Zika vírus específico diagnóstico Epitope Discovery

O objetivo geral deste experimento é identificar peptídeos específicos do vírus Zika para uso em um ensaio diagnóstico para detectar anticorpos contra o vírus Zika. Isso é crítico, pois o vírus desaparece do sangue em aproximadamente 10 dias, enquanto os anticorpos persistem por anos. Este método nos permite identificar antígenos e epítopos utilizando um microarray de todo o proteoma do Zika para identificar peptídeos que capturam anticorpos IgM ou IgG em uma amostra de soro de um indivíduo infectado.

A principal vantagem na detecção de anticorpos iniciais, IgM, e anticorpos posteriores, IgG, é fornecer ao médico uma linha do tempo da infecção. E isso é particularmente importante em mulheres grávidas. Embora esse protocolo forneça informações sobre a causa da infecção pelo zika vírus, ele pode ser aplicado a outros patógenos, usando um microarray específico para esse patógeno se sua sequência de proteínas for conhecida.

Manuseie a lâmina de vidro pelas bordas usando luvas sem pó. As dimensões da lâmina de vidro são 75,4 milímetros por 25,0 milímetros e 1 milímetro de espessura. Coloque a lâmina na bandeja de incubação com a superfície do microarray voltada para cima.

Preencha os suportes de lâminas vazios com lâminas em branco para evitar que a lâmina de microarray se quebre. Coloque o lado brilhante do selo voltado para baixo na superfície impressa do microarray. Para garantir uma boa posição, sobreponha os orifícios dos parafusos da vedação e da placa de base.

Coloque a parte superior da bandeja na vedação para criar uma câmara de microarray. Prenda a corrediça na bandeja apertando igualmente os parafusos de aperto manual, um após o outro, com a mão em um padrão alternado. Comece no canto superior esquerdo e prossiga para o canto inferior direito.

Coloque a tampa na bandeja de incubação. O manuseio cuidadoso do microarray é essencial para evitar arranhões na superfície do microarray. As soluções são adicionadas e depois removidas do canto da câmara de microarray.

A secagem do microarray também é importante para fornecer uma boa imagem de digitalização. Incube o microarray com 2.000 microlitros de tampão padrão por microarray por 15 minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital a 140 rpm. Remova o tampão padrão aspirando com uma pipeta do canto da câmara do microarray e, em seguida, bloqueie o microarray com um tampão de bloqueio por 60 minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital a 140 rpm.

Remova o tampão de bloqueio aspirando do canto da câmara de microarray com uma pipeta. Adicione anticorpo secundário conjugado com fluorocromo IgM anti-humano diluído 1:5, 000 no tampão de coloração ao microarray. Em seguida, incube o microarray por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro em um agitador orbital a 140 rpm.

Use uma pipeta para remover o anticorpo secundário aspirando do canto da câmara de microarray. Lave o microarray por um minuto com 2000 microlitros com tampão padrão por microarray à temperatura ambiente em um agitador orbital a 140 rpm. Remova o tampão padrão usando a técnica demonstrada e repita a lavagem duas vezes.

Em seguida, mergulhe a lâmina duas vezes em 200 mililitros de um tampão de imersão recém-preparado. Seque o microarray cuidadosamente por aproximadamente um minuto, aspirando o excesso de fluido com muito cuidado de cima para baixo da lâmina sem tocar na superfície da lâmina. Analise a lâmina em um leitor de scanner de microarray, conforme demonstrado posteriormente neste vídeo.

Inative a amostra de soro a 56 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, centrifugar a amostra a 16 000 RCF durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Manter a amostra a quatro graus Celsius até à utilização.

Em seguida, incube o microarray com o tampão de coloração por 15 minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital a 140 rpm. Remova o tampão de coloração aspirando do canto da câmara de microarray com uma pipeta. Diluir a amostra de soro e o tampão de coloração começando com uma diluição de 1:1.000.

Incubar a amostra diluída com o microarray durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador orbital a 140 rpm. Remover a amostra de soro diluído utilizando a técnica demonstrada. Em seguida, lave o microarray três vezes como antes.

Diluir o anticorpo secundário no tampão de coloração. Use anticorpo conjugado com fluorocromo IgM humano ou anticorpo conjugado com fluorocromo IgG humano em uma diluição de 1:5.000 em tampão de coloração. Em seguida, misture o anticorpo marcado com controle em uma diluição de 1:1000 em tampão de coloração com o anticorpo secundário diluído.

Incubar com o microarray por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro e em um agitador orbital a 140 rpm. Remova a mistura de anticorpos secundários diluídos e marcados aspirando do canto da câmara de microarray com uma pipeta. Em seguida, lave o microarray três vezes com tampão padrão.

Cada lavagem é de um minuto em um agitador orbital a 140 rpm. Finalmente, remova o tampão de lavagem da câmara de microarray como antes. Para realizar a varredura de microarray, mergulhe a lâmina duas vezes em 200 mililitros de tampão de imersão recém-preparado.

Seque o microarray por cerca de um minuto, aspirando com muito cuidado da parte superior para a parte inferior da lâmina sem tocar na superfície da lâmina. Digitalize o microarray seguindo as instruções do scanner. Coloque o slide no scanner com a superfície impressa voltada para cima.

Crie um novo projeto e selecione a área de digitalização. Defina os parâmetros do scanner com uma resolução de 21 mícrons, uma intensidade de 7,0 para os canais de 700 e 800 nanômetros, uma qualidade de varredura de médio e um deslocamento de 0,8. Adquira e salve a imagem de desenho de digitalização como um formato de arquivo TIF em tons de cinza de 16 bits.

Para analisar os dados, abra a imagem bruta. Em seguida, abra o arquivo de grade de matriz. Alinhe a grade da matriz à imagem de digitalização com as teclas de seta do mouse ou do teclado do computador.

Selecione quantificar a seleção no software específico, que cria um arquivo de leitura que contém a intensidade do sinal para cada ponto, o valor de fundo e a sequência de peptídeos correspondente. Finalmente, armazene o microarray selado no escuro a quatro graus Celsius sob nitrogênio livre de oxigênio ou gás argônio. Aqui é mostrada a imagem de fluorescência bruta da coloração do microarray com IgG anti-humana após a incubação com uma amostra específica de soro do vírus Zika diluída a 1:250.

Os peptídeos de controle HA enquadram o microarray. Peptídeos que reagem fortemente à IgG são mostrados no painel de zoom. Da mesma forma, aqui é mostrada uma imagem de fluorescência bruta da coloração do microarray com IgM anti-humana após a incubação com uma amostra específica de soro do vírus Zika diluída a 1:250.

Novamente, os peptídeos de controle HA enquadram o microarray. Peptídeos que reagem fortemente à IgM são mostrados no painel de zoom. Aqui é mostrada uma sequência de consenso de epítopos representativa do vírus Zika reagindo com IgM nos peptídeos da amostra de soro do hospedeiro.

Os peptídeos da sequência de consenso do epítopo são destacados em vermelho e o peptídeo com a maior intensidade de fluorescência é marcado em negrito. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como processar um microarray de peptídeos de alta densidade. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 24 horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear cuidadosamente o microarray para evitar arranhar a superfície do microarray. Após esse procedimento, outros métodos, como ELISA ou um ensaio de ligação por ressonância plasmônica de superfície, podem ser realizados para determinar se os peptídeos identificados se ligam especificamente aos anticorpos do vírus Zika e não a outros anticorpos contra o Flavivírus. Após seu desenvolvimento, essa técnica abrirá caminho para pesquisadores da área de diagnóstico para a descoberta de peptídeos diagnósticos usando amostras de soro e saliva.

Não se esqueça de que trabalhar com agentes infecciosos como o vírus Zika pode ser extremamente perigoso, e precauções como inativar a amostra de soro por calor e trabalhar em instalações de Nível 2 de Biossegurança devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.