Um cinética baseada em fluorescência Ca^{2 +} mobilização ensaio para identificar agonistas do Receptor acoplado à proteína G, antagonistas e moduladores alostéricos

O objetivo geral deste ensaio baseado em células é identificar e caracterizar moléculas capazes de estimular ou inibir a mobilização intracelular de cálcio mediada por receptor acoplado à proteína G. Este método pode ser um ensaio valioso para a descoberta de medicamentos com receptores acoplados à proteína G, pois pode ser usado para rastrear moléculas que modificam os corpos de cálcio intracelulares mediados por receptores. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que moléculas com propriedades agonísticas ou antagônicas sejam identificadas dentro de um mesmo ensaio.

Este ensaio pode ajudar na descoberta de novos candidatos a medicamentos que atuam em receptores acoplados à proteína G, prometendo alvos terapêuticos que desempenham um papel em muitas doenças humanas. No dia da passagem celular, cubra cada poço de uma placa de poliestireno de 96 poços de parede preta com fundo transparente com 100 microlitros de solução de gelatina a 0,1% e incube as placas por duas horas em temperatura ambiente. Enquanto a gelatina está solidificando, use uma solução de tripsina EDTA para levantar as células de interesse do fundo de seu frasco de cultura, ressuspendendo as células em meio de crescimento fresco em um tubo cônico de 50 mililitros depois de se separarem.

Após a contagem, recolher as células por centrifugação e ressuspender o pellet em meio de crescimento fresco a uma concentração de uma vez 10 elevado ao quinto de células viáveis por mililitro. Quando as placas estiverem prontas, descarte o excesso de solução de gelatina e seque as placas em um lenço de papel. Em seguida, lave os poços com 200 microlitros de PBS e substitua a lavagem por 200 microlitros de células por poço para uma incubação noturna a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Na manhã seguinte, bata no prato para descartar o meio de crescimento dos poços e seque o prato de cabeça para baixo em uma toalha de papel. Em seguida, rotule as células em cada poço com 100 microlitros de solução de corante de carga por poço e incube a placa por 45 minutos no escuro à temperatura ambiente. Enquanto as células estão incubando, adicione 75 microlitros de CXCL12 por poço à placa de quimiocina e 50 microlitros do composto de interesse a cada poço da placa composta.

Em seguida, ligue a unidade de resfriamento do leitor de placa de fluorescência seguida pelo próprio leitor de placa. Depois de permitir que o sistema inicie alguns minutos, abra o software do leitor de placas. Para configurar o protocolo de ensaio, na guia de configurações, selecione o modo de leitura e os comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados para o corante de carregamento.

Selecione a mistura com a guia de fluido de transferência para mistura automática dos compostos na placa composta. Na guia de fluido de transferência, defina 20 microlitros de cada poço da placa composta a ser transferida para a placa de medição e posicione as pontas da pipeta a 20 microlitros abaixo da superfície do líquido. Defina a velocidade de aspiração para 50 microlitros por segundo e a velocidade de distribuição para 25 microlitros por segundo e clique em ler com fluido de transferência.

Durante o primeiro intervalo, selecione 60 leituras com um tempo de intervalo de leitura de um segundo, com 10 leituras a serem registradas antes que os compostos sejam dispensados na placa de medição e 50 leituras a serem concluídas depois. Defina o segundo intervalo com um tempo de intervalo de leitura de 30 segundos e 18 leituras. Selecione três lavagens de ponta para o protocolo, definindo cada etapa de lavagem para incluir o fluido de lavagem apropriado, um ciclo de lavagem, uma velocidade de bomba rápida e cinco golpes por lavagem.

Use a função de pipetador de pausa para incluir a pausa do pipetador de 300 segundos e use a configuração de mistura com fluido de transferência para permitir a mistura automática da solução CXCL12 dentro da placa de quimiocina. Na guia de fluido de transferência subsequente, defina 25 microlitros de cada poço da placa de quimiocina a ser transferida para a placa de medição e posicione as pontas 20 microlitros abaixo da superfície do líquido. Defina a velocidade de aspiração para 50 microlitros por segundo e a velocidade de distribuição para 25 microlitros por segundo.

Use o botão de leitura com fluido de transferência para definir o primeiro intervalo para incluir 145 leituras com um tempo de intervalo de leitura de um segundo. Defina o segundo intervalo para um tempo de intervalo de leitura de seis segundos e 20 leituras. Selecione mais três ciclos de ponta de lavagem.

Em seguida, clique em definir stage temperatura e defina a temperatura do dispositivo para 37 graus Celsius. No final da incubação do corante de carga, descarte o tampão da placa de medição e seque a placa em um lenço de laboratório. Lave as células com 150 microlitros por poço de tampão de ensaio, substituindo o tampão por 80 microlitros de tampão de ensaio após dois minutos.

Coloque a placa de medição na posição de leitura, a placa composta na posição de fonte dois, a placa de quimiocina na posição de fonte três e uma caixa de pontas pretas na posição de origem um. Feche o dispositivo e clique no teste de sinal de protocolo para determinar as unidades de luz relativas de fundo e a variação de fluorescência sobre a placa. Selecione o sinal de teste na janela pop-up.

Se forem obtidos valores de fundo de 8.000 a 10.000 unidades de luz relativa, selecione atualizar e clique em salvar para salvar o protocolo principal. Em seguida, pressione run para iniciar o ensaio. Neste gráfico, pode-se observar um aumento dependente da dose na fluorescência correlacionado com o aumento dependente da dose na liberação de cálcio.

Níveis crescentes de fluorescência induzida por CXCL12 permitem a geração de uma curva de resposta à dose com base na diferença entre a resposta mínima e máxima sobre a linha de base entre a primeira medição após a adição da quimiocina e a medição final no protocolo. Nenhuma resposta fluorescente relacionada ao cálcio foi evocada pelo CXCL12, mesmo em alta concentração, quando células sem o receptor de quimiocina funcional correspondente CXCR4 foram usadas, demonstrando a especificidade do receptor da medição evocada por CXCL12. Uma aplicação importante para este ensaio baseado em células é identificar pequenas moléculas que, após a pré-incubação, inibem de forma dependente da dose a mobilização de cálcio induzida por CXCL12 nas células em comparação com compostos não ativos de controle que não inibem a resposta.

Para determinar a potência inibitória de pequenas moléculas, uma curva de resposta à dose pode ser gerada para as moléculas inibitórias usando regressão não linear. Este ensaio pode ser usado para estudar outros receptores acoplados à proteína G com nenhuma ou apenas mínima otimização adicional, bem como neste experimento em que um aumento dependente da dose na fluorescência foi observado quando outro receptor de quimiocina, CCR5, foi estimulado com seu agonista de quimiocina natural CCL5. Uma vez dominada, esta técnica pode ser usada para estudar muitos outros receptores acoplados à proteína G que sinalizam através da mobilização de íons de cálcio intracelulares após a ativação do receptor.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como esse ensaio celular pode ser usado para identificar agonistas e antagonistas do receptor de quimiocina CXCL4.