Preparação ideal de formol fixada amostras para peptídeo baseado Matrix assistida por espectrometria de massa de ionização/dessorção Laser Imaging fluxos de trabalho
January 16th, 2018
Este protocolo descreve um método reprodutível e confiável para preparação de formol fixada tecido destinado a espectrometria de massa de imagens baseada em sublimação.
O objetivo geral deste procedimento é preparar de forma reprodutível uma amostra de tecido para imagens de espectrometria de massa peptídica. Este método permite que usuários novatos em espectrometria de massa desenvolvam seus próprios fluxos de trabalho de espectrometria de massa de imagem sem passar por longas determinações empíricas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é altamente reprodutível, simples de implementar e usa metodologias econômicas.
Para preparar as lâminas revestidas com nitrocelulose, pipete 40 microlitros de nitrocelulose líquida em uma borda da lâmina condutora do microscópio de óxido de índio e estanho. Usando uma lâmina de microscópio de vidro comum, arraste a nitrocelulose sob tensão superficial pela lâmina para criar um revestimento de filme fino uniforme. Deixe a nitrocelulose secar em temperatura ambiente por 20 segundos e guarde até que seja necessário em temperatura ambiente.
Em seguida, crie câmaras de vapor personalizadas cortando um pedaço de papel mata-borrão grosso grande o suficiente para caber na metade inferior de uma placa de Petri de plástico padrão. Corte o papel para deixar uma tira retangular no centro do mesmo tamanho de uma lâmina de microscópio. Deixe excesso suficiente para que o papel mantenha sua posição na placa de Petri.
Para tecido FFPE, monte as seções nas lâminas ITO pré-revestidas com nitrocelulose, conforme descrito no protocolo de texto. Mergulhe as lâminas em xileno fresco para remover a parafina residual por dois minutos. Lavar as amostras desparafizadas submergindo as lâminas numa série graduada de solventes constituída por uma solução aquosa de etanol a 70% de volume, seguida de etanol a 100%, durante 30 segundos.
Em seguida, mergulhe as lâminas no fluido de Carnoy por dois minutos. Finalmente, mergulhe as lâminas em uma série de 100% de etanol, água ultrapura e 100% de etanol novamente, por 30 segundos. Carregue as lâminas de amostra em uma caixa de lâminas de plástico que é preenchida até o topo com 20 milimolares tris HCO.
Feche a caixa e coloque-a em banho-maria contendo 500 mililitros de água, permitindo que a caixa toque o fundo da banheira. Em seguida, aqueça a caixa por 15 minutos a 120 graus Celsius em uma panela de pressão, que pode atingir uma pressão operacional de 70 quilopascais. Remova as lâminas, deixe-as esfriar e deixe-as secar em temperatura ambiente por 15 minutos.
Depois de hidrolisadas, cubra as amostras com 10 microlitros de solução de tripsina em água ultrapura, pipetando primeiro 10 microlitros da solução na borda da seção de tecido. Em seguida, usando a mesma ponta de pipeta, arraste a gota por toda a superfície do tecido sob tensão superficial. Depois de permitir que as amostras sequem à temperatura ambiente, monte-as dentro da parte superior da câmara de vapor previamente construída com fita de autoclave em cada borda da lâmina.
Pipete cuidadosamente 600 microlitros de uma solução contendo um volume um-para-um para uma mistura de volume de 100% acetonitrila e 50 milimolares de bicarbonato de amônio no dedo de papel mata-borrão na parte inferior da placa de Petri, até que o dedo pareça estar uniformemente molhado. A pipetagem é extremamente importante porque a pipetagem incorreta resultará na deslocalização de sua matriz e analoides de superfície, o que destruirá as informações espaciais contidas em sua amostra. Coloque a metade superior da câmara de vapor na metade inferior, garantindo que o dedo de papel e a lâmina de amostra se alinhem perfeitamente e sele a câmara ao redor de seu equador com filme de parafina.
Deixe a amostra durante a noite em uma incubadora de 37 graus Celsius para permitir a digestão completa. Depois de digerida, deixar a lâmina de amostra numa balança microanalítica de cinco dígitos. Monte a corrediça no dedo de resfriamento do aparelho de sublimação e prenda-a com fita de cobre da mesma forma descrita para a câmara de vapor.
Coloque 300 miligramas de matriz CHCA em uma placa de Petri de vidro no fundo da câmara e espalhe-a uniformemente para criar uma fina camada de cristais de matriz. Monte o sublimador. E prenda as duas metades com a braçadeira de ferradura.
Suspenda a unidade montada 15 a 20 centímetros acima de um banho de areia, pré-aquecido a 220 graus Celsius, colocando-a em um anel de metal conectado a um suporte de retorta. Conecte a câmara à fonte de vácuo, acione o vácuo e deixe-o estabilizar até aproximadamente 25 militorr por cinco minutos. Embale o dedo de resfriamento até o topo com gelo e adicione 50 mililitros de água.
Deixe o aparelho assentar por mais cinco minutos antes de prosseguir. Abaixe a câmara na superfície do suporte, garantindo que a areia entre em contato completamente com o fundo da câmara. Deixe agir por 45 minutos para criar um revestimento ideal de 0,22 miligramas por centímetro quadrado.
Após 45 minutos, remova a câmara do banho de areia levantando o anel de metal e ventile a câmara. Depois de sublimada, monte a lâmina de amostra dentro da parte superior da câmara de vapor previamente construída, como antes. Pipete cuidadosamente 600 microlitros de uma solução contendo um volume um-para-um para uma mistura de volume de acetonitrila e ácido trifluoroacético em água no mata-borrão na parte inferior da placa de Petri para garantir um revestimento uniforme.
Em seguida, monte a câmara, garantindo que a aba do papel e a lâmina do microscópio estejam perfeitamente alinhadas. Deixe a câmara em uma incubadora de 37 graus Celsius por uma hora. Digitalize a lâmina em um scanner de mesa para criar uma imagem digital.
Carregue a amostra no espectrômetro de massa e analise usando a plataforma de software apropriada. Por fim, analise as amostras conforme descrito no protocolo de texto. Aqui é mostrado um espécime de tecido processado corretamente que foi fotografado a 50 mícrons e mostra boa macroestrutura e clara diferença entre substância branca e substância cinzenta.
Amostras comparadas com sucesso mostrarão uma diferenciação clara em diferentes locais do tecido. Aqui, há uma região clara de regulação positiva do peptídeo representada por uma relação massa-carga de 1.085 na região da substância branca, representada pelas regiões brancas. Por outro lado, esta amostra preparada incorretamente mostra um nível de deslocalização em larga escala.
Os padrões das moléculas presentes nos três painéis demonstram claramente que não há uma definição clara entre regiões biológicas ou diferenças na abundância das moléculas exibidas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como preparar suas próprias amostras para análise de imagem peptídica. Com o procedimento adequado, esse método pode ser realizado em oito horas ao longo de dois dias, permitindo uma etapa de digestão durante a noite.
Ao preparar esta metodologia, é importante ter cuidado durante cada etapa. Qualquer dano físico que aconteça ao tecido destruirá as informações espaciais contidas em sua amostra. Tivemos a ideia para essa metodologia quando começamos nossas próprias investigações espaciais IMS e percebemos que não havia outras metodologias definitivas publicadas.
Com pequenas modificações, nossa metodologia pode ser aplicada à análise de proteínas, peptídeos, lipídios e outras pequenas moléculas. Após este procedimento, outras técnicas histológicas, como imunofluorescência e coloração de hematoxilina e eosina, podem ser aplicadas à sua amostra para obter um ponto de referência para seus dados de espectrometria de massa de imagem. Ao trabalhar com produtos químicos potencialmente explosivos, como nitrocelulose líquida, é importante manter os procedimentos de segurança corretos.
Minimizar os volumes de trabalho e descartar seus resíduos imediatamente é extremamente importante.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método reproduzível e confiável para a preparação de tecido fixado com formalina baseada em sublimação, destinada à espectrometria de massa por imagem. A técnica é projetada para ajudar usuários iniciantes a desenvolverem seus próprios fluxos de trabalho de forma eficiente.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Espectrometria de Massa
- Preparação de Tecidos
- Técnicas de Imagem
Fundamentos
- A espectrometria de massa por imagem é uma ferramenta poderosa para analisar amostras de tecido.
- A fixação com formalina é um método comum para preservar tecidos biológicos.
- A reprodutibilidade é crucial para resultados científicos confiáveis.
- Metodologias econômicas são importantes para a adoção generalizada.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método simples e reproduzível para preparação de amostras de tecido.
- Permitir que usuários iniciantes criem seus próprios fluxos de trabalho de imagem.
- Simplificar o processo de preparação de amostras para a espectrometria de massa por imagem de peptídeos.
Métodos Utilizados
- Preparação de lâminas revestidas com nitrocelulose.
- Aplicação de nitrocelulose líquida em lâminas condutoras.
- Criação de um revestimento uniforme de película fina usando tensão superficial.
- Secagem e armazenamento das lâminas à temperatura ambiente.
Principais Resultados
- O método é altamente reproduzível e simples de implementar.
- Metodologias econômicas foram utilizadas com sucesso.
- Usuários iniciantes podem preparar amostras eficientemente sem extensos ensaios empíricos.
Conclusões
- Este protocolo facilita a preparação de amostras de tecido para espectrometria de massa por imagem.
- Ele fornece uma abordagem confiável para pesquisadores na área.
- O método aumenta a acessibilidade para usuários iniciantes em espectrometria de massa.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Peptide-based MALDI MSI workflows face significant challenges in detecting analytes from formalin-fixed tissues due to cross-linking and spatial delocalization risks. This protocol provides a reproducible, cost-effective method to preserve spatial information while maximizing peptide ionization, directly supporting target validation and assay development in discovery pipelines. By enabling reliable peptide detection from archival FFPE samples, it enhances mechanistic de-risking and predictive confidence in early-stage therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting spatially resolved peptides from FFPE archives.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through reproducible sample preparation that maintains tissue integrity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative peptide maps for target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening with preserved spatial context.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via simple, manual coating steps.
- Scalability: Facilitates platform reuse across peptide, lipid, and small molecule screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through consistent FFPE sample handling.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of MSI peptide signals with histopathological references like H&E staining.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing reliable molecular localization data from archival cohorts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, specifically enabling peptide analysis from formalin-fixed samples that would otherwise be inaccessible to MALDI MSI.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting endogenous peptides with spatial resolution.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible matrix coating and analyte localization without delocalization.
- Analytics: Generates quantitative ion intensity readouts that allow comparison of peptide abundance across tissue regions.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows by enabling H&E and immunofluorescence co-registration for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, low-cost capability for peptide MSI applicable across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through spatially resolved peptide detection from FFPE tissue.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via simple, manual steps requiring no automated instrumentation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing false negatives in peptide detection from archival samples.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization by unlocking historical tissue collections for target validation studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology and mass spectrometry sample preparation.
- Depends on standard laboratory equipment including vacuum sublimation apparatus and incubators.
- Necessitates cross-team standardization of FFPE handling and reagent preparation between pathology and analytics teams.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and fixation durations.
- Practical limitations include careful handling of explosive liquid nitrocellulose and precise volume control to prevent analyte delocalization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:29
Preparation of Reagents and Equipment
1:21
Preparation of Tissue Sections and Methylene Crosslink Hydrolysis
2:40
Tissue Digestion
3:57
Matrix Coating via Sublimation
5:26
Recrystallization and Instrumentation
6:20
Results: Correctly and Incorrectly Prepared Human Brain Tissue
7:07
Conclusion
