Name: Preparação ideal de formol fixada amostras para peptídeo baseado Matrix assistida por espectrometria de massa de ionização/dessorção Laser Imaging fluxos de trabalho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda a preparar amostras de tecido fixadas em formol para espectrometria de massa por imagem de peptídeos. Este método reprodutível e econômico permite que usuários iniciantes desenvolvam seus próprios fluxos de trabalho de forma eficiente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores gostaria de reconhecer a Sydney Medical School Foundation e Fundação e Blues para o financiamento de parte deste trabalho através do seu programa de bolsa de doutorado para investigação da doença de Alzheimer e uma concessão de ARC descoberta (DP160102063), atribuído a PKW.

Atenção: Todas as precauções de segurança devem ser seguidas quando efectuar este procedimento, incluindo a utilização de equipamento de protecção adequado (EPI) (por exemplo, aventais, luvas de nitrila, óculos de segurança, etc)
1. preparação de reagentes e equipamentos
<ol><li>
Preparação das soluções
	<ol>
<li>Para preparar 500 mL de fluido do Carnoy, misturar 100% de etanol (EtOH), clorofórmio e ácido acético em um 6: proporção de 3:1 v/v/v num frasco Schott de vidro limpo.</li>
		<li>Para tornar o líquido nitrocelulose (NC), dissolva a membrana NC (comumente usada na mancha ocidental) em acetona pura, por agitação suave, a uma concentração final de 40 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de slides NC revestido
	<ol>
<li>Uso uma técnica semelhante ao usado para a preparação de sangue mancha para exame histológico20 preparar NC revestido slides.</li>
		<li>Pipete 40 µ l de líquido NC sobre uma borda de uma lâmina de microscópio de óxido de estanho (ITO) índio condutora. Usando um microscópio de vidro normal, arraste o slide para criar um revestimento de película fina até o NC sob tensão superficial.</li>
		<li>Permitir que o NC secar em temperatura ambiente por 20 s e então loja até necessários à temperatura ambiente. Armazenamento das amostras sob essas condições pode ser por tempo indeterminado, desde que os tecidos são mantidos e livre de poeira. Nota: Este método de preparação é mais conhecido como "filme fino" e irá produzir um revestimento uniforme que depende da viscosidade do NC, bem como a falta de tensão de superfície de auto-nível no slide. O único cuidado que deve ser tomado quando preparar os slides não está se movendo muito rapidamente, que irá criar estrias de NC, ao invés de uma cobertura completa. Cuidado: Como NC líquido seca muito rapidamente, é essencial trabalhar rapidamente para evitar a secagem a solução antes que tenha sido corretamente se espalhasse. Deve também ter cuidado ao manipular NC em estado líquido, como é um composto altamente energético e não deve contatar uma fonte de ignição para evitar a explosão incendiária. NC também sofre transições endotérmicos ao secar e pode causar queimaduras de frias, se permitiu entrar em contacto prolongado com a pele ou as mãos enluvadas. Para minimizar todos os riscos, apenas pequenas quantidades devem ser preparadas em cada momento (< 1 mL é recomendado). Depois de seco é estável à temperatura ambiente. No entanto, NC pode permanecer explosiva quando presente em grandes quantidades.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Criação de câmaras de vapor personalizado
	<ol>
<li>Corte um pedaço de papel mata-borrão grosso com uma tesoura grande o suficiente para caber no fundo metade de um prato de petri de plástico padrão (94 mm de diâmetro e 3 mm de espessura).</li>
		<li>Corte o papel, deixando uma faixa retangular no centro, o mesmo tamanho como uma lâmina de microscópio, deixando excesso suficiente para que o papel vai manter sua posição na caixa de Petri (complementar a Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação de cortes de tecido
<ol><li>
FFPE tecido21.
	<ol>
<li>Selecione a seção em 12 µm espessura em um banco padrão montado micrótomo e flutuar de montagem para o NC pré-revestido ITO slides e bloco de tecido desejado.</li>
		<li>Mergulhe os slides em xilol fresca para remover a parafina residual por 2 min e repita a operação uma segunda vez. Nota: Se o bloco de parafina é especialmente penetrante ou o tecido é relativamente pequeno em comparação com o bloco de parafina, as amostras podem ser aquecidas a 60 ° C para derreter a maioria embora antes da lavagem em xilol.</li>
		<li>Lavar as amostras deparaffinized submergindo os slides em uma série de solvente classificado: 70% v/v EtOH/água, 100% EtOH, fluido de Carnoy, 100% EtOH, água ultra pura e 100% EtOH. A duração de cada submersão deve ser de 30 s, com exceção de fluido do Carnoy, que deve durar 2 min. Cuidado: Do Carnoy fluido e xileno devem ser armazenados e utilizados em uma coifa, como eles são altamente tóxicos se inalado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tecido congelado fixada em formol (FFF) Nota: As amostras devem já congeladas, apropriadamente de acordo com o tipo de amostra.<ol>
<li>Equilibrar o bloco de tecido na temperatura de funcionamento do micrótomo para 20 min22. Nota: A temperatura de equilíbrio é depende do tipo de tecido.</li>
		<li>Seção o tecido usando um micrótomo em 12 montagem µm e descongelar as seções em um NC pré-preparadas revestido ITO deslize.</li>
		<li>Armazene os slides num exsicador de vácuo no banco no escuro. Nota: As amostras podem ser armazenadas por várias semanas sob essas condições.</li>
		<li>Lave as amostras em uma série de solvente classificada como afirmado por tecido FFPE (2.1.3). Nota: Não há nenhuma necessidade para uma etapa de deparaffinisation xileno como a amostra não é incorporada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. metileno Crosslink hidrólise
<ol><li>Carrega os slides de amostra (FFF ou FFPE) em uma caixa de plástico slide que está cheio até o topo de 20 mmol tris-HCl (pH 8,8). Feche a caixa e coloque-o em um banho de água, contendo 500 mL de água, permitindo que a caixa para tocar o fundo. Então aquecê-lo por 15 min a 120 ° C em uma panela de pressão que pode atingir uma pressão de operação de 70 kPa.</li>
	<li>Remover as lâminas, permitir-lhes esfriar e deixe-os secar à temperatura ambiente por 15 min.</li>
</ol>4. tecido digestão
<ol><li>Quando hidrolisada, casaco as amostras com 10 µ l de solução de tripsina (1 mg/mL) em água ultra pura, por pipetagem 10 µ l da solução para a borda da seção de tecido em seguida, usando a mesma ponta da pipeta, arraste toda a superfície do tecido sob a superfície da gota tensão. Nota: Evite riscar a superfície do tecido com a ponta da pipeta e sobre espalhando a enzima para além das fronteiras das bordas do tecido.</li>
	<li>Permitir que as amostras secar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Depois de seco, monte as amostras dentro da parte superior da câmara de vapor anteriormente construído (tecido voltada para baixo) com fita de autoclave em qualquer borda do slide (complementar a Figura 2).</li>
	<li>Pipete 600 µ l de uma solução contendo uma mistura de 1:1 v/v de bicarbonato de amónio acetonitrilo e 50 mM 100% cuidadosamente sobre o dedo de papel mata-borrão na parte inferior da caixa de Petri, até o dedo parece ser uniformemente molhado.</li>
	<li>Coloque a metade superior da câmara de vapor na parte inferior metade, garantindo o slide de dedo e amostra de papel alinhar perfeitamente e selar a câmara em torno de seu Equador com película de parafina.</li>
	<li>Deixe a amostra durante a noite em uma incubadora de 37 ° C para permitir a digestão completa.</li>
</ol>5. matrix revestimento através de sublimação
<ol><li>Uma vez digerido, pese o slide de exemplo em um equilíbrio de microanalytical de 5 dígitos.</li>
	<li>Montar o slide para o arrefecimento dedo do aparato de sublimação e fixe-a com fita de cobre, da mesma forma como descrito para a câmara de vapor (complementar a Figura 3). Nota: Para garantir que o slide é contatado uniformemente pelo dedo refrigeração, uma camada de fita de cobre é colocada na parte inferior do dedo refrigerando para nivelar a superfície. Isso garante que o slide é uniformemente resfriado que leva ao mesmo deposição de matriz.</li>
	<li>Coloque 300 mg de matriz de ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos (CHCA) em um prato de petri de vidro na parte inferior da câmara e se espalhar uniformemente para criar uma fina camada de cristais de matriz.</li>
	<li>Montar o Sublimador e prenda as duas metades com a braçadeira de ferradura. Suspenda o montado unidade 15-20 cm acima de um banho de areia, pré-aquecido a 220 ° C, colocando-o em um anel de metal ligado a um stand da retorta.</li>
	<li>Ligue a câmara à fonte de vácuo, envolver-se o vácuo e permitir que estabilizar até mTorr ~ 25 por 5 min.</li>
	<li>Embalar o dedo refrigerando para o topo com gelo e adicionar 50 mL de água. Permitir que o aparelho para se contentar com um mais 5 min antes de prosseguir.</li>
	<li>Abaixe a câmara para a superfície da areia, garantindo que a areia completamente entra em contato com o fundo da câmara e deixá-lo por 45 min criar um revestimento ideal de 0,22 mg/cm2 PRECAUÇÃO: Deve ter cuidado ao manipular produtos vidreiros em alto vácuo, como qualquer dano ao aparelho, quando evacuado, pode resultar em uma falha catastrófica da câmara de vidro.</li>
	<li>Depois de 45 min, remova a câmara do banho de areia, levantando-se do anel metálico e a câmara de ventilação. Nota: Uma vez que a câmara tem sido ventilada, o slide deve ser removido muito rapidamente como água no ar começa a condensar no slide dedo e amostra de congelação.</li>
	<li>Remover o slide e pesá-lo para assegurar o revestimento desejado foi alcançado. Nota: Se foi conseguido revestimento insuficiente, simplesmente repita o processo de sublimação para o slide até a espessura de revestimento desejado tenha sido alcançada.</li>
</ol>6. recristalização
<ol><li>Uma vez sublimada, monte o slide de amostra para dentro da parte superior da câmara de vapor anteriormente construído, como descrito (tecido anterior voltada para baixo).</li>
	<li>Pipete 600 µ l de uma solução contendo uma mistura de 1:1 (v/v) de 100% acetonitrila e 0,1% v/v ácido trifluoroacético em água cuidadosamente sobre o papel mata-borrão na parte inferior da caixa de Petri para assegurar um revestimento mesmo.</li>
	<li>Montar a câmara, garantindo o slide papel de guia e microscópio alinhar perfeitamente e deixar em uma incubadora de 37 ° C por 1 h. Cuidado: Não veda a câmara. Nota: Uma vez recristalizado, normalmente amarelo hue da matriz deve mudar para branco, olhar menos brilhante e aparecem muito mesmo. Isso indica que a recristalização foi executada corretamente.</li>
	<li>A amostra está agora pronta para análise.</li>
</ol>7. instrumentação
<ol><li>Digitalize o slide em um scanner de mesa para criar uma imagem digital.</li>
	<li>Carregar a amostra para o espectrômetro de massa e em seguida analisar usando a plataforma de software apropriado.</li>
	<li>Analise as amostras no modo de reflectron íon positivo com uma escala em massa de 750-3.500 Da, com uma resolução de ponto é aplicável para o resultado desejado. Na maioria dos casos, 20-50 µm Largura de varredura é suficiente, no entanto, tão pouco quanto 10 µm podem ser usados15. Cuidado: MALDI UV lasers são uma fonte de radiação ionizante e não devem ser vistos diretamente. Certifique-se de que o laser está contido em instrumento de proteção antes da operação.</li>
</ol>

<ol><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%3A+practical+aspects+of+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation.</a> J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Imaging+of+Biological+Samples%3A+Localization+of+Peptides+and+Proteins+Using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS.</a> Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).</li>
<li>Jackson, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-Ion+Mobility+Mass+Spectrometry+of+Lipids+in+Negative+Ion+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+methods+%3A+advancing+methods+and+applications%22%5BJournal%5D)">MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode.</a> Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-instrument-based+method+for+the+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+spinal+cord+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+cost-effective+method+for+the+analysis+of+fresh+frozen+tissue+sections+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).</li>
<li>Chughtai, K., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+imaging+for+biomedical+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis.</a> Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometry-assisted+molecular+imaging+of+metabolites+during+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula-Sinorhizobium+meliloti+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis.</a> Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).</li>
<li>Powers, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry+profiling+of+N-glycans+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+clinical+tissue+blocks+and+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays.</a> PLoS One. 9 (9), 10655(2014).</li>
<li>Rompp, A., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+with+high+resolution+in+mass+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space.</a> Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).</li>
<li>Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+an+emerging+technology+in+neuropsychopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology.</a> Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).</li>
<li>Alexandrov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry%3A+statistical+data+analysis+and+current+computational+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 11(2012).</li>
<li>Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry%3A+From+tissue+sections+to+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).</li>
<li>Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+in+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry in microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).</li>
<li>O'Rourke, M., Padula, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/protocolexchange/protocols/5695">The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis.</a> Protocol Exchange. , (2017).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+standard+of+visual+data+representation+for+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry.</a> Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue+via+proteomic+techniques+and+misconceptions+of+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval.</a> Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).</li>
<li>Casadonte, R., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).</li>
<li>Ong, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+Imaging+and+Identification+of+Peptides+Associated+with+Cephalic+Ganglia+Regeneration+in+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea.</a> J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+proteins+in+tissues+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-smear+showing+Experimental+Infection+with+Herpetomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Med%22%5BJournal%5D)">Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas.</a> Proc R Soc Med. 18, Sect Trop Dis Parasitol 55(1925).</li>
<li>Gorrie, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+human+OEC-derived+cell+transplants+in+rodent+spinal+cord+contusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury.</a> Brain Res. 1337, 8-20 (2010).</li>
<li>Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Tissue+Derivatization+via+Electrospray+Deposition+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry+Imaging+of+Endogenous+Fatty+Acids+in+Rat+Brain+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues.</a> Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).</li>
<li>Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+NIMS+and+MALDI+platforms+for+neuropeptide+and+lipid+mass+spectrometric+imaging+in+C.+borealis+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue.</a> Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).</li>
<li>Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+pressure+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+tissues+and+cells+at+1.4-mum+lateral+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution.</a> Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).</li>
<li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+sublimation%2Frecrystallization+for+imaging+proteins+by+mass+spectrometry+at+high+spatial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution.</a> Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).</li>
<li>Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometric+imaging+of+biological+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections.</a> Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).</li>
<li>Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+gallotannins+and+monoterpene+glucosides+in+the+root+of+Paeonia+lactiflora%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora.</a> Sci Rep. 6, 36074(2016).</li>
<li>Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+of+biomolecular+information%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging of biomolecular information.</a> Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).</li>
<li>Widlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+signatures+of+oral+squamous+cell+carcinoma+and+normal+epithelium+-+application+of+a+novel+methodology+for+unsupervised+segmentation+of+imaging+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium - application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data.</a> Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm conflito de interesse ou interesse comercial para divulgar

Este protocolo foi projetado para maximizar a geração de espécies moleculares ionizáveis, eliminando a deslocalização dos analitos. Fatores-chave envolvem usando os mesmos princípios de substituição, ao aplicar a matriz, digerindo a amostra, ou recristalização após sublimação24; ou seja, que um mesmo deposição de vapor, de matriz ou caso contrário, precisa ser criado e mantido. Pipetagem lavagens de solventes para a recristalização e digestão, uniformemente debaixo da amostra, impede qualquer área...

Espectrometria de massa de ionização/dessorção do laser assistida por matriz (MALDI MSI) de imagem tem sido utilizada como uma técnica de imagem com base para duas décadas1,2, analisando uma série de biomoléculas incluindo: lipídios3, peptídeos2 ,4, proteínas de2,5, metabólitos6,7, os N-glicanos8e moléculas sintéticas tais como drogas terapêuticas9,10. O número de publicações, demonstrando a utilidade desta técnica tem crescido significativamente ao longo da última década,6,11,12,13. Certas moléculas, como lipídios, são relativamente fáceis de analisar através de MALDI MSI, como eles ionizam facilmente devido à sua natureza química e, portanto, requerem pouca preparação prévia3. No entanto, para alvos mais difíceis, como peptídeos, as etapas necessárias para ionizar eficazmente estas moléculas são extensos e complicados geralmente14. Atualmente, existem poucas publicações que visam endereço ou demonstram reprodutibilidade nas metodologias que são utilizadas para preparar o tecido para esta técnica visual original15. Por esta razão, nós temos compilado observações e implementado otimizações em um único, fácil de implementar, metodologia que não requer pouca ou nenhuma modificação, para a análise de peptídeos formol um reticulado tecido fonte14.
Neste manuscrito, descrevemos uma metodologia reproduzível validada, de baixo custo para a detecção e mapeamento espacial de peptídeos, gerados a partir de congelados fixada em formol (FFF) e fixada em formol parafina (FFPE) cortes histologicos. Esta metodologia não exigem ou dependem de qualquer instrumentação especializada3. Especificamente, abordamos os muitos aspectos especializados da preparação da amostra necessário para analisar os peptídeos; etapas como antígeno recuperação16 e revestimento de matriz. Nosso protocolo também utiliza equipamento barato e reagentes, tornando esta metodologia acessível para uma comunidade mais alargada, que seria incapaz de pagar os aparelhos robóticos alternativo17.
O raciocínio por trás do desenvolvimento de um método de preparação de amostra manual foi dupla: em primeiro lugar, o uso de um Sublimador cria um revestimento consistente e homogêneo dos cristais de matriz que são ~ 1 µm no comprimento18, algo inatingível com pulverização mais comuns técnicas. Em segundo lugar, o conjunto relativamente pequeno de custos: o custo total do aparelho personalizado foi <$ 1500 AUD. Notamos que, em termos de custo-eficácia, o preço por exemplo é muito mais barato quando não há nenhuma maquinaria robótica envolvidos. O uso de sublimação foi relatado anteriormente, no entanto, para o melhor de nosso conhecimento, metodologias passo a passo que descrevem este processo e preparação da amostra não tem sido relatadas nem descritas na literatura.
Este protocolo destina-se a auxiliar os pesquisadores que têm acesso a um espectrômetro de massa MALDI e que têm a intenção de gerar informação espacial em relação a uma bio-molécula de interesse19. Em essência, MALDI MSI é uma forma de histológica de rastreio que não depende de anticorpos ou manchas2.

<table><tbody><tr><td>Micrótomo criogênico</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td>Para preparação e seção de tecido.</td></tr><tr><td>O microscópio do óxido de estanho do índio desliza</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>Para a preparação e a seção do tecido.</td></tr><tr><td>Frascos Coplin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5516</td><td>Para preparação e secção de tecido.</td></tr><tr><td>Panela de pressão</td><td>Kambrook</td><td>KPR620BSS</td><td>Para preparação e secção de tecido.</td></tr><tr><td>Sublimador</td><td>Chem Glass</td><td>NA</td><td>Para procedimento de sublimação. Semelhante em design ao CG-3038, no entanto, foi feito sob medida&nbsp;</td></tr><tr><td>Banho de areia</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Para procedimento de sublimação. Areia de rio de grau fino mantida em folha de alumínio dobrada proveniente de fora, não de nenhuma empresa específica</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS70165100</td><td>Para procedimento de sublimação.</td></tr><tr><td>Bomba de vácuo</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Para procedimento de sublimação. Obtido como peça de reposição de um antigo espectrômetro de massa&nbsp;</td></tr><tr><td>Armadilha fria</td><td>Chem Glass</td><td>CG-4510-02</td><td>Para procedimento de sublimação.</td></tr><tr><td>Placa Quente</td><td>John Morris</td><td>EW-15956-32.&nbsp;</td><td>Para procedimento de sublimação.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de plástico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z717223</td><td>Para procedimento de sublimação.</td></tr><tr><td>37 &graus; C incubadora</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Para procedimento de sublimação. Não aplicável, a incubadora não é estéril e tem mais de 30 anos&nbsp;</td></tr><tr><td>Papel mata-borrão</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7796</td><td>Para procedimento de sublimação.</td></tr><tr><td>Nitrocelulose&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8395</td><td>Para lavagem de slides.</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td>Para lavagem de lâminas.</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td>Para lavagem de slides.</td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.02428</td><td>Para lavagem de slides.</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Para lavagem de slides. Feito em laboratório com 95% de etanol em estoque&nbsp;</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432</td><td>Para lavagem de slides.</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Para lavagem de lâminas.</td></tr><tr><td>Tris HCL pH 8,8</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>Para clivagem proteolítica. Pó feito a 1M seguido de equilíbrio com 32% de HCl a PH 8,8</td></tr><tr><td>Milli Q Água Ultrapura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Para clivagem proteolítica. Purificação realizada em casa pelo sistema de purificação de água sartorious</td></tr><tr><td>Bircarbonato de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Para clivagem proteolítica.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0303</td><td>Para clivagem proteolítica.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2020</td><td>Para recristalização.</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.00029</td><td>Para recristalização.</td></tr><tr><td>Ácido Trifluoroacético (TFA)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td>Para recristalização.</td></tr></tbody></table>

preparação ideal de formol fixada amostras para peptídeo baseado matrix assistida por espectrometria de massa de ionização/dessorção laser imaging fluxos de trabalho

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

O uso de laser assistida por matriz dessorção/ionização, espectrometria de massa (MALDI MSI) de imagem rapidamente expandiu-se, uma vez que esta técnica analisa uma série de biomoléculas de drogas e lipídios para os N-glicanos. Embora existam várias técnicas de preparação de amostra, detectar peptídeos formol preservados os tecidos continua a ser um dos mais difíceis desafios para este tipo de análise de espectrometria de massa. Por esta razão, temos criado e otimizado de uma metodologia robusta que preserva as informações espaciais contidas dentro da amostra, enquanto a suscitar o maior número de peptídeos ionizáveis. Nós também ter mirado para alcançar este objectivo de forma simples e rentável, eliminando assim o possível erro viés ou preparação, que pode ocorrer quando usando automatizado instrumentação. O resultado final é um protocolo reprodutível e de baixo custo.

Se seguidas corretamente, este protocolo produz imagens que representam claramente a morfologia bruta do tecido sem nenhum arranhão ou outras deformações (Figura 1). A validação ideal para uma preparação de amostra realizada corretamente, é a capacidade de distinguir entre diferentes estruturas físicas, alterando a molécula sendo vistos (Figura 2).
Um bom guia para dete...

Este protocolo descreve um método reprodutível e confiável para preparação de formol fixada tecido destinado a espectrometria de massa de imagens baseada em sublimação.

Preparação ideal de formol fixada amostras para peptídeo baseado Matrix assistida por espectrometria de massa de ionização/dessorção Laser Imaging fluxos de trabalho

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar de forma reprodutível uma amostra de tecido para imagens de espectrometria de massa peptídica. Este método permite que usuários novatos em espectrometria de massa desenvolvam seus próprios fluxos de trabalho de espectrometria de massa de imagem sem passar por longas determinações empíricas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é altamente reprodutível, simples de implementar e usa metodologias econômicas.Para preparar as lâminas revestidas com nitrocelulose, pipete 40 microlitros de nitrocelulose líquida em uma borda da lâmina condutora do microscópio de óxido de índio e estanho. Usando uma lâmina de microscópio de vidro comum, arraste a nitrocelulose sob tensão superficial pela lâmina para criar um revestimento de filme fino uniforme. Deixe a nitrocelulose secar em temperatura ambiente por 20 segundos e guarde até que seja necessário em temperatura ambiente.Em seguida, crie câmaras de vapor personalizadas cortando um pedaço de papel mata-borrão grosso grande o suficiente para caber na metade inferior de uma placa de Petri de plástico padrão. Corte o papel para deixar uma tira retangular no centro do mesmo tamanho de uma lâmina

optimal-preparation-formalin-fixed-samples-for-peptide-based-matrix

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Formalina de arquivo fixo e incluído em parafina (FFPE) amostras clínicas são material valioso para a investigação de doenças. Aqui demonstramos um fluxo de trabalho de preparação da amostra, permitindo uma análise em profundidade proteômica de tecido FFPE microdissecção.

Preparação de Amostras de proteômica fixados em formalina e embebidos em parafina Tissue

Ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) foi previamente relatada como uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecido de pequenas moléculas; protocolos para a utilização de DT para a imagiologia de MALDI de lípidos endógenos na superfície de cortes de tecido por positivo-ion MALDI-MS em um ultra-alta resolução quadrupolo-FTICR instrumento são fornecidos aqui.

Dithranol como Matrix Assisted Laser Matrix para dessorção / ionização de imagem em um Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Linhas celulares de cancro imortalizadas pode ser cultivada como culturas de células em 3D, um modelo valioso para a pesquisa biológica. Este protocolo descreve imaging espectrometria de massa de culturas de células em 3D, incluindo melhorias na plataforma de preparação de amostras. O objetivo deste protocolo é para instruir os usuários a preparar culturas de células em 3D para análise de imagem espectrometria de massa.

Amostra Estratégias Preparação para Mass Spectrometry imagem da cultura celular 3D Models

precursor marcação isotópica combinados e marcação isobaric (cPILOT) é uma estratégia proteômica quantitativa que aumenta a capacidade de multiplexação de amostras de etiquetas isobáricos. Este protocolo descreve a aplicação de cPILOT aos tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer.

Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

Um protocolo para melhorar os sinais de íon de carboidrato em espectrometria de massa MALDI por reformas estruturas cristalinas durante os processos de preparação de amostra é demonstrado.

Um método de preparação de amostra eficiente para melhorar os sinais de íon carboidrato em espectrometria de massa de ionização/dessorção de Matrix-assisted Laser

Caracterização do Proteome de leitos microvasculares oculares é crucial para a compreensão aprofundada de muitas patologias oculares em seres humanos. Este estudo demonstra um método eficaz, rápido e robusto para a extração de proteínas e preparação da amostra de pequenos vasos sanguíneos, empregando porcinos curtas posteriores artérias ciliares como vasos de modelo para análise proteômica de espectrometria de massa-base.

Preparação da amostra para análise de Proteomics baseados em massa-espectrometria de Microvessels Ocular

O protocolo descrito fornece uma análise de proteômica quantitativa otimizada das amostras de tecido usando duas abordagens: quantitação baseada em rótulos e sem rótulos. As abordagens baseadas em rótulos têm a vantagem de uma quantitação mais precisa de proteínas, enquanto uma abordagem sem rótulos é mais econômica e usada para analisar centenas de amostras de uma coorte.

Fluxo de trabalho abrangente da proteômica de espingarda baseada em espectrometria de massa de amostras de tecido

O objetivo deste protocolo é fornecer orientação detalhada sobre a preparação da amostra ao planejar experimentos usando MALDI MSI para maximizar a detecção metabólica e molecular em amostras biológicas.

Preparação de amostras para perfil metabólico usando imagem de espectrometria de massa MALDI

Este artigo descreve um método de preparação amostral baseado na inativação de calor para preservar peptídeos endógenos evitando a degradação pós-morte, seguido de quantitação relativa usando rotulagem isotópica mais LC-MS.

Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica

Este protocolo teve como objetivo descrever orientações detalhadas sobre a preparação de seções de amostras de sementes duras com baixo teor de água para análise de MALDI-IMS, mantendo a distribuição e abundância originais dos analitos e fornecendo sinal de alta qualidade e resolução espacial.

Preparação de sementes de palma dura para análise por espectrometria de massa assistida por dessorção/ionização assistida por matriz

Aprenda a preparar amostras de tecido fixadas em formol para espectrometria de massa por imagem de peptídeos. Este método reprodutível e econômico permite que usuários iniciantes desenvolvam seus próprios fluxos de trabalho de forma eficiente.

Preparação ideal de formol fixada amostras para peptídeo baseado Matrix assistida por espectrometria de massa de ionização/dessorção Laser Imaging fluxos de trabalho (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação ideal de formol fixada amostras para peptídeo baseado Matrix assistida por espectrometria de massa de ionização/dessorção Laser Imaging fluxos de trabalho

Explorar mais vídeos