Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente
11 de abril de 2018
O seguinte protocolo incide sobre o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma de tecidos moles paciente-derivado (STS). Este modelo pode nos ajudar a compreender melhor o fundo molecular e perfil farmacológico destas malignidades raras e poderia representar um ponto de partida para novas pesquisas que visam melhorar a gestão do STS.
O objetivo geral deste modelo pré-clínico humano derivado de tecido tumoral ressecado cirurgicamente é obter o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma de tecidos moles derivado do paciente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a fisiopatologia do sarcoma de tecidos moles e representa uma importante ferramenta pré-clínica para prever a resposta à terapia. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um modelo pré-clínico totalmente humano.
As implicações dessa técnica se estendem à terapia do sarcoma de tecidos moles, pois esse modelo pré-clínico pode ser testado com medicamentos inovadores convencionais para investigar sua atividade e mecanismo de ação. Embora este método possa fornecer informações sobre o sarcoma de tecidos moles, ele também pode ser aplicado ao estudo da interação das células cancerígenas dos tecidos moles. Indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à heterogeneidade dos tecidos tumorais e ao isolamento das células tumorais.
A demonstração visual desse método é crítica, pois a seleção inicial de células de sarcoma de tecidos moles e as etapas de CD requerem uma quantidade de experiência antes que a proficiência possa ser alcançada. As amostras tumorais devem ser recebidas em um recipiente estéril de urina de 100 mililitros com 50 mililitros de meio DMEM de baixa glicose selado com um filme de parafina. As amostras podem ser mantidas a quatro graus Celsius por no máximo três horas após a ressecção do tumor.
Esterilize a capa de cultura de tecidos com 70% de etanol e esterilize as pinças INOX de aço com 70% de etanol. Remova o filme de parafina do recipiente de urina e descarte. Limpe o exterior do recipiente de urina com etanol 70%.
Abra uma placa de Petri quadrada, abra o recipiente de urina e use a pinça INOX de aço esterilizado para transferir as amostras de tumor para a placa. Adicione PBS e lave a amostra do tumor duas vezes. Após a lavagem, desfie finamente a amostra do tumor em pedaços de um a dois milímetros de tamanho.
Transferir um quarto da amostra total para um tubo de dois mililitros. Em seguida, adicione um mililitro de reagente TRIzol ao tubo e congele imediatamente a 80 graus Celsius negativos. Colete o restante do material tumoral finamente triturado em um tubo de 15 mililitros e adicione quatro mililitros de solução de colagenase tipo um.
Em seguida, dilua a solução de colagenase tipo um com quatro mililitros de meio de cultura, feche o tubo e sele com filme de parafina. Incube a 37 graus Celsius em uma coqueteleira por 15 minutos para ativar a digestão. Após 15 minutos, coloque o tubo com o agitador de rolamento em temperatura ambiente e deixe-o durante a noite.
No dia seguinte, filtre suavemente a suspensão celular através de um filtro estéril de 100 mícrons em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, lavar o filtro com meio de cultura e centrifugar o filtrado a 225 vezes g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante invertendo o tubo e ressuspender as células com um a dois mililitros de meio de cultura.
Depois de realizar uma contagem de células e calcular o número de células, coloque as células em uma cultura de monocamada padrão a uma densidade de 80.000 células por centímetro quadrado. Para preparar uma amostra citológica, comece coletando 100.000 células em 200 microlitros de meio de cultura. Pipetar a solução para uma ampola descartável equipada com um filtro e montada com uma lâmina de vidro.
Abra a citocentrífuga e insira as amostras. Após a citocentrifugação, rejeitar o funil equipado com o filtro. Em seguida, fixe a lâmina em acetona por 10 minutos, seguida de clorofórmio por cinco minutos.
Passe as células STS quando a confluência estiver em torno de 90%Depois de lavar a folha celular com PBS, adicione dois a três mililitros de tripsina 1X em PBS e incube por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, use uma pipeta de 200 a 1.000 microlitros para coletar as células destacadas e transfira para um tubo de 15 mililitros. Adicione quatro mililitros de meio para interromper a reação enzimática.
Em seguida, centrifugue a 225 vezes g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular adicionando um mililitro de meio e semeie as células em uma nova placa de cultura ou em um frasco. As células tumorais foram isoladas de um lipossarcoma removido cirurgicamente de um paciente de 54 anos.
A hibridização fluorescente in situ foi realizada para detectar a amplificação de MDM2 na amostra de tecido do paciente. A análise citológica da amplificação de MDM2 em células tumorais isoladas confirma o estabelecimento de uma cultura primária derivada do paciente. Alterações morfológicas da base foram induzidas quando as culturas foram tratadas com Ifosfamida, Epirrubicina, Ifosfamida e Epirrubicina, Trabectedina e Eribulina.
Três repetições independentes foram realizadas para cada experimento de viabilidade. Os resultados confirmaram a sensibilidade das culturas à quimioterapia. O tratamento mais ativo foi a combinação de Ifosfamida e Epirrubicina, uma terapia de primeira linha usada em ALT-DDLPS avançada ou metastática.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 15 a 16 horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de triturar finamente a amostra do tumor. Após este procedimento, uma variedade de análises a jusante, incluindo perfil de expressão gênica, análise imuno-histoquímica ou ensaio de citotoxicidade, pode ser realizada para responder a perguntas adicionais sobre a biologia do sarcoma de tecidos moles.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do sarcoma de tecidos moles estudarem a história natural dessas malignidades pouco exploradas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer uma cultura primária de sarcoma de tecidos moles derivado do paciente. Não se esqueça de que trabalhar com amostras biológicas e medicamentos pode ser extremamente perigoso e precauções como usar luvas e trabalhar com hotte devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma de tecido mole (STS) derivado de pacientes. Este modelo pré-clínico humano tem como objetivo aprimorar a compreensão da fisiopatologia do STS e das respostas terapêuticas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Oncologia
- Biologia Celular
- Pesquisa Pré-clínica
Antecedentes
- Os sarcomas de tecidos moles são malignidades raras.
- Compreender sua base molecular é crucial para um manejo eficaz.
- Os modelos atuais podem não replicar completamente o comportamento do tumor humano.
- Este método utiliza tecido tumoral humano para obter informações mais relevantes.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um cultivo primário derivado de STS de pacientes.
- Investigar a fisiopatologia do STS.
- Avaliar as respostas terapêuticas utilizando este modelo.
Métodos Utilizados
- Isolamento de células tumorais a partir de tecido ressecado cirurgicamente.
- Estabelecimento de um cultivo primário para uso experimental.
- Teste de medicamentos convencionais e inovadores.
- Análise da atividade farmacológica e mecanismo de ação.
Resultados Principais
- O modelo fornece informações sobre a biologia do STS.
- Permite a avaliação de agentes terapêuticos.
- Demonstra a heterogeneidade dos tecidos tumorais.
- Facilita a compreensão das interações entre células cancerígenas.
Conclusões
- Este modelo é uma ferramenta valiosa para pesquisas pré-clínicas.
- Ele aprimora a compreensão das respostas ao tratamento de STS.
- Estudos futuros podem se basear neste trabalho fundamental.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de culturas primárias derivadas de pacientes com sarcoma de tecidos moles atende à necessidade crítica de modelos pré-clínicos biologicamente relevantes na descoberta de fármacos em oncologia. Esse sistema derivado de humanos permite a eliminação mecanicista de riscos de candidatos terapêuticos ao preservar a heterogeneidade tumoral e a biologia específica do paciente, apoiando a confiança preditiva nos esforços de validação de alvos e identificação de compostos líderes. O modelo facilita a continuidade translacional desde a descoberta até a avaliação pré-clínica, reduzindo o risco biológico em estágios avançados nas linhas de pesquisa focadas em sarcomas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em um sistema relevante para humanos que mantém a citomorfologia nativa do tumor e marcadores moleculares.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio de perfis de sensibilidade a fármacos utilizando agentes quimioterápicos padrão.
- Valor Estratégico: Aumenta a confiança preditiva ao modelar mecanismos fisiopatológicos diretamente a partir de espécimes de pacientes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera culturas padronizadas em monocamada adequadas para ensaios quantitativos de viabilidade e citotoxicidade.
- Valor Operacional: Fornece entradas celulares reprodutíveis para análises posteriores, incluindo expressão gênica e perfilhamento imunohistoquímico.
- Valor Estratégico: Permite avaliação escalonável de compostos com densidades de semeadura definidas e protocolos de passagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a biologia relevante à doença por meio da preservação das características do tumor derivado do paciente, incluindo o status de amplificação de MDM2 quando aplicável.
- Valor Operacional: Permite a continuidade desde o isolamento inicial até a cultura de longo prazo, para ciclos repetidos de testes de fármacos.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço com ajuste de risco ao demonstrar respostas dependentes da dose a regimes clinicamente relevantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta ao fornecer um modelo celular humano para testes de hipóteses no início da descoberta, sistemas prontos para ensaios em triagens e saídas fenotípicas mensuráveis para validação pré-clínica.
- Biologia de Descoberta: Apoia a investigação fisiopatológica e a redução de riscos mecanicistas por meio da observação direta de alterações morfológicas induzidas por fármacos.
- Triagem: Fornece culturas padronizadas e aderentes em densidades definidas para triagem consistente de compostos e determinação de IC50.
- Análises: Permite medições quantitativas de variáveis dependentes por meio de ensaios de viabilidade, imagens de fluorescência e análise molecular de culturas tratadas com fármacos.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à continuidade pré-clínica por meio de passagens seriadas e ciclos repetidos de tratamento.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma pré-clínica renovável aplicável a múltiplas classes de fármacos e terapias combinadas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao associar a exposição ao fármaco a alterações citológicas e moleculares observáveis em células tumorais humanas.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de digestão, filtração e semeadura com densidades celulares definidas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer sinais precoces de eficácia a partir de modelos derivados de humanos antes de estudos in vivo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de terapêuticas para sarcomas com base na sensibilidade demonstrada em culturas pareadas com pacientes.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de tecidos primários, digestão enzimática e técnicas estéreis de cultivo celular.
- Depende do acesso a espécimes cirúrgicos frescos e à infraestrutura para dissociação baseada em colagenase.
- Necessita de métodos padronizados de quantificação (por exemplo, hemocitômetro ou contador automatizado) para semeadura consistente.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes subtipos de sarcoma e fragilidade tecidual durante o processamento mecânico.
- Limitado pela vida útil finita de culturas primárias e pela variabilidade entre doadores na cinética de crescimento.
