Name: Zika vírus específico diagnóstico Epitope Discovery (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Descubra como identificar peptídeos específicos do vírus Zika utilizando microarranjos de alta densidade para diagnóstico sorológico. Este método detecta anticorpos IgM e IgG, fornecendo uma linha do tempo da infecção.

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Suporte atual é fornecido por uma concessão de suplemento administrativo SBIR (pequenos negócios inovação pesquisa) do NIDCRR44 DE024456. Concessão de NIDCR HIV que evoluiu fora NIDCR conceder U01 DE017855 para o desenvolvimento de um confirmação diagnóstico point-of-care para HIV. Reconhecemos com gratidão Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) para a assistência técnica e apoio gentil. Agradecemos também a NYU Langone Medical Center para o LI-COR Odyssey Imaging System.

Esses dados fazem parte de um estudo de investigação em curso realizado na New York University College of Dentistry e foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Amostras clínicas utilizadas neste estudo foram identificadas de amostras anteriormente utilizadas para o diagnóstico e com a permissão de Wadsworth Center de Nova York Secretaria de estado da saúde, Albany, NY.
1. instalar o ZIKV de alta densidade de peptídeo Microarray deslize em uma bandeja de incubação específica
<ol><li>Lidar com a lâmina de vidro pelas bordas usando luvas sem pó. As dimensões do slide de vidro são 75,4 mm 25,0 mm e 1 mm de espessura. Coloque o slide na bandeja de incubação com a superfície de microarray virada para cima.</li>
	<li>Coloque o lado brilhante do selo virado para baixo sobre a superfície impressa do microarray. Para garantir uma boa posição, sobrepõem-se os furos de parafuso do selo e a placa de base.</li>
	<li>Coloque a parte superior da bandeja para o selo para criar uma câmara de microarray.</li>
	<li>Fixe o slide na bandeja apertando igualmente os parafusos um após o outro com a mão em um padrão alternado, começando do canto superior esquerdo, seguido pelo canto inferior direito. Coloque a tampa da bandeja de incubação.</li>
</ol>2. antecedentes interação deteção: Manchando o Microarray com anticorpos secundários
Nota: Utilize uma pipeta para depositar as soluções (padrão e bloqueio buffers, diluídos anticorpos secundários) no canto da câmara de microarray.
<ol><li>Incubar o microarray com um buffer padrão (1 x salina tamponada fosfato (PBS), 0,05% de Tween 20, pH 7,4, filtrada com um filtro de 0,45 µm) (total de volume de 2.000 µ l/microarray) durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT) em um agitador orbital a 140 rpm.</li>
	<li>Retire o tampão-padrão por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray. Preencha os titulares slide vazio com slides em branco para evitar a quebra da corrediça microarray.</li>
	<li>Bloquear o microarray com o tampão de bloqueio (volume total de 2.000 µ l/microarray) por 60 min em RT em um agitador orbital a 140 rpm.</li>
	<li>Retire o tampão de bloqueio por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.</li>
	<li>Incubar o microarray com anticorpo secundário, fluorocromo de IgM anti-humano conjugado, diluído 1: 5.000 (volume total de 2.000 µ l/microarray) de coloração, o tampão (10% de bloqueio de buffer de buffer padrão) por 30 min em RT no escuro em um agitador orbital 140 rpm.</li>
	<li>Remova o anticorpo secundário por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.</li>
	<li>Lave o microarray 3 x, 1 min por lavagem com tampão-padrão (volume total de 2.000 µ l/microarray em RT em um agitador orbital a 140 rpm. Depois de cada lavagem, remova o tampão-padrão por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.</li>
	<li>Mergulhe a lâmina 2 x em um buffer de imersão recentemente preparado (1 mM Tris, pH 7,4), (volume total de 200 mL).</li>
	<li>Seca o microarray cuidadosamente, por cerca de 1 min, aspirando o excesso de líquido com muito cuidado da parte superior à parte inferior do slide sem tocar a superfície do slide. Analise o slide em um scanner leitor de microarray.</li>
</ol>3. exposição do Microarray para hospedar o soro
Atenção: Execute esta etapa em condições de segurança do laboratório, nível de biossegurança 2 (BSL-2) devido à natureza infecciosa potencial das amostras de soro. Trabalhar dentro de uma classe II de segurança biológica (CSB).
<ol><li>Inativar a amostra de soro a 56 ° C por 30 min e centrifugar rcf 16.000 por 5 min a 4 ° C13. Nota: Utilize uma pipeta para depositar as soluções (coloração, tampão-padrão e soro diluído) no canto da câmara de microarray.</li>
	<li>Dilua a amostra de soro em coloração buffer, começando com uma diluição de (volume total de 2.000 μL/microarray) 1:1,000. Mantê-lo em 4 ° C até o uso.</li>
	<li>Incube o microarray com buffer de coloração (volume total de 2.000 μL/microarray) por 15 min em RT em um agitador orbital a 140 rpm.</li>
	<li>Remova o buffer de coloração por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.</li>
	<li>Incube o microarray com a amostra de soro diluído durante a noite a 4 ° C, em um agitador orbital a 140 rpm.</li>
	<li>Retire a amostra de soro diluído por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.</li>
	<li>Lave o microarray 3 x, 1 min por lavagem com tampão-padrão (volume total de 2.000 μL/microarray em RT em um agitador orbital a 140 rpm. Depois de cada lavagem, remova o tampão-padrão por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.</li>
</ol>4. coloração com anticorpos secundários e anticorpos controle rotulada
Nota: Utilize uma pipeta para depositar as soluções (buffers padrão, secundário diluído e anticorpos rótulo) no canto da câmara de microarray.
<ol><li>Dilua o anticorpo secundário no buffer de coloração. Nota: O fluorocromo de IgM anti-humano uso conjugado anticorpo ou anticorpo conjugado anti-humano IgG fluorocromo a uma diluição de 1:5,000 (volume total de 2.000 µ l/microarray) no buffer de coloração.</li>
	<li>Anticorpo de rótulo de controle de mistura (anticorpo monoclonal anti-HA conjugados a fluorocromo) a uma diluição de 1:1,000 (volume total de 2 000 µ l/microarray) na coloração de tampão com anticorpo secundário previamente diluído em tampão de coloração.</li>
	<li>Incube com o microarray por 30 min em RT no escuro em um agitador orbital a 140 rpm.</li>
	<li>Retire a mistura de secundário diluído e anticorpos rótulo por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.</li>
	<li>Lave 3x com tampão-padrão (volume total de 2.000 µ l/microarray). Cada lavagem é por 1 min em um agitador orbital a 140 rpm. Depois de cada lavagem, remova o tampão-padrão por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.</li>
</ol>5. Microarray digitalização
<ol><li>Mergulhe a lâmina 2 x em buffer mergulhando recentemente preparada (1 mM Tris, pH 7,4) (volume total de 200 mL).</li>
	<li>Seque o microarray cuidadosamente, em torno de 1 min, aspirando cuidadosamente do topo para o fundo do slide sem tocar a superfície do slide.</li>
	<li>Digitalize o microarray, seguindo as instruções do scanner. Coloque o slide para o scanner com a superfície impressa voltada para cima.</li>
	<li>Crie um novo projeto e selecione a área de digitalização. Definir os parâmetros do scanner como: resolução: 21 µm, intensidade para canais de 700 e 800 nm: 7.0, qualidade de digitalização: médio e deslocamento: 0.8.</li>
	<li>Adquirir e salve a imagem raw de varredura como um formato de arquivo TIFF em tons de cinza de 16 bits.</li>
</ol>6. Microarray Analysis usando um Software específico
<ol><li>Abra a imagem raw (imagem TIFF). Abra o arquivo de grade do matriz.</li>
	<li>Alinhe a grade de matriz para a varredura de imagem com as teclas de seta do mouse ou o teclado do computador.</li>
	<li>Selecione "Quantificar seleção" no software específico, que cria um arquivo de leitura que contém a intensidade do sinal para cada local, o valor de plano de fundo e a correspondente sequência de peptídeo. Nota: Este arquivo de saída também pode ser importado para um programa de planilha para análise adicional e gráficos.</li>
</ol>7. Microarray armazenamento
<ol><li>Armazene o microarray selado no escuro a 4 ° C, sob livre gás nitrogênio ou argônio oxigênio.</li>
</ol>

<ol><li>Kelser, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+dengue%27s+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Zika.+Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Meet dengue's cousin.</a> Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).</li>
<li>Musso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Zika+virus+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Detection of Zika virus in saliva.</a> J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).</li>
<li>Siqueira, W. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.oralhealthgroup.com/features/oral-clinical-manifestations-patients-infected-zika-virus/">Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus.</a> Oral Health. , (2016).</li>
<li>Duarte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Ginecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women.</a> Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).</li>
<li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+diagnostic+peptides+for+lyme+disease+through+epitope+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).</li>
<li>Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Peptide+library+screening+to+detect+a+previously+unknown+linear+diagnostic+epitope%3A+proof+of+principle+by+use+of+lyme+disease+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).</li>
<li>t Hoen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+screening+without+repetitious+selection+rounds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Phage display screening without repetitious selection rounds.</a> Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).</li>
<li>Townend, J. E., Tavassoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Production+of+Cyclic+Peptide+Libraries+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli.</a> ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).</li>
<li>Turchetto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+expression+of+animal+venom+toxins+in+Escherichia+coli+to+generate+a+large+library+of+oxidized+disulphide-reticulated+peptides+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).</li>
<li>Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Peptide+Discovery%3A+Prioritization+of+Pathogen+Diagnostic+Markers+Using+Multiple+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features.</a> Plos One. 7 (12), e50748(2012).</li>
<li>Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+immunodominant+motifs+with+atypical+isotype+profile+scattered+over+the+Onchocerca+volvulus+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).</li>
<li>Basile, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+ELISA+kit+%28YF+MAC-HD%29+to+detect+IgM+to+yellow+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus.</a> J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).</li>
<li>Madden, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK153387/">The BLAST Sequence Analysis Tool.</a> The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).</li>
<li>Services, U. S. D. oH. aH. <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).</li>
<li>Pellois, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individually+addressable+parallel+peptide+synthesis+on+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips.</a> Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).</li>
<li>Stafford, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22261726">Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect".</a> Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Gardner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+for+anti-CMV+biologics+identifies+a+broadly+neutralizing+epitope+of+an+essential+envelope+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Nixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28468980">Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1.</a> Clin Vaccine Immunol. , (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Nós projetamos um protocolo utilizando um microarray de peptídeo de alta densidade contendo a toda sequência de proteína vírus Zika (estirpe da Polinésia francesa). O microarray foi fabricado pela impressão 3.423 diferentes sobreposição peptídeos lineares. Cada peptídeo foi 15 aminoácidos e variados por apenas um resíduo de seu vizinho mais próximo na sequência (ou seja, sobreposição de resíduo 14). Embora sobreposições mais curtas podem ser impressos, mapeamento de epítopo é mais preciso com sobreposições mais ...

Zika diagnóstico de vírus (ZIKV) com base nos sintomas clínicos é um desafio porque compartilha vetores, distribuição geográfica e sintomas de infecção de vírus Dengue e Chikungunya1. Dado o risco de resultados adversos da gravidez em mulheres infectadas com ZIKV durante a gravidez, é importante distinguir entre os 3 vírus. Embora os testes de diagnóstico moleculares atuais são específicos, eles são úteis apenas no sangue ou saliva durante o período relativamente curto de infecção aguda2,3. Ensaios sorológicos são essenciais para o diagnóstico fora deste período inicial de infecção4.
O desenvolvimento de um ensaio sorológico específico de ZIKV é um desafio por duas razões: primeiro, os antígenos Zika que o sistema imunológico humano responde não são atualmente conhecidos; e sequências de aminoácidos conservados, segundo flavivírus induzem reactividade cruzada do anticorpo. Nosso objetivo era descobrir exclusivos peptídeos ZIKV específicos para ser usado no diagnóstico. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidos para bibliotecas de peptídeo de tela cobrindo toda proteínas incluindo fago, bacteriano, e superfície de levedura exibir5,6,7,8,9, 10. Nossa estratégia foi usar um microarray de peptídeo de alta densidade que permite rápida e barata elevado-throughput exames serológicos11,12 e posteriormente os peptídeos identificados podem ser usados para melhorar a corrente serológico ensaios para detecção da infecção por ZIKV.
Este protocolo permite a descoberta de Zika vírus específico diagnósticos peptídeos usando um microarray de peptídeo de alta densidade (Figura 1). O peptídeo high-density microarray foi produzido usando a tecnologia de impressão laser do peptide. A sequência de proteína inteira ZIKV constituído por resíduos de aminoácidos 3.423 baseia a estirpe da Polinésia francesa (GenBank: KJ776791.2), foi impresso em um slide de vidro padrão em blocos de 15 resíduos lineares com uma sobreposição de 14 resíduos de aminoácidos em duplicado para um total de 6.846 pontos de peptídeo. Além dos peptídeos de sequência de proteínas Zika todo, o microarray utiliza hemaglutinina gripe (HA) de peptídeos para controles internos.
Uma Zika validado positivos Obtida de Wadsworth Center (Albany, NY), de amostra de soro foi usada para identificar específicas imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG) reativos peptídeos. Após a incubação com a amostra durante a noite, o microarray foi manchada com um anticorpo conjugado fluorocromo secundário (anti-humano IgM ou IgG anti-humano) e analisado em um scanner de microarray. Quantificação de intensidades local e anotação de peptídeo foi realizada com um software específico fornecido pela mesma empresa que fabricava o microarray.

<table><tbody><tr><td>PEPperCHIP Custom Peptide Microarray</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.001.001</td><td>Personalizado peptídeo micarray: nosso microarray contém toda a sequência de proteína do vírus Zika</td></tr><tr><td>Bandeja de incubação PEPperCHIP 3/1</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.004.001</td><td></td></tr><tr><td>PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, rotulagem DyLight)</td> <td>PEPperPRINT</td><td>PPC.037.002</td><td></td></tr><tr><td>PepSLide Analyzer</td><td>PEPperPRINT</td><td>PSA.004.001</td><td>Licença gratuita de 14 dias para Windows</td></tr><tr><td>Rockland Buffer de bloqueio</td><td>Rockland</td><td>MB-070</td><td></td></tr><tr><td>IgM anti-humano (cadeia mu) DyLight 800</td><td>Rockland</td><td>609-145-007</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-humano Fc DyLight 680</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10138</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo agitador orbital</td><td>IKA</td><td>MTS 2/4 microtiter shaker</td><td></td>digital</tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltagraph</td><td>Redrocks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zika vírus específico diagnóstico epitope discovery

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density do peptide microarrays permitir rastreio de peptídeos de mais de seis mil em um slide de microscopia simples padrão. Esse método pode ser aplicado para a descoberta de medicamentos, identificação do alvo terapêutico e desenvolvimento de diagnósticos. Aqui, apresentamos um protocolo para descobrir específico Zika vírus (ZIKV) diagnósticos peptides usando um microarray de peptídeo de alta densidade. Uma amostra de soro humano validada para infecção ZIKV foi incubada com um microarray de peptídeo de alta densidade contendo a proteína inteira de ZIKV traduzida em 3.423 exclusivo 15 resíduos linear de aminoácidos (aa) com uma sobreposição de resíduo 14-aa impresso em duplicado. Coloração com anticorpos secundários diferentes dentro do mesmo conjunto, detectamos peptídeos que ligam a imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG) anticorpos presentes no soro. Estes peptídeos foram selecionados para mais experiências de validação. Neste protocolo, descrevemos a estratégia adoptada para projetar, processar e analisar um microarray de peptídeo de alta densidade.

Os resultados obtidos utilizando o protocolo descrito são mostrados na Figura 2 e Figura 3. Não há interações de fundo foram observadas quando pre-manchando o microarray com anti-humano secundário IgM (dados não mostrados). Coloração com um anti-humano IgM conjugado resultou em diversas áreas acima as intensidades de fluorescência verde de fundo, indicando a ligação destes peptídeos com IgM na amostra de soro de...

Neste protocolo, descrevemos uma técnica para descobrir Zika vírus específico diagnósticos peptides usando um microarray de peptídeo de alta densidade. Este protocolo especialidade pode ser adaptado para outras doenças infecciosas emergentes.

Zika vírus específico diagnóstico Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

O objetivo geral deste experimento é identificar peptídeos específicos do vírus Zika para uso em um ensaio diagnóstico para detectar anticorpos contra o vírus Zika. Isso é crítico, pois o vírus desaparece do sangue em aproximadamente 10 dias, enquanto os anticorpos persistem por anos. Este método nos permite identificar antígenos e epítopos utilizando um microarray de todo o proteoma do Zika para identificar peptídeos que capturam anticorpos IgM ou IgG em uma amostra de soro de um indivíduo infectado.A principal vantagem na detecção de anticorpos iniciais, IgM, e anticorpos posteriores, IgG, é fornecer ao médico uma linha do tempo da infecção. E isso é particularmente importante em mulheres grávidas. Embora esse protocolo forneça informações sobre a causa da infecção pelo zika vírus, ele pode ser aplicado a outros patógenos, usando um microarray específico para esse patógeno se sua sequência de proteínas for conhecida.Manuseie a lâmina de vidro pelas bordas usando luvas sem pó. As dimensões da lâmina de vidro são 75,4 milímetros por 25,0 milímetros e 1 milímetro de espessura. Coloque a lâmina na bandeja de incubação com a superfície do microarray voltada para cima.Preencha os suportes de lâminas vazios com lâminas em branco para evitar que a lâmina de microarray se quebre. Coloque o lado brilhante do selo voltado para baixo na superfície impressa do microarray. Para garantir uma boa posição, sobreponha os orifícios dos parafusos da vedação e da placa de base.Coloque a parte superior da bandeja na vedação para criar uma câmara de microarray. Prenda a corrediça na bandeja apertando igualmente os parafusos de aperto manual, um após o outro, com a mão em um padrão alternado. Comece no canto superior esquerdo e prossiga para o canto inferior direito.Coloque a tampa na bandeja de incubação. O manuseio cuidadoso do microarray é essencial para evitar arranhões na superfície do microarray. As soluções são adicionadas e depois removidas do canto da câmara de microarray.A secagem do microarray também é importante para fornecer uma boa imagem de digitalização. Incube o microarray com 2.000 microlitros de tampão padrão por microarray por 15 minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital a 140 rpm. Remova o tampão padrão aspirando com uma pipeta do canto da câmara do microarray e, em seguida, bloqueie o microarray com um tampão de bloqueio por 60 minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital a 140 rpm.Remova o tampão de bloqueio aspirando do canto da câmara de microarray com uma pipeta. Adicione anticorpo secundário conjugado com fluorocromo IgM anti-humano diluído 1:5, 000 no tampão de coloração ao microarray. Em seguida, incube o microarray por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro em um agitador orbital a 140 rpm.Use uma pipeta para remover o anticorpo secundário aspirando do canto da câmara de microarray. Lave o microarray por um minuto com 2000 microlitros com tampão padrão por microarray à temperatura ambiente em um agitador orbital a 140 rpm. Remova o tampão padrão usando a técnica demonstrada e repita a lavagem duas vezes.Em seguida, mergulhe a lâmina duas vezes em 200 mililitros de um tampão de imersão recém-preparado. Seque o microarray cuidadosamente por aproximadamente um minuto, aspirando o excesso de fluido com muito cuidado de cima para baixo da lâmina sem tocar na superfície da lâmina. Analise a lâmina em um leitor de scanner de microarray, conforme demonstrado posteriormente neste vídeo.Inative a amostra de soro a 56 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, centrifugar a amostra a 16 000 RCF durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Manter a amostra a quatro graus Celsius até à utilização.Em seguida, incube o microarray com o tampão de coloração por 15 minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital a 140 rpm. Remova o tampão de coloração aspirando do canto da câmara de microarray com uma pipeta. Diluir a amostra de soro e o tampão de coloração começando com uma diluição de 1:1.000.Incubar a amostra diluída com o microarray durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador orbital a 140 rpm. Remover a amostra de soro diluído utilizando a técnica demonstrada. Em seguida, lave o microarray três vezes como antes.Diluir o anticorpo secundário no tampão de coloração. Use anticorpo conjugado com fluorocromo IgM humano ou anticorpo conjugado com fluorocromo IgG humano em uma diluição de 1:5.000 em tampão de coloração. Em seguida, misture o anticorpo marcado com controle em uma diluição de 1:1000 em tampão de coloração com o anticorpo secundário diluído.Incubar com o microarray por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro e em um agitador orbital a 140 rpm. Remova a mistura de anticorpos secundários diluídos e marcados aspirando do canto da câmara de microarray com uma pipeta. Em seguida, lave o microarray três vezes com tampão padrão.Cada lavagem é de um minuto em um agitador orbital a 140 rpm. Finalmente, remova o tampão de lavagem da câmara de microarray como antes. Para realizar a varredura de microarray, mergulhe a lâmina duas vezes em 200 mililitros de tampão de imersão recém-preparado.Seque o microarray por cerca de um minuto, aspirando com muito cuidado da parte superior para a parte inferior da lâmina sem tocar na superfície da lâmina. Digitalize o microarray seguindo as instruções do scanner. Coloque o slide no scanner com a superfície impressa voltada para cima.Crie um novo projeto e selecione a área de digitalização. Defina os parâmetros do scanner com uma resolução de 21 mícrons, uma intensidade de 7,0 para os canais de 700 e 800 nanômetros, uma qualidade de varredura de médio e um deslocamento de 0,8. Adquira e salve a imagem de desenho de digitalização como um formato de arquivo TIF em tons de cinza de 16 bits.Para analisar os dados, abra a imagem bruta. Em seguida, abra o arquivo de grade de matriz. Alinhe a grade da matriz à imagem de digitalização com as teclas de seta do mouse ou do teclado do computador.Selecione quantificar a seleção no software específico, que cria um arquivo de leitura que contém a intensidade do sinal para cada ponto, o valor de fundo e a sequência de peptídeos correspondente. Finalmente, armazene o microarray selado no escuro a quatro graus Celsius sob nitrogênio livre de oxigênio ou gás argônio. Aqui é mostrada a imagem de fluorescência bruta da coloração do microarray com IgG anti-humana após a incubação com uma amostra específica de soro do vírus Zika diluída a 1:250.Os peptídeos de controle HA enquadram o microarray. Peptídeos que reagem fortemente à IgG são mostrados no painel de zoom. Da mesma forma, aqui é mostrada uma imagem de fluorescência bruta da coloração do microarray com IgM anti-humana após a incubação com uma amostra específica de soro do vírus Zika diluída a 1:250.Novamente, os peptídeos de controle HA enquadram o microarray. Peptídeos que reagem fortemente à IgM são mostrados no painel de zoom. Aqui é mostrada uma sequência de consenso de epítopos representativa do vírus Zika reagindo com IgM nos peptídeos da amostra de soro do hospedeiro.Os peptídeos da sequência de consenso do epítopo são destacados em vermelho e o peptídeo com a maior intensidade de fluorescência é marcado em negrito. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como processar um microarray de peptídeos de alta densidade. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 24 horas se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear cuidadosamente o microarray para evitar arranhar a superfície do microarray. Após esse procedimento, outros métodos, como ELISA ou um ensaio de ligação por ressonância plasmônica de superfície, podem ser realizados para determinar se os peptídeos identificados se ligam especificamente aos anticorpos do vírus Zika e não a outros anticorpos contra o Flavivírus. Após seu desenvolvimento, essa técnica abrirá caminho para pesquisadores da área de diagnóstico para a descoberta de peptídeos diagnósticos usando amostras de soro e saliva.Não se esqueça de que trabalhar com agentes infecciosos como o vírus Zika pode ser extremamente perigoso, e precauções como inativar a amostra de soro por calor e trabalhar em instalações de Nível 2 de Biossegurança devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O vírus Zika (ZIKV), um patógeno emergente, está ligado a anormalidades no desenvolvimento fetal e microcefalia. O estabelecimento de um sistema eficaz de cultura de células infecciosas é crucial para estudos de replicação do ZIKV, bem como para o desenvolvimento de vacinas e medicamentos. Neste estudo, vários ensaios virológicos relativos ao ZIKV são ilustrados e discutidos.

Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em&gt; In Vitro</em&gt; Efeito profilático de interferões

Aqui, os autores apresentam um protocolo simples e eficiente para definir um epítopo antigênico linear usando um anticorpo monoclonal purificado e varredura peptídica por meio de hibridização dot-blot. O epítopo identificado pode então ser usado em aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Este protocolo descreve a recuperação do vírus Zika infeccioso a partir de um clone de cDNA infeccioso com dois plasmídeos.

Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Corrente multiplexado diagnósticos para detectar Zika, chikungunya, vírus da dengue exigem a preparação de amostras complexas e instrumentação cara e são difíceis de usar em ambientes de recursos baixos. Mostramos um diagnóstico que utiliza amplificação isotérmica com sondas displaceable vertente destino específico para detectar e diferenciar estes vírus com alta sensibilidade e especificidade.

Multiplexado amplificação isotérmica com base em plataforma de diagnóstica para detectar Dengue 1, Chikungunya e Zika

Um protocolo para avaliar as respostas de células T antígeno-específicas nos órgãos immunoprivileged do Ifnar1- / - modelo murino para a infecção de vírus (ZIKV) Zika é descrito. Este método é essencial para investigar os mecanismos celulares da proteção e imunopatogênese das vacinas ZIKV e também é valioso para sua avaliação de eficácia.

Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

Nós descrevemos um método para avaliar o efeito da imunidade pré-existente contra vírus da dengue sobre a infecção pelo vírus Zika usando soro humano, células humanas primárias e quantificação de infecção por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa.

Quantificação de realce dependente de anticorpo do vírus nas células humanas primárias Zika

O objetivo do protocolo é demonstrar as técnicas utilizadas para investigar a doença viral, isolando e quantificando o vírus Zika, de múltiplos órgãos em um camundongo após a infecção.

Isolamento e quantificação do vírus Zika de múltiplos órgãos em um mouse

O protocolo apresentado pode determinar a competência vetorial das populações do mosquito Aedes aegypti para um determinado vírus, como o Zika, em um ambiente de contenção.

Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus

Neste trabalho, descrevemos os protocolos usados em ensaios baseados em enzimas cílicas e virais para triagem de inibidores da replicação do vírus Zika em um formato de triagem de alto rendimento.

Ensaios antivirais de alta produtividade para tela para inibidores da replicação do vírus Zika

Os imunoensaios de fluorescência multiplex estão se tornando uma referência para testes sorológicos. Sua aplicação, no entanto, é limitada pela complexidade e pelos demorados processos de acoplamento de analitos de esferas. Este relatório apresenta um protocolo de acoplamento de esferas de microesferas multiplex semiautomatizado e reprodutível que é comparável ao método padrão, reduzindo consideravelmente o tempo de resultados.

Um ensaio sorológico multiplex para a detecção de respostas de anticorpos a arbovírus

Descubra como identificar peptídeos específicos do vírus Zika utilizando microarranjos de alta densidade para diagnóstico sorológico. Este método detecta anticorpos IgM e IgG, fornecendo uma linha do tempo da infecção.

Zika vírus específico diagnóstico Epitope Discovery

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