Um ensaio simples e de baixo custo para medir a deambulação em modelos de Mouse de Distrofia Muscular
29 de dezembro de 2017
Este protocolo descreve um sistema flexível e de baixo custo para medir a deambulação do mouse em um ensaio de atividade de campo aberto. Mostramos que um ensaio de 6 minutos de deambulação com base neste sistema detecta uma diminuição no movimento voluntário em camundongos mdx e distingue com precisão a melhoria em um músculo específico resgate destes animais.
O objetivo geral deste ensaio é medir a deambulação voluntária em modelos de camundongos com distrofia muscular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da distrofia muscular sobre a progressão da fraqueza muscular em modelos de distrofia muscular em camundongos e a eficácia de possíveis terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma medição não invasiva e reprodutível da atividade animal que pode ser facilmente adaptada a muitos ambientes de pesquisa diferentes.
Em uma sala silenciosa com temperatura controlada em uma hora consistente do dia, coloque uma câmera em uma tela de arame acima da câmara de atividade para permitir a gravação em toda a arena e limpe a câmara com desinfetante. Imediatamente antes da gravação da atividade, permita que o mouse segure a barra de pólo de um medidor de força digital e puxe suavemente para trás até que a barra de pólo seja liberada. Registre o pico de tensão em Newtons para cada tentativa.
Com um minuto de descanso entre as provas. Imediatamente após o ensaio de força de preensão, coloque o mouse na câmara e inicie a gravação do vídeo, permitindo que o mouse explore livremente. Após seis minutos, pare a gravação e retorne o mouse à gaiola inicial.
Para rastrear a análise dos dados de vídeo, primeiro abra a gravação no software de edição de vídeo apropriado e defina a velocidade para duas vezes. Exporte o vídeo dizimado em formato de arquivo mp4 para análise de rastreamento e abra o vídeo no programa de análise de vídeo apropriado. Para definir a calibração para a gravação de vídeo, use a ferramenta de linha para desenhar uma linha ao longo de um lado da câmara.
Clique com o botão direito do mouse na linha, selecione calibrar medida e insira o tamanho real do lado da câmara em centímetros. Para iniciar o rastreamento semiautomático da posição do mouse, clique no cursor de movimento. Começando no quadro inicial do vídeo, clique com o botão direito do mouse no ponto a ser rastreado.
O ponto de rastreamento será marcado com um círculo azul. Use a seta para a direita no teclado para avançar o quadro. O ponto de rastreamento deve se mover automaticamente com base na posição da base da cauda.
Se a posição de rastreamento não estiver alinhada com o ponto de interesse em um determinado quadro, alinhe manualmente o círculo azul à posição de rastreamento. Quando todo o vídeo tiver sido rastreado, salve o vídeo e a sobreposição de rastreamento e selecione exportar para planilha para exportar os dados posicionais do rastreamento. Consistente com os resultados relatados em ensaios semelhantes, camundongos com distrofina nula desafiados com um protocolo de exercícios imediatamente antes do teste, demonstram significativamente menos movimento voluntário em um teste de campo aberto de seis minutos do que animais selvagens.
De fato, após o esforço leve de um desafio de força de preensão, os camundongos mdx normalmente permaneciam imóveis durante os primeiros minutos do protocolo de deambulação, com um aumento modesto no movimento nos minutos quatro a cinco. Ao comparar animais selvagens e mdx sem um desafio de exercício, no entanto, não são detectadas diferenças na distância percorrida. Camundongos Mdx transgênicos para expressão de utrofina são indistinguíveis de animais selvagens, sem diferenças significativas na distância total percorrida ou em qualquer um dos pontos de tempo covariáveis observados.
Para determinar o efeito da diminuição da taxa de amostragem, a distância total percorrida a partir de um minuto de vídeo com taxa de quadros total foi medida e comparada com as medições de distância derivadas de versões com amostragem do conjunto de dados. Reduzir a taxa de quadros pela metade diminuiu a distância medida em 5% da distância original calculada. A precisão da distância medida cai drasticamente após este ponto, embora mesmo conjuntos de dados altamente dizimados ainda se aproximem do caminho do animal, destacando a importância de considerar a taxa de quadros e o processamento do sinal na avaliação da atividade animal e demonstrando que a alta resolução espacial pode ser mantida em dados de vídeo com amostragem.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como registrar e analisar a deambulação do mouse em um ambiente de campo aberto. Uma vez dominada, essa análise pode ser concluída em 15 a 30 minutos, se realizada corretamente. Este ensaio de baixo custo e não invasivo permite que os pesquisadores examinem a atividade motora em modelos de camundongos com distrofia muscular e pode servir como um primeiro passo informativo para outras medições funcionais.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um sistema flexível e de baixo custo para medir a deambulação de camundongos em um ensaio de atividade em campo aberto. O método fornece uma medição não invasiva e reprodutível da atividade animal, que pode ser adaptada a diversas configurações de pesquisa.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa sobre Distrofia Muscular
- Análise Comportamental
Antecedentes
- O ensaio mede a ambulação voluntária em modelos murinos de distrofia muscular.
- Aborda questões fundamentais sobre a progressão da fraqueza muscular.
- A técnica foi desenvolvida para avaliar a eficácia de terapêuticas potenciais.
- O registro é feito em um ambiente controlado para garantir consistência.
Objetivo do Estudo
- Para medir o movimento voluntário em camundongos mdx.
- Para avaliar o impacto de intervenções específicas para o músculo.
- Para fornecer informações sobre a progressão da distrofia muscular.
Métodos Utilizados
- Uso de uma câmera posicionada acima da câmara de atividade para gravação.
- Limpeza da câmara com desinfetante antes dos ensaios.
- Permitir que o camundongo segure uma barra vertical para medir a tensão máxima.
- Registro da atividade durante um ensaio de ambulação de 6 minutos.
Resultados Principais
- O sistema detecta diminuições no movimento voluntário em camundongos mdx.
- Ele distingue com precisão melhorias decorrentes de resgate específico do músculo.
- Os resultados são reprodutíveis em diferentes ensaios.
- O método é adaptável a diversos ambientes de pesquisa.
Conclusões
- Este ensaio é eficaz para estudar a distrofia muscular em camundongos.
- Ele fornece dados valiosos sobre a eficácia de tratamentos potenciais.
- A abordagem é flexível e pode ser utilizada em diversos ambientes de pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição da locomoção voluntária em modelos murinos fornece uma leitura translacional da função motora na distrofia muscular, diretamente análoga a pontos finais clínicos como o teste de caminhada de 6 minutos. Este ensaio baseado em vídeo, de baixo custo, permite a avaliação reprodutível e não invasiva da progressão da doença e da resposta terapêutica em estudos pré-clínicos. Ao detectar déficits de atividade em camundongos mdx sem distrofina e sua recuperação mediante a expressão de utrofina, o método apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos para doenças neuromusculares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a quantificação da locomoção voluntária como parâmetro funcional da força muscular em modelos distróficos.
- Valor Operacional: Permite a desconsideração de riscos biológicos por meio da correlação reprodutível entre genótipo e fenótipo em camundongos mdx comparados aos grupos selvagens e recuperados.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao distinguir intervenções eficazes (por exemplo, transgene da utrofina) que normalizam os níveis de atividade até os valores observados em tipo selvagem.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em etapas subsequentes, utilizando métricas padronizadas de locomoção em campo aberto.
- Reprodutibilidade: Fornece saídas quantitativas baseadas em distância e tempo, passíveis de padronização do ensaio entre diferentes laboratórios.
- Escalabilidade: Aproveita software gratuito e de código aberto, juntamente com hardware acessível, permitindo a reutilização da plataforma em diversos ambientes de pesquisa sem necessidade de equipamentos especializados.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela déficits de deambulação relevantes para o paciente, proporcionando continuidade translacional desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se os efeitos observados decorrem de resgate específico no músculo ou de alterações inespecíficas na atividade.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de prosseguir/interromper ao correlacionar a recuperação da deambulação com o engajamento do alvo e a modulação da via.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores, oferecendo uma conexão funcional entre mecanismos moleculares e resultados fenotípicos em modelos de distrofia muscular.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar intervenções genéticas ou farmacológicas a alterações mensuráveis no movimento voluntário.
- Triagem: Permite a preparação para ensaios por meio de rastreamento reprodutível baseado em vídeo, gerando desfechos quantificáveis de deambulação para avaliação de compostos.
- Análise: Gera fluxos de dados posicionais e temporais que permitem às equipes comparar a atividade locomotora entre genótipos, tratamentos e pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao reproduzir avaliações clínicas de deambulação, facilitando o alinhamento de biomarcadores e a modelagem preditiva.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável e de baixo custo para testes de deambulação, reduzindo a dependência de instalações centrais especializadas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em ensaios de função motora.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio do rastreamento de código aberto e condições ambientais controladas.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao eliminar a necessidade de sistemas caros de rastreamento de movimento, mantendo a qualidade dos dados.
- Impacto no Portfólio: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base no resgate funcional de fenótipos de locomoção em modelos pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimento básico em gravação de vídeo e software de rastreamento de código aberto (por exemplo, alinhamento manual quadro a quadro).
- Depende de equipamentos de imagem padrão e controles ambientais consistentes (iluminação, temperatura, horário do dia).
- Necessita adesão ao protocolo por toda a equipe para garantir reprodutibilidade entre diferentes locais e operadores.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tamanhos de câmara, linhagens de camundongos e níveis de atividade.
- Envolve compromissos entre taxa de quadros e precisão da medição, já que a redução da taxa diminui a precisão no cálculo de distância.
