Name: Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda a visualizar a formação de biofilmes de Candida albicans em tempo real usando um dispositivo microfluídico automatizado. Este método permite avaliar a eficácia de agentes antimicrobianos e mutantes genéticos em condições fisiológicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a todos os membros do laboratório Nobile para discussões úteis sobre ensaios de biofilme. Este estudo foi suportado pelos institutos nacionais de saúde (NIH) grant R21 AI125801 (C.J.N.). DLR foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da Universidade de California Institute para o México e os Estados Unidos (UC-MEXUS) e o Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

<ol><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Biofilms+and+Human+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Biofilms and Human Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).</li>
<li>Kojic, E. M., Darouiche, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+infections+of+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida infections of medical devices.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).</li>
<li>Fox, E. P., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFox%2C+EP+%22Candida+albicans%3A+Symptoms%2C+Causes+and+Treatment+Options%22">Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options</a>. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).</li>
<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms%3A+development%2C+regulation%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).</li>
<li>Uppuluri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+as+an+important+step+in+the+Candida+albicans+biofilm+developmental+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000828(2010).</li>
<li>Andes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vivo+central+venous+catheter+Candida+albicans+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model.</a> Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).</li>
<li>Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+in+vivo+Candida+albicans+biofilm+denture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model.</a> Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).</li>
<li>Nett, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+indwelling+urinary+catheter+model+of+Candida+albicans+biofilm+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection.</a> Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).</li>
<li>Krom, B. P., Willems, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Models+for+Candida+Biofilm+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In Vitro Models for Candida Biofilm Development.</a> Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).</li>
<li>Hawser, S. P., Douglas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Candida+species+on+the+surface+of+catheter+materials+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro.</a> Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).</li>
<li>Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+Candida+biofilm+microtiter+plate+model+for+measurement+of+antifungal+susceptibility+by+tetrazolium+salt+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay.</a> J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).</li>
<li>Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+candidal+biofilm+microtiter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized candidal biofilm microtiter assay.</a> J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).</li>
<li>Lohse, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+Optimizations+of+Candida+albicans+In+Vitro+Biofilm+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).</li>
<li>Winter, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Identification+of+Biofilm-Specific+Proteolysis+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans.</a> mBio. 7 (5), (2016).</li>
<li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li>
<li>Fox, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+regulatory+network+temporally+controls+Candida+albicans+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li>
<li>Baker, K. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/link/atbench2.htm">At the bench: A laboratory navigator</a>. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Clarissa J. Nobile é dos fundadores da BioSynesis, Inc., uma empresa de desenvolvimento de inibidores e diagnósticos de biofilmes de c. albicans .

O ensaio de biofilme microfluidic personalizável descrito aqui permite a visualização da formação de biofilme em tempo real em um nível de célula única quando exposto a um fluxo laminar de taxa fixa e a temperatura constante. Ele fornece um meio poderoso para estudar o desenvolvimento de biofilmes em estirpes de tipo selvagem e mutantes, e observaram os efeitos de tratamentos de agente antimicrobiano em biofilmes nas condições que imitam condições fisiológicas em situações clínicas. Ao contrário da maioria em vitro</...

Candida albicans é um comensal membro a microbiota humana, no entanto, também é um patógeno oportunista, capaz de causar infecções fúngicas superficiais e graves1,2. Uma característica de maior virulência de c. albicans é sua habilidade de forma resiliente e biofilmes resistentes aos medicamentos, comunidades de células aderiram a uma superfície e colocados em uma matriz extracelular material1,3. Biofilmes de c. albicans são altamente estruturados, contendo várias camadas de vários tipos de células (rodada brotamento levedura forma células, as células pseudohyphal ovais e células hifais tubulares)4. Desenvolvimento de biofilmes de c. albicans começa com a adesão de células de levedura-forma redonda para uma superfície (semeando o biofilme), seguida pela proliferação destas células na superfície, e em seguida a maturação do biofilme imaturo estruturar em um totalmente formado o biofilme que está rodeado por matriz extracelular material4. O biofilme maduro é predominantemente composto por células hifais alongadas que formam redes densas e comunicantes, fornecendo a estabilidade arquitetônica para o biofilme4. Durante todo o ciclo de vida do biofilme, leveduras brotamento células dispersarem o biofilme maduro e podem viajar para outras regiões do corpo para causar infecções disseminadas ou semente novas biofilmes em outros sites4,5. C. albicans pode formar biofilmes sobre superfícies bióticas, tais como superfícies mucosas e em todo o tecido do hospedeiro e em superfícies abióticas, tais como cateteres, marcapassos, próteses e articulações protéticas. Devido às propriedades recalcitrantes de biofilmes, que são extremamente difíceis de erradicar, e em muitos casos a estratégia único tratamento eficaz é a remoção do dispositivo infectado4. Assim, é crucial investigar a formação de biofilme em condições semelhantes às observadas em situações clínicas.
Existem várias críticas na vivo modelos animais utilizados para o estudo de c. albicans biofilme formação6,7,8; no entanto, estes estudos podem ser caro e demorado e são limitados pelo número de cepas e agentes antimicrobianos que podem ser testados em um determinado momento. Em vitro biofilme ensaios, por outro lado, permitir a avaliação rápida, elevado-produção de compostos antifúngicos e cepas mutantes e são muito mais cost-effective e ético que ensaios de biofilme transportados para fora no animal modelos9, 10,11,12,13,14. Aqui descrevemos um ensaio em vitro que temos desenvolvido e otimizado para observar a formação de biofilme temporalmente sob fluxo laminar, usando um dispositivo de customizable microfluidic14,15. O ensaio permite a visualização de cada etapa de formação de biofilmes, incluindo a etapa inicial de adesão, proliferação celular, maturação do biofilme e dispersão de célula. O ensaio também é útil para visualizar as alterações de morfologia celular durante o desenvolvimento de um biofilme.
Placas de microtitulação, que são normalmente utilizadas em vitro ensaios de biofilme, enquanto alto throughput, não permito para condições de fluxo controlado. Sistemas de célula tradicional fluxo laminar permitem a avaliação contínua da formação de biofilme em condições de fluxo controlado, mas estas são muitas vezes demoradas para configurar e tendem a ter limitado throughput e controle de faixa dinâmica. O dispositivo microfluidic utilizado aqui supera estas limitações através da combinação de placas de alta taxa de transferência (contendo 48 poços) com uma câmara interna de fluxo laminar e é altamente reprodutível, versátil e personalizável.
Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de um dispositivo disponível comercialmente microfluidic automatizado para avaliar a formação de biofilmes de um selvagem-tipo c. albicans Coe, os efeitos de um agente antifúngico conhecido no desenvolvimento de um biofilme e biofilme formação em duas cepas mutantes (bcr1Δ/Δ e efg1 Δ/Δ) que anteriormente foram relatados para ter o biofilme defeitos in vitro e in vivode17,16,18. O protocolo descrito pode ser usado para testar a eficácia de agentes antimicrobianos em inibir a formação de biofilme por meio do desenvolvimento de um biofilme e identificar os genes necessários para o desenvolvimento de biofilme normal selecionando bibliotecas mutantes.

<table><tbody><tr><td>BioFlux 1000z</td><td>Fluxion</td><td></td><td>Dispositivo microfluídico automatizado para análise de células vivas</td></tr><tr><td>Placa de 48 poços 0-20 dyne</td><td>Fluxion</td><td>910-0047</td><td>Placa microfluídica</td></tr><tr><td>Software de montagem</td><td>Fluxion</td><td>Versão 7.8.4.0</td><td>Software de análise de visualização</td></tr><tr><td>Software ImageJ NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Extrato de levedura</td><td>Critério</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptona</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glicose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>Critério de Caldo de Nutrientes</td><td></td><td>C6471</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-Manitol</td><td>BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>Critério de</td><td>Ágar</td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>Alças de Inoculação Estéril</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri com Tampa Transparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetes descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Papel para lentes</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca e espectrofotômetro de cubeta</td><td>BioTek</td><td>Incubadora de agitação de EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>M12820004</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização da formação de biofilmes de candida albicans , usando um dispositivo microfluidic automatizada

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans é o patógeno mais comum fúngico dos seres humanos, causando cerca de 15% dos casos de infecção hospitalar. Um atributo de grande virulência de c. albicans é sua capacidade de forma de biofilmes, comunidades estruturadas de células anexadas às superfícies bióticas e abióticas. Biofilmes de c. albicans podem formar sobre os tecidos do hospedeiro, tais como camadas da mucosa e em dispositivos médicos, tais como cateteres, marcapassos, próteses e próteses conjuntas. Biofilmes representam desafios clínicos significativos porque eles são altamente resistentes a perturbações físicas e químicas e podem atuar como reservatórios para semente infecções disseminadas. Vários ensaios de em vitro têm sido utilizados para estudar a formação de biofilmes de c. albicans , tais como ensaios de placa de microtitulação, medições de peso seco, ensaios de viabilidade celular e microscopia confocal de varredura do laser. Todos estes ensaios são ensaios de único ponto de extremidade, onde a formação de biofilme é avaliada em um ponto específico de tempo. Aqui, descrevemos um protocolo para estudar a formação de biofilme em tempo real usando um dispositivo automatizado microfluidic sob condições de fluxo laminar. Este método permite a observação da formação de biofilmes como o biofilme se desenvolve ao longo do tempo, usando condições personalizáveis que imitam os do hospedeiro, tais como aqueles encontrados em cateteres vasculares. Este protocolo pode ser usado para avaliar os defeitos de biofilme de mutantes genéticos, bem como os efeitos inibitórios dos agentes antimicrobianos no desenvolvimento do biofilme em tempo real.

Realizamos o ensaio biofilme microfluidic descrito aqui usando um selvagem-tipo tensão de c. albicans em condições dois media (mídia RPMI-1640 e aranha), a estirpe selvagem-tipo, na presença do conhecido antifúngico anfotericina B (16 µ g/mL) em RPMI, e duas cepas mutantes anteriormente relataram para ter defeitos na formação de biofilme (bcr1Δ/Δ e efg1 Δ/Δ) na mídia de aranha.
Vídeo 1 mostra o desenvo...

Este protocolo descreve o uso de um dispositivo personalizável microfluidic automatizado para visualizar a formação de biofilmes de Candida albicans sob condições fisiológicas do hospedeiro.

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

O objetivo geral deste protocolo é visualizar a formação de biofilme de Candida albicans em tempo real sob condições fisiológicas do hospedeiro. Este método permite a observação da formação de biofilme à medida que se desenvolve em tempo real e pode ser usado para testar a eficácia de agentes antimicrobianos ou para avaliar mutantes genéticos. Essa técnica pode ser usada para rastrear potenciais terapêuticas quanto à atividade contra biofilmes de maneira de alto rendimento e sua eficácia pode ser medida, visualizada e comparada aos tratamentos atuais.A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para testar a formação de biofilme sob várias condições diferentes que são de interesse para os pesquisadores. Embora este método tenha sido desenvolvido especificamente para estudar a formação de biofilme de Candida albicans, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos formadores de biofilme, incluindo outras espécies de fungos e bactérias. Para começar, prepare culturas de colônia única de diferentes cepas de C. albicans a partir de células plaqueadas em extrato de levedura peptona dextrose ou ágar médio YPD seguindo práticas microbiológicas padrão.Em seguida, ligue o sistema microfluídico que inclui o controlador, as duas fontes de alimentação, o microscópio, a câmera e o computador conectados ao sistema. Depois que o computador carregar, abra o software que controla o sistema. Localize o número do código de barras da placa em uso e insira o número quando solicitado pelo software.Em seguida, no módulo de controle, defina a temperatura do sistema microfluídico para 37 graus Celsius. Em seguida, clique nos poços de entrada I1, I7, I13 e I19 e flua o ar estéril através dos tubos da placa de interface por cinco minutos para remover qualquer condensação. Quando toda a condensação evaporar, coloque a placa microfluídica de 48 poços 0-20 dinas no microscópio stage.Para um experimento de formação de biofilme de 12 horas, comece adicionando 600 microlitros de meio pré-aquecido aos poços de entrada. Abaixe lentamente a placa de interface limpa em cima da placa microfluídica de 48 poços. Em seguida, deslize a placa de interface ligeiramente para a esquerda até que os tubos estejam posicionados na parte superior dos poços de entrada e saída e estejam travados na posição.Na seção de controle de cisalhamento do software, defina o modo de fluxo como constante e defina o cisalhamento máximo para uma dinastia por centímetro quadrado. Em seguida, clique nos poços de entrada com mídia para iniciar o fluxo de mídia dos poços de entrada para a saída, a fim de preparar o canal. Após cinco minutos de fluxo, clique no botão de parada na seção de controle de placa de poço do software.Em seguida, remova a placa de interface e observe os poços da placa microfluídica. Apenas uma pequena gota de mídia deve ser visível nos poços de saída. Para testar cepas de C.albicans selvagens e mutantes, adicione 50 microlitros de cultura de células SC5314 de tipo selvagem em meio de aranha a dois poços de saída, adicione o mutante bcr1 em meio de aranha a dois poços de saída e adicione o mutante EFG1 em meio de aranha a dois poços de saída.Coloque a placa de interface de volta na placa microfluídica e trave a tampa no lugar. De volta à seção de controle de cisalhamento do software, defina o modo de fluxo como constante e defina o cisalhamento máximo para dois dinos por centímetro quadrado. Clique nos poços de saída com células para iniciar o fluxo de mídia da saída para os poços de entrada para iniciar a semeadura de C. albicans.Após três segundos, clique no botão de parada na seção de controle da placa do poço para evitar que as células entrem nos poços de entrada. Deixe as células permanecerem estacionárias sem fluxo por 10 a 20 minutos no canal de visualização para a adesão inicial da célula. Na janela do módulo de imagem, abra o módulo de aquisição multidimensional e clique na guia do estágio no menu do lado esquerdo.Na seção de estágio, carregue a lista de estágio mestre para a placa microfluídica de 48 poços de 0-20 dinas. Em seguida, abra o ajuste de recarga de amostra e mova o estágio para os módulos de posição absoluta. No módulo de ajuste de recarga de amostra, pressione o botão ao vivo para ver uma visualização da imagem com mira.Usando o joystick, posicione a placa do poço de forma que a ponta da seta adjacente ao viewcanal quatro se alinhe com a mira no software. Em seguida, vá para o menu de mover estágio para posição absoluta e pressione o botão definir origem. Em seguida, volte para o módulo de ajuste de recarga de amostra, clique na seção do ponto de referência inicial no menu à esquerda e carregue o arquivo para a placa microfluídica de 48 poços 0-20 dina.Na seção de platina do módulo de aquisição multidimensional, clique duas vezes na posição da platina 22.2 para aproximar a platina de visualização do microscópio e o foco da câmera ao marcador de seta visualizando o canal 22. Em seguida, use o joystick para posicionar a placa do poço de forma que a ponta da seta adjacente ao viewcanal 22 se alinhe com a mira. Copie a coordenada Y no módulo de aquisição multidimensional para a posição Y de.2 na guia Atualizar pontos de referência do módulo de ajuste de recarga de amostra. Por fim, na guia atualizar posições do estágio do módulo de ajuste de recarga de amostra, clique em aplicar à lista de estágios do MDA. Na janela do módulo de imagem, use o módulo de aquisição multidimensional e clique na guia salvar no menu à esquerda.Em seguida, selecione o nome do arquivo para o experimento e a pasta para armazenar as imagens adquiridas no computador. Em seguida, clique na guia timelapse e configure-a para adquirir 145 imagens no total em cinco minutos entre cada imagem. Em seguida, na guia comprimentos de onda, defina o número de comprimentos de onda para um e capture em 50% Campo claro e 50% Câmera com um tempo de exposição de 12 a 20 milissegundos.Defina o ganho para 0,6 e o digitalizador para 20 miliHertz. Depois de definir o foco conforme descrito no protocolo de texto que acompanha, selecione adquirir para começar a capturar imagens pré-liberadas de células aderidas para todos os subestágios. Na seção de controle de cisalhamento, defina o modo de fluxo como constante e o cisalhamento máximo como um dino por centímetro quadrado.Em seguida, clique nos poços de entrada para iniciar o fluxo de mídia dos poços de entrada para os poços de saída, a fim de remover quaisquer células não aderidas. Após cinco minutos, clique no botão de parada na seção de controle da placa do poço. Permita que uma segunda rodada de imagens seja adquirida e, em seguida, na seção de controle de cisalhamento, ajuste o fluxo máximo de cisalhamento para 0,5 dina por centímetro quadrado e confirme a alteração.Na janela do módulo de imagem, selecione a guia ferramentas de análise e clique em revisar dados multidimensionais no menu suspenso. Em seguida, clique em selecionar arquivo base. Isso abrirá a janela de utilitários do conjunto de dados multidimensionais.Em seguida, clique no botão selecionar diretório e escolha a pasta que foi usada para salvar o experimento. Na lista de conjuntos de dados, selecione o log do arquivo de experimento. Depois que o log for carregado, clique no botão de visualização.Selecione o comprimento de onda clicando nas opções no menu de comprimentos de onda à esquerda e escolha a posição do palco para visualizar em um menu suspenso. Escolha a imagem a ser carregada a partir dos números na parte superior do módulo clicando com o botão direito do mouse no número da imagem. Em seguida, selecione todas as imagens para fazer um vídeo com lapso de tempo.As imagens selecionadas serão abertas como um vídeo em uma nova janela. Clique na guia file na janela do módulo de imagem e escolha salvar como no menu suspenso. Salve o vídeo resultante como o formato de arquivo padrão.Por fim, abra e carregue o arquivo de vídeo salvo na imagem J.In na imagem J, clique na guia do arquivo e clique em salvar como. Escolha AVI no menu suspenso e converta o arquivo em um arquivo AVI usando a conversão JPEG definida para 10 quadros por segundo. Sob condições de tipo selvagem em meios RPMI 1640, várias células aderiram fortemente ao canal.Eles formam hifas e um biofilme espesso pode ser observado com hifas intercalantes e células de levedura. No final do experimento microfluídico, o biofilme do tipo selvagem preenche completamente esse canal de visualização. A presença de anfotericina B, no entanto, tem um efeito pronunciado na redução da formação de biofilme.Especificamente, a aderência das células é diminuída e várias células podem ser vistas fluindo com o fluxo de cisalhamento do meio. As células de controle do tipo selvagem, desta vez cultivadas em meio de aranha, formaram um biofilme semelhante ao que acabou de ser mostrado crescendo em RPMI. Também são cultivados neste meio dois mutantes defeituosos de biofilme.Ambas as cepas mostram formação de biofilme severamente reduzida em comparação com o controle. Nesta população celular, as células aderidas não formam hifas e o biofilme resultante é severamente defeituoso. Essa outra cepa é defeituosa na formação de biofilme e em sua capacidade de aderir ao canal.Uma vez dominado, esse experimento pode ser configurado em menos de uma hora. Usando esse método, pode-se aprender muito sobre vários aspectos diferentes da formação do biofilme, incluindo adesão celular inicial, maturação do biofilme e dispersão celular. Este protocolo é altamente personalizável e versátil.Ele pode ser ajustado para avaliar diferentes espécies microbianas em todos os reinos. Taxas de fluxo, temperaturas, tempos de incubação e meios também podem ser usados para estudar biofilmes de espécies mistas. É altamente recomendável que este ensaio de biofilme microfluídico como um ensaio in vitro seja utilizado antes dos testes in vivo em animais.Em nossa experiência, os resultados deste ensaio se correlacionam muito bem com os ensaios de biofilme in vivo existentes.

visualization-biofilm-formation-candida-albicans-using-an-automated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós descrevemos um método simples, rápido e robusto para a formação...

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

Nós desenvolvemos uma plataforma de microarray de alta densidade que consiste em 3D nano-biofilmes...

Candida albicans biofilme Chip (Ca BChip) para seleção de alto rendimento antifúngico

Fonte: Kurz, D. L., et al. Plataforma microfluídica para estudar bioentupimento em meios porosos. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra o uso de um dispositivo microfluídico para estudar a formação de biofilmes. Uma suspensão bacteriana é introduzida no microcanal, seguida de incubação para permitir o desenvolvimento do biofilme. O fluxo é então retomado, e o monitoramento de pressão junto com imagens é usado para detectar formação de biofilme e obstrução dos poros ao longo do tempo.

Um dispositivo microfluídico para imagem em tempo real e acompanhamento de pressão durante a formação do biofilme

Este vídeo demonstra o desenvolvimento de um modelo de camundongo in vivo para estudar a formação de biofilme de Candida albicans no tecido subcutâneo. O experimento envolve a implantação de dispositivos infectados com Candida na região posterior do animal para o desenvolvimento de biofilme.

Candida albicans Formação de biofilme em um modelo de camundongo in vivo

Este vídeo descreve um método para cultivar e analisar qualitativamente biofilmes bacterianos em hifas fúngicas usando microscopia. Os biofilmes bacterianos freqüentemente se formam em superfícies fúngicas e envolvem vários processos de interação bactéria-fungo, como cooperação metabólica, competição ou predação.

Um método de preparação de amostras para visualizar bactérias formadoras de biofilme em hifas fúngicas

Protocolos para o estudo da formação de biofilme em um dispositivo microfluídico que imita meios porosos são discutidos. O dispositivo microfluídico consiste em uma matriz de micro-pilares e a formação de biofilme por Pseudomonas fluorescens neste dispositivo é investigada.

Protocolo para a formação de biofilme Streamer em um dispositivo micro com micro-pilares

Apresentamos um procedimento experimental de desenvolvimento de biofilme de Candida albicans em um modelo subcutâneo de camundongo. Os biofilmes fúngicos foram quantificados pela determinação do número de unidades formadoras de colônias e por uma imagem de bioluminescência não invasiva, onde a quantidade de luz produzida corresponde ao número de células viáveis.

Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

O objectivo deste trabalho é métodos para descrever o uso de um sistema de microfluidos para o desenvolvimento de biofilmes multi-espécies que contêm espécies normalmente identificados na placa dental supragengival humano. Métodos para descrever arquitetura biofilme, a viabilidade de biofilme, e uma abordagem para a colheita de biofilme para análises dependentes de cultura ou independentes de cultivo são realçados.

A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

Este protocolo descreve um novo método para crescer e qualitativamente analisar biofilme bacteriano sobre hifas fúngicas por microscopia confocal e eletrônica.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Descrevemos a montagem, operação, e limpeza de um aparelho de fluxo projetado para formação de biofilmes fúngicas de imagem em tempo real enquanto sob fluxo. Também fornecemos e discutir algoritmos quantitativos para ser usado nas imagens adquiridas.

Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação

Para visualizar e quantificar as características internas dos biofilmes candida albicans, preparamos amostras intactas fixas que são esclarecidas pela correspondência de índice simétrico. Em seguida, a microscopia de secção óptica pode ser usada para obter dados de imagem tridimensionais, embora a espessura total do biofilme.

Esclarecendo e Imagem Candida albicans Biofilmes

Aprenda a visualizar a formação de biofilmes de Candida albicans em tempo real usando um dispositivo microfluídico automatizado. Este método permite avaliar a eficácia de agentes antimicrobianos e mutantes genéticos em condições fisiológicas.

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Explorar mais vídeos