Preparação ideal de formol fixada amostras para peptídeo baseado Matrix assistida por espectrometria de massa de ionização/dessorção Laser Imaging fluxos de trabalho

O objetivo geral deste procedimento é preparar de forma reprodutível uma amostra de tecido para imagens de espectrometria de massa peptídica. Este método permite que usuários novatos em espectrometria de massa desenvolvam seus próprios fluxos de trabalho de espectrometria de massa de imagem sem passar por longas determinações empíricas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é altamente reprodutível, simples de implementar e usa metodologias econômicas.

Para preparar as lâminas revestidas com nitrocelulose, pipete 40 microlitros de nitrocelulose líquida em uma borda da lâmina condutora do microscópio de óxido de índio e estanho. Usando uma lâmina de microscópio de vidro comum, arraste a nitrocelulose sob tensão superficial pela lâmina para criar um revestimento de filme fino uniforme. Deixe a nitrocelulose secar em temperatura ambiente por 20 segundos e guarde até que seja necessário em temperatura ambiente.

Em seguida, crie câmaras de vapor personalizadas cortando um pedaço de papel mata-borrão grosso grande o suficiente para caber na metade inferior de uma placa de Petri de plástico padrão. Corte o papel para deixar uma tira retangular no centro do mesmo tamanho de uma lâmina de microscópio. Deixe excesso suficiente para que o papel mantenha sua posição na placa de Petri.

Para tecido FFPE, monte as seções nas lâminas ITO pré-revestidas com nitrocelulose, conforme descrito no protocolo de texto. Mergulhe as lâminas em xileno fresco para remover a parafina residual por dois minutos. Lavar as amostras desparafizadas submergindo as lâminas numa série graduada de solventes constituída por uma solução aquosa de etanol a 70% de volume, seguida de etanol a 100%, durante 30 segundos.

Em seguida, mergulhe as lâminas no fluido de Carnoy por dois minutos. Finalmente, mergulhe as lâminas em uma série de 100% de etanol, água ultrapura e 100% de etanol novamente, por 30 segundos. Carregue as lâminas de amostra em uma caixa de lâminas de plástico que é preenchida até o topo com 20 milimolares tris HCO.

Feche a caixa e coloque-a em banho-maria contendo 500 mililitros de água, permitindo que a caixa toque o fundo da banheira. Em seguida, aqueça a caixa por 15 minutos a 120 graus Celsius em uma panela de pressão, que pode atingir uma pressão operacional de 70 quilopascais. Remova as lâminas, deixe-as esfriar e deixe-as secar em temperatura ambiente por 15 minutos.

Depois de hidrolisadas, cubra as amostras com 10 microlitros de solução de tripsina em água ultrapura, pipetando primeiro 10 microlitros da solução na borda da seção de tecido. Em seguida, usando a mesma ponta de pipeta, arraste a gota por toda a superfície do tecido sob tensão superficial. Depois de permitir que as amostras sequem à temperatura ambiente, monte-as dentro da parte superior da câmara de vapor previamente construída com fita de autoclave em cada borda da lâmina.

Pipete cuidadosamente 600 microlitros de uma solução contendo um volume um-para-um para uma mistura de volume de 100% acetonitrila e 50 milimolares de bicarbonato de amônio no dedo de papel mata-borrão na parte inferior da placa de Petri, até que o dedo pareça estar uniformemente molhado. A pipetagem é extremamente importante porque a pipetagem incorreta resultará na deslocalização de sua matriz e analoides de superfície, o que destruirá as informações espaciais contidas em sua amostra. Coloque a metade superior da câmara de vapor na metade inferior, garantindo que o dedo de papel e a lâmina de amostra se alinhem perfeitamente e sele a câmara ao redor de seu equador com filme de parafina.

Deixe a amostra durante a noite em uma incubadora de 37 graus Celsius para permitir a digestão completa. Depois de digerida, deixar a lâmina de amostra numa balança microanalítica de cinco dígitos. Monte a corrediça no dedo de resfriamento do aparelho de sublimação e prenda-a com fita de cobre da mesma forma descrita para a câmara de vapor.

Coloque 300 miligramas de matriz CHCA em uma placa de Petri de vidro no fundo da câmara e espalhe-a uniformemente para criar uma fina camada de cristais de matriz. Monte o sublimador. E prenda as duas metades com a braçadeira de ferradura.

Suspenda a unidade montada 15 a 20 centímetros acima de um banho de areia, pré-aquecido a 220 graus Celsius, colocando-a em um anel de metal conectado a um suporte de retorta. Conecte a câmara à fonte de vácuo, acione o vácuo e deixe-o estabilizar até aproximadamente 25 militorr por cinco minutos. Embale o dedo de resfriamento até o topo com gelo e adicione 50 mililitros de água.

Deixe o aparelho assentar por mais cinco minutos antes de prosseguir. Abaixe a câmara na superfície do suporte, garantindo que a areia entre em contato completamente com o fundo da câmara. Deixe agir por 45 minutos para criar um revestimento ideal de 0,22 miligramas por centímetro quadrado.

Após 45 minutos, remova a câmara do banho de areia levantando o anel de metal e ventile a câmara. Depois de sublimada, monte a lâmina de amostra dentro da parte superior da câmara de vapor previamente construída, como antes. Pipete cuidadosamente 600 microlitros de uma solução contendo um volume um-para-um para uma mistura de volume de acetonitrila e ácido trifluoroacético em água no mata-borrão na parte inferior da placa de Petri para garantir um revestimento uniforme.

Em seguida, monte a câmara, garantindo que a aba do papel e a lâmina do microscópio estejam perfeitamente alinhadas. Deixe a câmara em uma incubadora de 37 graus Celsius por uma hora. Digitalize a lâmina em um scanner de mesa para criar uma imagem digital.

Carregue a amostra no espectrômetro de massa e analise usando a plataforma de software apropriada. Por fim, analise as amostras conforme descrito no protocolo de texto. Aqui é mostrado um espécime de tecido processado corretamente que foi fotografado a 50 mícrons e mostra boa macroestrutura e clara diferença entre substância branca e substância cinzenta.

Amostras comparadas com sucesso mostrarão uma diferenciação clara em diferentes locais do tecido. Aqui, há uma região clara de regulação positiva do peptídeo representada por uma relação massa-carga de 1.085 na região da substância branca, representada pelas regiões brancas. Por outro lado, esta amostra preparada incorretamente mostra um nível de deslocalização em larga escala.

Os padrões das moléculas presentes nos três painéis demonstram claramente que não há uma definição clara entre regiões biológicas ou diferenças na abundância das moléculas exibidas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como preparar suas próprias amostras para análise de imagem peptídica. Com o procedimento adequado, esse método pode ser realizado em oito horas ao longo de dois dias, permitindo uma etapa de digestão durante a noite.

Ao preparar esta metodologia, é importante ter cuidado durante cada etapa. Qualquer dano físico que aconteça ao tecido destruirá as informações espaciais contidas em sua amostra. Tivemos a ideia para essa metodologia quando começamos nossas próprias investigações espaciais IMS e percebemos que não havia outras metodologias definitivas publicadas.

Com pequenas modificações, nossa metodologia pode ser aplicada à análise de proteínas, peptídeos, lipídios e outras pequenas moléculas. Após este procedimento, outras técnicas histológicas, como imunofluorescência e coloração de hematoxilina e eosina, podem ser aplicadas à sua amostra para obter um ponto de referência para seus dados de espectrometria de massa de imagem. Ao trabalhar com produtos químicos potencialmente explosivos, como nitrocelulose líquida, é importante manter os procedimentos de segurança corretos.

Minimizar os volumes de trabalho e descartar seus resíduos imediatamente é extremamente importante.