Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

O objetivo geral desta configuração experimental é delinear as principais camadas de regulação de RNA e DNA para descobrir os principais mecanismos moleculares que ocorrem em resposta a um estímulo ou tratamento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em muitos campos biológicos diferentes, como respostas imunes em geral, mas também respostas moleculares ao tratamento medicamentoso. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite exibir simultaneamente várias camadas de regulação gênica ao longo do tempo.

Portanto, é importante usar o mesmo conjunto de células para cada método. De um modo geral, esses três protocolos envolvem primeiro a manipulação de células de interesse para diferentes pontos de tempo. Após cada manipulação, as células são agrupadas e divididas em três grupos, um para cada ensaio.

Esta seção do vídeo descreve a rotulagem e purificação das transcrições produzidas mais recentemente usando a rotulagem 4sU. Cada protocolo produz amostras prontas para sequenciamento. Primeiro, procure a concentração de 4sU necessária e o tempo de incubação necessário para a linha celular de interesse.

Por exemplo, 200 micromolares 4sU são usados em células T por uma hora. Separe o conjunto de células após o tratamento em um prato separado para cada método e ponto de tempo. Em seguida, descongele completamente o número necessário de alíquotas de 4sU e adicione o 4sU diretamente ao meio celular e incube as culturas conforme as instruções.

Em seguida, colete as células marcadas com 4sU em tubos de polipropileno. Em seguida, centrifugue as células. Ressuspenda o pellet em TRIzol a cerca de três milhões de células por mililitro e incube as células em TRIzol em temperatura ambiente por cinco minutos.

Agora prepare 30 a 80 microgramas de RNA, ou mais, usando o método de Radle e companhia. Em seguida, misture a reação de biotinilação específica do tiol nesta ordem. Comece com água livre de nuclease, depois tampão de 10 vezes, depois RNA e por último biotina-HPDP.

Em seguida, misture com pipetagem e incuba. Prossiga com a etapa de limpeza para produzir amostras de RNA biotinilado recém-transcrito misturado com RNA preexistente não marcado. Em seguida, aqueça as amostras a 65 graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, coloque-os imediatamente no gelo. Assim que cada amostra esfriar, adicione 100 microlitros de esferas de estreptavidina e incube-as em temperatura ambiente com rotação por 15 minutos. Agora, isole as contas decoradas com RNA recém-transcrito usando uma coluna magnética e, em seguida, elua o RNA em 11 microlitros de água livre de nuclease para sequenciamento.

Esta seção descreve como isolar o RNA que está sendo traduzido ativamente. O sequenciamento dessas transcrições examina o translatossomo dinâmico. Juntamente com os dados de sequenciamento de RNA, este ensaio permite o cálculo da renovação do RNA e das taxas de tradução.

Comece adicionando cicloheximida à suspensão e misturando-a usando inversões. Após um minuto à temperatura ambiente, centrifugue as células, remova o meio e lave as células com pelo menos 10 mililitros de PBS suplementado com cicloheximida. Em seguida, aspire o meio e substitua-o por 100 microlitros de tampão de lise de células de mamíferos por 10 milhões de células.

Triturar a mistura para lisar as células usando uma agulha de calibre 20 a 25. Em seguida, transfira o lisado celular para um tubo pré-resfriado de 1,50 mililitro e incube o lisado no gelo por 10 minutos com inversões periódicas. Após 10 minutos, centrifugue o lisado e transfira o sobrenadante para um tubo frio de 1,5 mililitro.

Em seguida, prepare uma diluição de um a 10 do lisado em água livre de nuclease e meça a absorbância em 260 nanômetros. Em seguida, crie alíquotas de 200 microlitros do lisado não diluído e trate cada uma com 7,5 unidades de nuclease para cada unidade de absorbância. Deixe a nuclease reagir por 45 minutos e, em seguida, termine a reação usando 15 microlitros de inibidor de RNase ou armazene a 80 graus Celsius negativos.

Em seguida, purifique o RNA RPF usando um kit comercial e, em seguida, faça uma depleção de rRNA, também usando um kit. Em seguida, execute uma purificação PAGE em 500 nanogramas de RNA RPF isolado. Depois de preparar as amostras para carregar no gel, desnature-as, este último e controles, com uma incubação de cinco minutos a 95 graus Celsius.

Em seguida, execute as amostras a 180 volts por cerca de 75 minutos e avalie os resultados. Para a coleta de fatias de gel, faça furos na parte inferior de um tubo de 0,5 mililitro usando uma agulha estéril de calibre 20. Em seguida, excise as fatias de gel correspondentes à região de nucleotídeos de base 28 a 30 e transfira-as para os tubos de 0,5 mililitro preparados.

Incluir uma amostra do controlo de ARN e uma amostra do controlo negativo para verificar a existência de contaminação. Em seguida, carregue os tubos de amostra pequenos e tampados em tubos de microcentrífuga maiores. Em seguida, centrifugue os conjuntos para triturar o gel e transfira a amostra para o tubo de 1,5 mililitro.

Em seguida, adicione água, acetato de amônio e SDS aos tubos de amostra para eluir o RNA em uma reação noturna a quatro graus Celsius. Em seguida, use um kit comercial para fazer uma biblioteca de cDNA a partir do pequeno RNA e prossiga com o sequenciamento da biblioteca de cDNA. ChIP-seq é usado para mapear a ligação de um fator de transcrição de interesse em todo o genoma.

Combinado com dados de perfis de ribossomos e o levantamento de todos os novos transcritos, o ChIP-seq revela o impacto real da ligação do fator de transcrição. Para começar, reticule as amostras de células usando formaldeído para uma concentração final de 1%Após 10 minutos em temperatura ambiente com balanço suave, pare a reação aumentando a concentração de glicina para 0,125 molar. Em seguida, colete as células e lave-as três vezes com PBS gelado e congele o pellet celular a 80 graus Celsius negativos.

Mais tarde, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de lise celular gelado com inibidores de protease recém-adicionados e incube as células no gelo por 10 minutos. Após 10 minutos, gire as células, aspire o sobrenadante e repita a adição e incubação do tampão de lise. Em seguida, use a sonicação para gerar cromatina cisalhada entre 200 e 1.000 pares de bases.

Em seguida, acople a cromatina a esferas magnéticas revestidas com anticorpos e elua os complexos proteína-DNA em 50 microlitros de tampão de eluição. Em seguida, adicione os cinco microlitros de 40% de RNase e tampão de eluição e incube a amostra por 30 minutos. Em seguida, adicione uma unidade de proteinase K e 20 microgramas de glicogênio à amostra e incube-a por duas horas.

Em seguida, mova a amostra para 65 graus Celsius durante a noite para reticulá-la reversa. No dia seguinte, coloque a amostra contra o ímã por pelo menos 30 segundos e, em seguida, colete o sobrenadante, que contém o DNA de interesse. Em seguida, purifique o DNA, use PCR quantitativo para verificação e sequencie o DNA.

A marcação 4sU pode estressar as células e levar à apoptose. A coloração com anexina V e 7-AAD foi usada para identificar células apoptóticas e mortas. Depois de marcar células Th1 com 4sU usando tratamentos de 30 ou 60 minutos, as células não morreram ou sofreram apoptose.

A integridade do RNA foi sempre verificada antes do sequenciamento usando um ensaio padrão, pois isso é de grande importância no processamento do RNA. As bibliotecas amplificadas tinham uma gama saudável de nucleotídeos. Dímeros de adaptador excessivos precisavam de mais purificação por PAGE.

Muito molde ou muitos ciclos resultam em nucleotídeos pesados, produtos manchados e produtos de dímero adaptadores Descobriu-se que o cisalhamento da cromatina funciona melhor quando a fração principal da cromatina cisalhada era de cerca de 1.000 pares de bases ou um pouco menos. A PCR quantitativa foi usada para testar a aplicabilidade do anticorpo ao sequenciamento da imunoprecipitação da cromatina. Os primers de controle negativo são para genes não expressos nas células de interesse.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fazer um plano detalhado da configuração experimental, incluindo um cronograma para quando adicionar 4sU e quando colher as células para cada método. Sempre verifique as condições ideais de marcação de 4sU testando o impacto de 4sU na viabilidade celular e na resposta ao estresse com antecedência. Em resumo, essa abordagem nos permite visualizar todos os eventos de regulação gênica que podem ocorrer durante um processo de ativação celular.

Este método também pode ser utilizado para células imunes primárias e sua resposta a um estímulo ou medicamento.