Name: Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprenda a estabelecer cultura primária de sarcoma de tecidos moles derivada de paciente humano. Este modelo pré-clínico permite investigar a patofisiologia tumoral e testar respostas terapêuticas a fármacos convencionais e inovadores.

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Os autores gostaria de agradecer Gráinne Tierney assistência editorial.

Células de STS são isoladas um tumor extirpado cirurgicamente massa de pacientes com STS. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética Local e é realizado de acordo com as diretrizes de boas práticas clínicas e a declaração de Helsinque. Todos os pacientes deram consentimento escrito para participar no estudo. Os espécimes cirúrgicos são analisados por um patologista experiente sarcoma e processados dentro de 3 horas de cirurgia.
1. tumor colheita e processamento:
<ol><li>Colete as amostras de tumor com a ajuda de uma patologista de sarcoma em um recipiente 100 mL de urina estéril com 50 mL de meio DMEM baixa glicose selado com uma película de parafina.</li>
	<li>Armazene as amostras em 4 ° C por um período máximo de 3h após a ressecção do tumor.</li>
	<li>Execute todas as etapas a seguir sob uma capa de cultura de tecido estéril.<ol>
<li>Esterilizar o capô com etanol a 70% e luvas estéreis.</li>
		<li>Esterilize pinças de aço inox com etanol a 70% (uso uma gaze estéril).</li>
		<li>Retire a película de parafina do contêiner de urina e descarte.</li>
		<li>Lave o exterior do recipiente de urina com etanol a 70%.</li>
		<li>Abra uma quadrado de Petri.</li>
		<li>Abra o recipiente de urina e transferir as amostras do tumor para o prato de petri quadrado usando uma pinça esterilizada de aço inox.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Os espécimes do tumor com PBS lave duas vezes.</li>
	<li>Abra um bisturi cirúrgico estéril.<ol>
<li>Pique finamente os espécimes do tumor em pedaços de3 1-2 mm.</li>
		<li>Colete um quarto do total da amostra em um tubo de 2 mL.</li>
		<li>Adicione 1 mL do reagente trizol (comprado) ao tubo e imediatamente congelar a-80 ° C (a amostra será usada na análise a jusante para a avaliação da expressão de gene STS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolha o resto do material finamente ralado tumor em um tubo de 15 mL.<ol>
<li>Adicionar 4 mL de colagenase tipo I (tipo de colagenase que é dissolvido em PBS, em uma concentração de 4 µ g/mL) de solução.</li>
		<li>Diluir a colagenase tipo I solução com 4 mL de DMEM alta cultura mídia (concentração final do tipo de colagenase é de 2 µ g/mL).</li>
		<li>Fechar o tubo de 15 mL e selar com película de parafina.</li>
		<li>Coloque o tubo de 15 mL em um shaker rolamento em uma incubadora a 37 ° C em condições de agita por 15 min ativar a digestão.</li>
		<li>Depois de 15 min armazene o tubo no shaker rolamento sob agitação condições à temperatura ambiente durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia seguinte Coloque o tubo de 15 mL sob o capô estéril.</li>
	<li>Delicadamente, filtre a suspensão de células através de um filtro estéril de 100 µm, anexado ao topo de um tubo de 50 mL.</li>
	<li>Lave o filtro com meio de cultura alto DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Descarte o filtro de estéril 100 µm, fechar o tubo de 50 mL e centrifugar a 225 x g, durante 5 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante por inversão do tubo.</li>
	<li>Ressuspender as células com 1-2 mL DMEM alto meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina/estreptomicina. Nota: O volume depende da quantidade de amostra de tumor processada.</li>
	<li>Conte as células com uma câmara de Neubauer.<ol>
<li>Diluir a amostra 1:2 em azul trypan e usar 10 µ l da diluição para contagem de células.</li>
		<li>Contar pelo menos duas vezes e calcular a média da é replicada para saber o número médio total de células coletadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placa as células em uma cultura padrão monocamada em uma densidade de 80.000 células/cm2. Nota: Sempre inclua controles em experimentos. Realize pelo menos 3 técnicas repetições para cada condição. Realize pelo menos 2 réplicas biológicas. Para farmacologia pré-clínica, expressão gênica e análises de expressão de proteínas, devem ser realizadas experiências com um baixo número de passagens de cultura dentro de 30-45 dias de semeadura de células para evitar a perda de câncer fenótipos de célula.</li>
	<li>Preparação das amostras citológicas.<ol>
<li>Recolha 100.000 pilhas em 200 µ l de DMEM alta media de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina/estreptomicina.</li>
		<li>Pipeta a solução (pipeta de 200 µ l) para um funil descartável equipado com um filtro e montado com uma lâmina de vidro.</li>
		<li>Abra o cytocentrifuge e inserir as amostras.</li>
		<li>Execute o cytocentrifuge a 18,6 x g por 20 min.</li>
		<li>Descarte o funil equipado com o filtro.</li>
		<li>Corrigi os slides em acetona por 10 min, seguido de clorofórmio por 5 min.</li>
		<li>Armazenar os slides a-20 ° C. Nota: Descongelar e hidratar as amostras antes de coloração e realizar a coloração seguindo as instruções do fabricante. Prepare pelo menos 3 repetições de técnicas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. culturas de pilha STS:
<ol><li>Mudar a mídia uma vez por semana (DMEM alta media de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina/estreptomicina).<ol>
<li>Descarte o meio de cultura usando uma pipeta de µ l 200-1.000.</li>
		<li>Adicione novo meio fresco com uma pipeta de µ l 200-1.000.</li>
		<li>Passagem de células:<ol>
<li>Separe as células quando a confluência é de cerca de 90%: Nota: Amplificação de cultura de células de STS deve ser realizada uma vez por semana, com base nas condições de cultura.</li>
			<li>Descarte o meio, lave com PBS e adicionar 2-3 mL de tripsina 1 x em PBS Nota: O volume de tripsina utilizada depende da quantidade de pilhas cultivadas obtidos.</li>
			<li>Incubar as células para 3-5 min a 37 ° C.</li>
			<li>Recolha pilhas desanexadas da placa usando uma pipeta de µ l 200-1.000.</li>
			<li>Pipetar as células destacadas para um tubo de 15 mL e adicionar 4 mL de DMEM alta media de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina/estreptomicina para parar a reação enzimática.</li>
			<li>Centrifugar a 225 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
			<li>Desprezar o sobrenadante.</li>
			<li>Ressuspender o centrifugado, adicionando 1 mL de DMEM alta media de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina/estreptomicina.</li>
			<li>As sementes das células em uma nova placa de cultura ou um balão com um volume final de acordo com as instruções do fabricante. Nota: Não dividi células, mais de 1:3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. a jusante análises:
Nota: Uma variedade de experiências diferentes pode ser realizada usando esse modelo (veja abaixo). É, portanto, crucial decidir durante a fase de concepção do estudo que analisa será executada para que possa ser preparado um número adequado de amostras e repetições.
<ol><li>Ensaios de proliferação como brometo de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium MTT</li>
	<li>Ensaios de apoptotic tais como terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) nick final rotulagem do ensaio (TUNEL)</li>
	<li>Análise imuno-histoquímica</li>
	<li>Análise de expressão do gene</li>
	<li>Análise ocidental do borrão</li>
	<li>Ensaio de ELISA</li>
	<li>Fluorescência-ativado da pilha classificação análise (FACS)</li>
	<li>
Modelo de enxerto heterólogo in vivo</li>
</ol>

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<li>De Vita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+classification%2C+treatment+options%2C+and+new+perspectives+in+the+management+of+adipocytic+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Onco+Targets+Ther%22%5BJournal%5D)">Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas.</a> Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).</li>
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<li>Ducimetière, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+sarcoma+histotypes+and+molecular+subtypes+in+a+prospective+epidemiological+study+with+central+pathology+review+and+molecular+testing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing.</a> PLoS One. 6 (8), 20294(2011).</li>
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</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Modelos pré-clínicos bem definidos são necessários para elucidar o fundo molecular de tumores, prever o prognóstico pobre e desenvolver novas estratégias terapêuticas para pacientes com câncer. Isto é especialmente importante para tumores raros como STS cuja alta heterogeneidade em termos de morfologia, comportamento agressivo em potencial e clínico desafia nossa compreensão da biologia do STS e gestão paciente21. Além disso, poucas linhas celulares sarcoma comerciais disponíveis limita pré-clínic...

Sarcomas de partes moles (STS) incluem um espectro de lesões heterogêneas de contabilidade de origem mesenquimal para 1% de todos os tumores sólidos1,2, e a nova classificação da Organização Mundial de saúde reconhece a presença de mais de 50 Subtipos diferentes3. Entre estes, os histotypes mais comuns são sarcoma de adipócitos ou Lipossarcoma e Leiomiossarcoma, representando 15% e 11% de todos os adultos STS, respectivamente de4,5. Embora o STS podem desenvolver em diferentes partes do corpo, as extremidades e retroperitoneal são os locais mais comuns, ocorrendo em 60% e 20% dos casos, respectivamente6.
A pedra angular da terapia para doença localizada é a ressecção cirúrgica ampla, Considerando que os benefícios da quimioterapia adjuvante e neoadjuvante não são ainda claras e são considerados apenas em casos selecionados7. Na configuração da metastática, quimioterapia é o tratamento padrão, mas mostra resultados limitados8. Uma melhor compreensão da biologia molecular da STS contribuiria para melhorar o diagnóstico atual, otimizar os tratamentos disponíveis e identificar novos alvos para a terapia.
Dentro deste contexto, foi realizada pesquisa em câncer por muitos anos usando linhas de célula imortalizado9. Esses modelos experimentais são normalmente cultivados em monocamada padrão suporta ou implantados em imunodeficientes roedores estabelecer na vivo xenoenxertos modelos10. Linha celular imortalizado representa um gerenciável e fácil-para-loja material com o qual um amplo número de experimentos de pesquisa pode ser realizado. Eles são, na verdade, os menos dispendiosos e mais amplamente utilizado a ferramenta em estudos pré-clínicos11.
No entanto, célula-linha com base em modelos de câncer também têm algumas limitações, por exemplo, prolongada de cultura em um sistema de monocamada juntamente com um número crescente de passagens induz fenotípica e deriva genética, fazendo as células menos provável para recapitular o tumor chave características. Além disso, culturas de células linha deixam de reproduzir a interação célula a célula e sinalização diafonia molécula que imitam o comportamento biológico dos tumores e caracterizar o microambiente do tumor. Estas questões formam a base do fosso existente entre os resultados clínicos e pré-clínicos12.
Dado o acima, o interesse no paciente-derivado de culturas primárias aumentou13. Com efeito, a excisão do tecido normal e maligno reduz o risco de perder o fenótipo de células de câncer e heterogeneidade, oferecendo assim uma matéria-prima que é o mais representativo do microambiente do tumor. Além disso, o uso de amostras de tumor frescas colhidas de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica nos permite investigar tumores única e comparar diferentes lesões da mesma parte do corpo de14 um paciente. Pelas razões acima expostas, culturas de células derivadas de tecido proporcionam um valioso material para estudar o tumor fisiopatologia e farmacologia15,16,17, especialmente no STS em quais linhas de células de sarcoma comercialmente disponível são limitados,18. Nós aperfeiçoamos, portanto, um método para estabelecer uma paciente-derivado STS cultura de célula primária a partir de2019,13,do tecido tumor cirurgicamente extirpado. Nosso método consiste em desagregar o espécime de tumor em pequenos fragmentos de tecido seguidos de dissociação de tecido enzimática durante a noite para obter uma suspensão de célula única. No dia seguinte, a digestão enzimática é interrompido pela adição de meio de cultura fresco e a suspensão obtida é filtrada para remover fragmentos de tecido, célula-agregados e material de matriz em excesso ou detritos. Finalmente, uma fração de células tumorais isoladas é cytospinned em lâminas de vidro, fixo e armazenados para jusante análise visado confirmando o estabelecimento da cultura primária de STS por cytomorphological, imuno-histoquímica e avaliação citogenética molecular (por exemplo, análise de peixe de MDM2 amplificação representa o padrão diagnóstico diferencial para uma Lipossarcoma bem diferenciada e a condrossarcoma Lipossarcoma) 4. as células restantes são semeadas em uma cultura padrão monocamada para estudos farmacológicos e de criação de perfil de expressão genética. Todos os experimentos são realizados usando baixa passagem culturas primárias para evitar a seleção dos subclones de câncer específicos e analisaram por um patologista experiente sarcoma. Assim, criamos um humano totalmente STS ex-vivo modelo13,19,20. Esta altamente versátil, fácil de punho modelo poderia representar uma ferramenta útil para diferentes tipos de pesquisa pré-clínica, por exemplo, para identificar novos marcadores moleculares para diagnóstico e prognóstico ou para ganhar uma compreensão mais profunda da atividade e mecanismos de ação de padrão e novos fármacos utilizados na gestão do STS.

<table><tbody><tr><td>Soro bovino</td> fetal <td>de EuroClone</td> da glicose alta de DMEM <td>EuroClone ECS0180D</td> solução aquosa de Paraformaldeído 4% de EuroClone ECB7501L <td></td></tr> de <tr><td></td><td>EuroClone</td><td></td> da categoria 15140122 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente Triazol</td><td>Ambion Life-Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>EuroClone</td><td>ECB3052D</td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma macio do tecido derivado de paciente

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Sarcomas de partes moles (STS) representam um espectro de malignidades heterogêneos com difícil diagnóstico, classificação e de gestão. Até à data, foram identificados mais de 50 subtipos histológicos destes raros tumores sólidos. Assim, devido à sua extraordinária diversidade e baixa incidência, nossa compreensão da biologia desses tumores é ainda limitado. Paciente-derivado de culturas representam a plataforma ideal para estudar farmacologia e fisiopatologia do STS. Assim, desenvolvemos um modelo humano pré-clínicos de STS a partir de amostras de tumor colhidas de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica. Culturas de células do paciente-derivado STS foram obtidas a partir dos espécimes cirúrgicos por digestão de colagenase e isoladas por filtração. As células foram contadas, semeadas e deixou por 14 dias em culturas padrão monocamada e processadas por análise a jusante. Antes de executar análises moleculares ou farmacêuticas, o estabelecimento de culturas primárias de STS foi confirmado através da avaliação das características de cytomorphologic e, quando disponível, marcadores imuno-histoquímicos. Este método representa uma ferramenta útil 1) para estudar a história natural destas malignidades mal exploradas e 2) para testar os efeitos de diferentes drogas em um esforço para aprender mais sobre seus mecanismos de ação.

Nós projetamos um método simples para obter o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma macio do tecido derivado de paciente e apresente-se aqui um exemplo dos resultados obtidos em um específico STS histotype13. O protocolo foi utilizado para o estabelecimento de culturas primárias de diferentes histotypes STS, incluindo Lipossarcoma bem diferenciada, condrossarcoma Lipossarcoma Lipossarcoma mixoide, Lipossarcoma pleomórfica, myxofibrosarcoma, indiferenci...

O seguinte protocolo incide sobre o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma de tecidos moles paciente-derivado (STS). Este modelo pode nos ajudar a compreender melhor o fundo molecular e perfil farmacológico destas malignidades raras e poderia representar um ponto de partida para novas pesquisas que visam melhorar a gestão do STS.

Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

O objetivo geral deste modelo pré-clínico humano derivado de tecido tumoral ressecado cirurgicamente é obter o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma de tecidos moles derivado do paciente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a fisiopatologia do sarcoma de tecidos moles e representa uma importante ferramenta pré-clínica para prever a resposta à terapia. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um modelo pré-clínico totalmente humano.As implicações dessa técnica se estendem à terapia do sarcoma de tecidos moles, pois esse modelo pré-clínico pode ser testado com medicamentos inovadores convencionais para investigar sua atividade e mecanismo de ação. Embora este método possa fornecer informações sobre o sarcoma de tecidos moles, ele também pode ser aplicado ao estudo da interação das células cancerígenas dos tecidos moles. Indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à heterogeneidade dos tecidos tumorais e ao isolamento das células tumorais.A demonstração visual desse método é crítica, pois a seleção inicial de células de sarcoma de tecidos moles e as etapas de CD requerem uma quantidade de experiência antes que a proficiência possa

establishment-primary-culture-patient-derived-soft-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este artigo descreve a preparação do tecido acabado de melanoma obtidas em culturas primárias de células, e como para remover contaminações de eritrócitos e fibroblastos a partir de células tumorais. Finalmente, descrevemos como...

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Métodos para criar tecidos tumorais 3D humanos como sistemas de teste são descritos. Estas tecnologias são baseadas num descelularizado Biológica vascularizada andaime (BioVaSc), células humanas primárias e uma linha de células tumorais, que podem ser cultivadas em condições estáticas, bem como sob condições dinâmicas de um bio-reactor de fluxo.

Engenharia de Tecidos de um 3D Humano<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Teste de Tumor

Um protocolo é descrito para extrair células humanas primárias de tumores cirúrgicos de cólon e tecidos normais. As células isoladas são então cultivadas em substratos elásticos macios (hidrogéis de poliacrilamida) funcionalizados por uma proteína de matriz extracelular e incorporados com microesferas fluorescentes. A citometria de tração é realizada para avaliar os estresses contráteis celulares.

Isolamento de células do cólon tumor primário Humanos a partir de tecidos cirúrgicos e cultivando-as Diretamente macias elásticas Substratos para Traction Citometria

A presença de células-tronco cancerosas (CSCs) em sarcomas ósseos foi recentemente ligada à sua patogênese. Neste artigo, apresentamos o isolamento de CSCs de culturas de células primárias obtidas a partir de biópsias humanas de osteossarcoma convencional (OS) que utilizam a capacidade dos CSCs a crescer sob condições não aderentes.

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures de Human osteossarcoma convencional

Os tumores cutâneos são frequentemente descartados após a cirurgia micrográfica de Mohs. Descreve-se aqui um protocolo que permite que a equipe de suporte clínico processe e armazene eficazmente amostras de tumores cutâneos ( por exemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular e melanoma) para aplicações laboratoriais a jusante sem interferir com as operações clínicas.

Estabelecimento de um Biorepository baseado em Clínica

Nós descrevemos um protocolo detalhado para a isolação de pilhas tumor-iniciando dos xenoenxertos paciente-derivados do sarcoma humano pela seleção fluorescência-ativada da pilha, usando o antígeno-1 humano da leucócito (HLA-1) como um marcador negativo, e para a validação mais adicional e caracterização destas pilhas tumor-iniciando HLA-1-Negative.

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

Nós fornecemos um método para a geração, cultivo e análise sistemática de fatias de organotypic derivadas de tumores de pulmão murino. Descrevemos também como otimizar para espessura da fatia e como selecionar as concentrações de drogas para tratar a fatias de tumor.

Estabelecimento e análise do Tumor fatia Explants como um pré-requisito para o teste de diagnóstico

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Um protocolo detalhado é fornecido aqui para estabelecer organoides mamários humanos a partir de ressecções de tumor de mama derivadas de pacientes ou tecido mamário normal. O protocolo fornece instruções passo a passo abrangentes para cultivar, congelar e descongelar organoides mamários derivados de pacientes humanos.

Estabelecimento e Cultura de Organoides Mamários Derivados da Paciente

Os organoides tumorais revolucionaram a pesquisa do câncer e a abordagem da medicina personalizada. Eles representam um modelo de tumor clinicamente relevante que permite aos pesquisadores ficar um passo à frente do tumor na clínica. Este protocolo estabelece organoides tumorais a partir de amostras de tecido tumoral pancreático fresco e xenoenxertos derivados do paciente de origem adenocarcinoma pancreático.

Estabelecimento de organoides tumorais derivados do câncer de pâncreas e fibroblastos a partir de tecido fresco

O protocolo descreve um método para criar um modelo organoide de câncer colorretal derivado do paciente (CCR) co-cultivado com linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) para estudar suas interações e potencial terapêutico. Este modelo fornece uma plataforma pré-clínica para explorar as respostas imunes no microambiente tumoral e prever a eficácia da terapia baseada em TIL para o tratamento personalizado do CCR.

Estabelecimento de um sistema de co-cultura de organoides tumorais colorretais derivados de pacientes e linfócitos infiltrantes de tumor (TILs)

Aprenda a estabelecer cultura primária de sarcoma de tecidos moles derivada de paciente humano. Este modelo pré-clínico permite investigar a patofisiologia tumoral e testar respostas terapêuticas a fármacos convencionais e inovadores.

Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente

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