo para ver uma visualização da imagem com mira.

Usando o joystick, posicione a placa do poço de forma que a ponta da seta adjacente ao viewcanal quatro se alinhe com a mira no software. Em seguida, vá para o menu de mover estágio para posição absoluta e pressione o botão definir origem. Em seguida, volte para o módulo de ajuste de recarga de amostra, clique na seção do ponto de referência inicial no menu à esquerda e carregue o arquivo para a placa microfluídica de 48 poços 0-20 dina

Na seção de platina do módulo de aquisição multidimensional, clique duas vezes na posição da platina 22.2 para aproximar a platina de visualização do microscópio e o foco da câmera ao marcador de seta visualizando o canal 22. Em seguida, use o joystick para posicionar a placa do poço de forma que a ponta da seta adjacente ao viewcanal 22 se alinhe com a mira. Copie a coordenada Y no módulo de aquisição multidimensional para a posição Y de.

2 na guia Atualizar pontos de referência do módulo de ajuste de recarga de amostra. Por fim, na guia atualizar posições do estágio do módulo de ajuste de recarga de amostra, clique em aplicar à lista de estágios do MDA. Na janela do módulo de imagem, use o módulo de aquisição multidimensional e clique na guia salvar no menu à esquerda.

Em seguida, selecione o nome do arquivo para o experimento e a pasta para armazenar as imagens adquiridas no computador. Em seguida, clique na guia timelapse e configure-a para adquirir 145 imagens no total em cinco minutos entre cada imagem. Em seguida, na guia comprimentos de onda, defina o número de comprimentos de onda para um e capture em 50% Campo claro e 50% Câmera com um tempo de exposição de 12 a 20 milissegundos.

Defina o ganho para 0,6 e o digitalizador para 20 miliHertz. Depois de definir o foco conforme descrito no protocolo de texto que acompanha, selecione adquirir para começar a capturar imagens pré-liberadas de células aderidas para todos os subestágios. Na seção de controle de cisalhamento, defina o modo de fluxo como constante e o cisalhamento máximo como um dino por centímetro quadrado.

Em seguida, clique nos poços de entrada para iniciar o fluxo de mídia dos poços de entrada para os poços de saída, a fim de remover quaisquer células não aderidas. Após cinco minutos, clique no botão de parada na seção de controle da placa do poço. Permita que uma segunda rodada de imagens seja adquirida e, em seguida, na seção de controle de cisalhamento, ajuste o fluxo máximo de cisalhamento para 0,5 dina por centímetro quadrado e confirme a alteração.

Na janela do módulo de imagem, selecione a guia ferramentas de análise e clique em revisar dados multidimensionais no menu suspenso. Em seguida, clique em selecionar arquivo base. Isso abrirá a janela de utilitários do conjunto de dados multidimensionais.

Em seguida, clique no botão selecionar diretório e escolha a pasta que foi usada para salvar o experimento. Na lista de conjuntos de dados, selecione o log do arquivo de experimento. Depois que o log for carregado, clique no botão de visualização.

Selecione o comprimento de onda clicando nas opções no menu de comprimentos de onda à esquerda e escolha a posição do palco para visualizar em um menu suspenso. Escolha a imagem a ser carregada a partir dos números na parte superior do módulo clicando com o botão direito do mouse no número da imagem. Em seguida, selecione todas as imagens para fazer um vídeo com lapso de tempo.

As imagens selecionadas serão abertas como um vídeo em uma nova janela. Clique na guia file na janela do módulo de imagem e escolha salvar como no menu suspenso. Salve o vídeo resultante como o formato de arquivo padrão.

Por fim, abra e carregue o arquivo de vídeo salvo na imagem J.In na imagem J, clique na guia do arquivo e clique em salvar como. Escolha AVI no menu suspenso e converta o arquivo em um arquivo AVI usando a conversão JPEG definida para 10 quadros por segundo. Sob condições de tipo selvagem em meios RPMI 1640, várias células aderiram fortemente ao canal.

Eles formam hifas e um biofilme espesso pode ser observado com hifas intercalantes e células de levedura. No final do experimento microfluídico, o biofilme do tipo selvagem preenche completamente esse canal de visualização. A presença de anfotericina B, no entanto, tem um efeito pronunciado na redução da formação de biofilme.

Especificamente, a aderência das células é diminuída e várias células podem ser vistas fluindo com o fluxo de cisalhamento do meio. As células de controle do tipo selvagem, desta vez cultivadas em meio de aranha, formaram um biofilme semelhante ao que acabou de ser mostrado crescendo em RPMI. Também são cultivados neste meio dois mutantes defeituosos de biofilme.

Ambas as cepas mostram formação de biofilme severamente reduzida em comparação com o controle. Nesta população celular, as células aderidas não formam hifas e o biofilme resultante é severamente defeituoso. Essa outra cepa é defeituosa na formação de biofilme e em sua capacidade de aderir ao canal.

Uma vez dominado, esse experimento pode ser configurado em menos de uma hora. Usando esse método, pode-se aprender muito sobre vários aspectos diferentes da formação do biofilme, incluindo adesão celular inicial, maturação do biofilme e dispersão celular. Este protocolo é altamente personalizável e versátil.

Ele pode ser ajustado para avaliar diferentes espécies microbianas em todos os reinos. Taxas de fluxo, temperaturas, tempos de incubação e meios também podem ser usados para estudar biofilmes de espécies mistas. É altamente recomendável que este ensaio de biofilme microfluídico como um ensaio in vitro seja utilizado antes dos testes in vivo em animais.

Em nossa experiência, os resultados deste ensaio se correlacionam muito bem com os ensaios de biofilme in vivo existentes.