Name: Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda a visualizar a formação de biofilmes de Candida albicans em tempo real usando um dispositivo microfluídico automatizado. Este método permite avaliar a eficácia de agentes antimicrobianos e mutantes genéticos em condições fisiológicas.

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Agradecemos a todos os membros do laboratório Nobile para discussões úteis sobre ensaios de biofilme. Este estudo foi suportado pelos institutos nacionais de saúde (NIH) grant R21 AI125801 (C.J.N.). DLR foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da Universidade de California Institute para o México e os Estados Unidos (UC-MEXUS) e o Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

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Clarissa J. Nobile é dos fundadores da BioSynesis, Inc., uma empresa de desenvolvimento de inibidores e diagnósticos de biofilmes de c. albicans .

O ensaio de biofilme microfluidic personalizável descrito aqui permite a visualização da formação de biofilme em tempo real em um nível de célula única quando exposto a um fluxo laminar de taxa fixa e a temperatura constante. Ele fornece um meio poderoso para estudar o desenvolvimento de biofilmes em estirpes de tipo selvagem e mutantes, e observaram os efeitos de tratamentos de agente antimicrobiano em biofilmes nas condições que imitam condições fisiológicas em situações clínicas. Ao contrário da maioria em vitro</...

Candida albicans é um comensal membro a microbiota humana, no entanto, também é um patógeno oportunista, capaz de causar infecções fúngicas superficiais e graves1,2. Uma característica de maior virulência de c. albicans é sua habilidade de forma resiliente e biofilmes resistentes aos medicamentos, comunidades de células aderiram a uma superfície e colocados em uma matriz extracelular material1,3. Biofilmes de c. albicans são altamente estruturados, contendo várias camadas de vários tipos de células (rodada brotamento levedura forma células, as células pseudohyphal ovais e células hifais tubulares)4. Desenvolvimento de biofilmes de c. albicans começa com a adesão de células de levedura-forma redonda para uma superfície (semeando o biofilme), seguida pela proliferação destas células na superfície, e em seguida a maturação do biofilme imaturo estruturar em um totalmente formado o biofilme que está rodeado por matriz extracelular material4. O biofilme maduro é predominantemente composto por células hifais alongadas que formam redes densas e comunicantes, fornecendo a estabilidade arquitetônica para o biofilme4. Durante todo o ciclo de vida do biofilme, leveduras brotamento células dispersarem o biofilme maduro e podem viajar para outras regiões do corpo para causar infecções disseminadas ou semente novas biofilmes em outros sites4,5. C. albicans pode formar biofilmes sobre superfícies bióticas, tais como superfícies mucosas e em todo o tecido do hospedeiro e em superfícies abióticas, tais como cateteres, marcapassos, próteses e articulações protéticas. Devido às propriedades recalcitrantes de biofilmes, que são extremamente difíceis de erradicar, e em muitos casos a estratégia único tratamento eficaz é a remoção do dispositivo infectado4. Assim, é crucial investigar a formação de biofilme em condições semelhantes às observadas em situações clínicas.
Existem várias críticas na vivo modelos animais utilizados para o estudo de c. albicans biofilme formação6,7,8; no entanto, estes estudos podem ser caro e demorado e são limitados pelo número de cepas e agentes antimicrobianos que podem ser testados em um determinado momento. Em vitro biofilme ensaios, por outro lado, permitir a avaliação rápida, elevado-produção de compostos antifúngicos e cepas mutantes e são muito mais cost-effective e ético que ensaios de biofilme transportados para fora no animal modelos9, 10,11,12,13,14. Aqui descrevemos um ensaio em vitro que temos desenvolvido e otimizado para observar a formação de biofilme temporalmente sob fluxo laminar, usando um dispositivo de customizable microfluidic14,15. O ensaio permite a visualização de cada etapa de formação de biofilmes, incluindo a etapa inicial de adesão, proliferação celular, maturação do biofilme e dispersão de célula. O ensaio também é útil para visualizar as alterações de morfologia celular durante o desenvolvimento de um biofilme.
Placas de microtitulação, que são normalmente utilizadas em vitro ensaios de biofilme, enquanto alto throughput, não permito para condições de fluxo controlado. Sistemas de célula tradicional fluxo laminar permitem a avaliação contínua da formação de biofilme em condições de fluxo controlado, mas estas são muitas vezes demoradas para configurar e tendem a ter limitado throughput e controle de faixa dinâmica. O dispositivo microfluidic utilizado aqui supera estas limitações através da combinação de placas de alta taxa de transferência (contendo 48 poços) com uma câmara interna de fluxo laminar e é altamente reprodutível, versátil e personalizável.
Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de um dispositivo disponível comercialmente microfluidic automatizado para avaliar a formação de biofilmes de um selvagem-tipo c. albicans Coe, os efeitos de um agente antifúngico conhecido no desenvolvimento de um biofilme e biofilme formação em duas cepas mutantes (bcr1Δ/Δ e efg1 Δ/Δ) que anteriormente foram relatados para ter o biofilme defeitos in vitro e in vivode17,16,18. O protocolo descrito pode ser usado para testar a eficácia de agentes antimicrobianos em inibir a formação de biofilme por meio do desenvolvimento de um biofilme e identificar os genes necessários para o desenvolvimento de biofilme normal selecionando bibliotecas mutantes.

<table><tbody><tr><td>BioFlux 1000z</td><td>Fluxion</td><td></td><td>Dispositivo microfluídico automatizado para análise de células vivas</td></tr><tr><td>Placa de 48 poços 0-20 dyne</td><td>Fluxion</td><td>910-0047</td><td>Placa microfluídica</td></tr><tr><td>Software de montagem</td><td>Fluxion</td><td>Versão 7.8.4.0</td><td>Software de análise de visualização</td></tr><tr><td>Software ImageJ NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Extrato de levedura</td><td>Critério</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptona</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glicose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>Critério de Caldo de Nutrientes</td><td></td><td>C6471</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-Manitol</td><td>BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>Critério de</td><td>Ágar</td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>Alças de Inoculação Estéril</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri com Tampa Transparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetes descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Papel para lentes</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca e espectrofotômetro de cubeta</td><td>BioTek</td><td>Incubadora de agitação de EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>M12820004</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização da formação de biofilmes de candida albicans , usando um dispositivo microfluidic automatizada

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans é o patógeno mais comum fúngico dos seres humanos, causando cerca de 15% dos casos de infecção hospitalar. Um atributo de grande virulência de c. albicans é sua capacidade de forma de biofilmes, comunidades estruturadas de células anexadas às superfícies bióticas e abióticas. Biofilmes de c. albicans podem formar sobre os tecidos do hospedeiro, tais como camadas da mucosa e em dispositivos médicos, tais como cateteres, marcapassos, próteses e próteses conjuntas. Biofilmes representam desafios clínicos significativos porque eles são altamente resistentes a perturbações físicas e químicas e podem atuar como reservatórios para semente infecções disseminadas. Vários ensaios de em vitro têm sido utilizados para estudar a formação de biofilmes de c. albicans , tais como ensaios de placa de microtitulação, medições de peso seco, ensaios de viabilidade celular e microscopia confocal de varredura do laser. Todos estes ensaios são ensaios de único ponto de extremidade, onde a formação de biofilme é avaliada em um ponto específico de tempo. Aqui, descrevemos um protocolo para estudar a formação de biofilme em tempo real usando um dispositivo automatizado microfluidic sob condições de fluxo laminar. Este método permite a observação da formação de biofilmes como o biofilme se desenvolve ao longo do tempo, usando condições personalizáveis que imitam os do hospedeiro, tais como aqueles encontrados em cateteres vasculares. Este protocolo pode ser usado para avaliar os defeitos de biofilme de mutantes genéticos, bem como os efeitos inibitórios dos agentes antimicrobianos no desenvolvimento do biofilme em tempo real.

Realizamos o ensaio biofilme microfluidic descrito aqui usando um selvagem-tipo tensão de c. albicans em condições dois media (mídia RPMI-1640 e aranha), a estirpe selvagem-tipo, na presença do conhecido antifúngico anfotericina B (16 µ g/mL) em RPMI, e duas cepas mutantes anteriormente relataram para ter defeitos na formação de biofilme (bcr1Δ/Δ e efg1 Δ/Δ) na mídia de aranha.
Vídeo 1 mostra o desenvo...

Este protocolo descreve o uso de um dispositivo personalizável microfluidic automatizado para visualizar a formação de biofilmes de Candida albicans sob condições fisiológicas do hospedeiro.

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

O objetivo geral deste protocolo é visualizar a formação de biofilme de Candida albicans em tempo real sob condições fisiológicas do hospedeiro. Este método permite a observação da formação de biofilme à medida que se desenvolve em tempo real e pode ser usado para testar a eficácia de agentes antimicrobianos ou para avaliar mutantes genéticos. Essa técnica pode ser usada para rastrear potenciais terapêuticas quanto à atividade contra biofilmes de maneira de alto rendimento e sua eficácia pode ser medida, visualizada e comparada aos tratamentos atuais.A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para testar a formação de biofilme sob várias condições diferentes que são de interesse para os pesquisadores. Embora este método tenha sido desenvolvido especificamente para estudar a formação de biofilme de Candida albicans, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos formadores de biofilme, incluindo outras espécies de fungos e bactérias. Para começar, prepare culturas de colônia única de diferentes cepas de C. albicans a partir de células plaqueadas em extrato de levedura peptona dextrose ou ágar médio YPD seguindo práticas microbiológicas padrão.Em seguida, ligue

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Imunologia e Infecção

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A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

Nós desenvolvemos uma plataforma de microarray de alta densidade que consiste em 3D nano-biofilmes...

Candida albicans biofilme Chip (Ca BChip) para seleção de alto rendimento antifúngico

Fonte: Kurz, D. L., et al. Plataforma microfluídica para estudar bioentupimento em meios porosos. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra o uso de um dispositivo microfluídico para estudar a formação de biofilmes. Uma suspensão bacteriana é introduzida no microcanal, seguida de incubação para permitir o desenvolvimento do biofilme. O fluxo é então retomado, e o monitoramento de pressão junto com imagens é usado para detectar formação de biofilme e obstrução dos poros ao longo do tempo.

Um dispositivo microfluídico para imagem em tempo real e acompanhamento de pressão durante a formação do biofilme

Este vídeo demonstra o desenvolvimento de um modelo de camundongo in vivo para estudar a formação de biofilme de Candida albicans no tecido subcutâneo. O experimento envolve a implantação de dispositivos infectados com Candida na região posterior do animal para o desenvolvimento de biofilme.

Candida albicans Formação de biofilme em um modelo de camundongo in vivo

Este vídeo descreve um método para cultivar e analisar qualitativamente biofilmes bacterianos em hifas fúngicas usando microscopia. Os biofilmes bacterianos freqüentemente se formam em superfícies fúngicas e envolvem vários processos de interação bactéria-fungo, como cooperação metabólica, competição ou predação.

Um método de preparação de amostras para visualizar bactérias formadoras de biofilme em hifas fúngicas

Protocolos para o estudo da formação de biofilme em um dispositivo microfluídico que imita meios porosos são discutidos. O dispositivo microfluídico consiste em uma matriz de micro-pilares e a formação de biofilme por Pseudomonas fluorescens neste dispositivo é investigada.

Protocolo para a formação de biofilme Streamer em um dispositivo micro com micro-pilares

Apresentamos um procedimento experimental de desenvolvimento de biofilme de Candida albicans em um modelo subcutâneo de camundongo. Os biofilmes fúngicos foram quantificados pela determinação do número de unidades formadoras de colônias e por uma imagem de bioluminescência não invasiva, onde a quantidade de luz produzida corresponde ao número de células viáveis.

Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

O objectivo deste trabalho é métodos para descrever o uso de um sistema de microfluidos para o desenvolvimento de biofilmes multi-espécies que contêm espécies normalmente identificados na placa dental supragengival humano. Métodos para descrever arquitetura biofilme, a viabilidade de biofilme, e uma abordagem para a colheita de biofilme para análises dependentes de cultura ou independentes de cultivo são realçados.

A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

Este protocolo descreve um novo método para crescer e qualitativamente analisar biofilme bacteriano sobre hifas fúngicas por microscopia confocal e eletrônica.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Descrevemos a montagem, operação, e limpeza de um aparelho de fluxo projetado para formação de biofilmes fúngicas de imagem em tempo real enquanto sob fluxo. Também fornecemos e discutir algoritmos quantitativos para ser usado nas imagens adquiridas.

Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação

Para visualizar e quantificar as características internas dos biofilmes candida albicans, preparamos amostras intactas fixas que são esclarecidas pela correspondência de índice simétrico. Em seguida, a microscopia de secção óptica pode ser usada para obter dados de imagem tridimensionais, embora a espessura total do biofilme.

Esclarecendo e Imagem Candida albicans Biofilmes

Aprenda a visualizar a formação de biofilmes de Candida albicans em tempo real usando um dispositivo microfluídico automatizado. Este método permite avaliar a eficácia de agentes antimicrobianos e mutantes genéticos em condições fisiológicas.

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

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