Name: Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprenda a produzir células Natural Killer murinas de alta pureza usando um sistema alimentador-livre inovador. Este método facilita estudos de imunologia inata e imunoterapia contra câncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi suportado pelo Research Grants Conselho de Hong Kong (GRF-468513, CUHK3/CRF/12R) e inovação e tecnologia Fund de Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), subvenção directa para pesquisa-CUHK (2016.035) e estudioso de Hong Kong Programa.
H.-Y.L. projetado e supervisionou todas as experiências e contribuiu para a preparação do manuscrito. P.M.-K.T. realizou experimentos, analisaram dados e contribuiu para a preparação do manuscrito. PC-T. T., JY-F.C., J.S.-C., H., p.-M.W., e G.-Y.L. coletou amostras de animais e participou de experiências em animais. J.S., X.-R.H., e K.-F.T. contribuiu para a preparação do manuscrito.

O protocolo para obtenção e diferenciando NK derivadas da medula óssea, células (BM-NK) é baseado em métodos anteriormente publicados20,21,22. Todos os procedimentos com ratos foram aprovados pelo Animal ética Experimental Comité (AEEC) da universidade chinesa de Hong Kong.
1. preparação do OP9 médio condicional
<ol><li>Cultura a linhagem de células de estroma murino OP9 em alfa-MEM, contendo 20% FBS, 100 U/mL penicilina G e estreptomicina 100 µ g/mL, a 37 ° C numa atmosfera de ar/CO2 umidificada (95%: 5%).<ol>
<li>Conte as células com um hemocytometer, então semente 2 x 106 células OP9 para cada frasco de cultura2 75cm com 15 mL de meio. Cultura por 48 h.</li>
		<li>Quando a cultura atinge 80% confluência, lave o frasco com 10 mL de PBS e adicionar 20 mL de meio de alfa-MEM liso (sem FBS e antibióticos) por balão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coletar o OP9 meio de condição do frasco de cultura em 24h, limpar os escombros de célula com filtro de polietersulfona (PES) 0,25 µm e preservar a 4 ° C (uso dentro de 2 semanas).</li>
</ol>2. isolamento de células de medula óssea de rato
<ol><li>Eutanásia em um rato de C57BL/6J de 12 semanas de idade com uma overdose de pentobarbitone (100 mg/kg, injeção intraperitoneal). Confirmar a morte pela falta de respiração, em seguida, colher os ossos fêmur com um corte de faca cirúrgica para as junções entre os ossos e remover os restantes músculos com a lâmina riscando suave.</li>
	<li>Coloque os ossos em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo refrigerado estéril alfa-MEM e em seguida, execute as seguintes etapas em uma armário de biossegurança.</li>
	<li>Descartar o meio de alfa-MEM e enxágue os ossos com etanol a 70% por 30 s.</li>
	<li>Lave os ossos com PBS estéril gelada duas vezes para limpar o restante do etanol.</li>
	<li>Transfira os ossos de uma argamassa contendo 5 mL de PBS gelado e suavemente fragmentam os ossos com um pilão (não pulverizá-los).</li>
	<li>Agite suavemente os ossos e agitando o pilão para liberar as células da medula óssea para a PBS. Recolha as células de medula óssea contendo PBS para um novo tubo de centrifugação de 50 mL.</li>
	<li>Repita a etapa 2.6 para quatro vezes, até que os fragmentos de osso se tornar sólido branco na cor.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 465 x g por 5 min a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda o pellet com 18 mL de água destilada estéril e deixá-lo ficar por 30 s para remover células vermelhas do sangue.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de gelado 10 X PBS para parar a reação, em seguida filtrar a mistura através de um filtro de célula de 70 µm para remover os lisados glóbulos vermelhos.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 465 x g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet com 20 mL de PBS gelado.</li>
	<li>Lave as células, repetindo o passo 2.11 uma segunda vez.</li>
	<li>Transferir o centrifugado para uma 100mm Petri estéril com 10 mL de OP9 médio condicional da etapa 1.2 suplementado com 20% FBS e uma mistura de 0,5 ng/mL murino IL-7, 30 ng/mL mouse SCF e flt3L murino de 100 U/mL.</li>
	<li>Incubar o prato a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 h. transferência das células não anexadas em um novo recipiente de cultura em uma densidade de 5 x 105 viável células/mL (contagem por hemocytometer com azul trypan exclusão de células) com a mesma fórmula média como na etapa 2.13 e incubar a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>No dia 4, alterar a condição de cultura para OP9 condicional meio suplementado com 20% FBS e 2.000 U/mL de murino Il-2.</li>
	<li>Atualizar o meio de cultura a cada 3 dias; células NK maduras podem ser obtidas por 7 dias e qualificadas como na seção 4.</li>
</ol>3. mediada por siRNA Gene Silencing de diferenciar as células NK
<ol><li>Premix o controle siRNA ou absurdo (NC) com um agente de Transfeccao de acordo com o manual do produto.</li>
	<li>Execute o passo 3.1 em qualquer ponto do tempo desde o dia 0.</li>
	<li>Adicionar a 50 nM de siRNA ou mistura de NC para as células da etapa 2.14.</li>
	<li>Repita o passo 3.1 em cada refresco médio (por exemplo, dia 0, 4 e 7) até o ponto de extremidade experimental.</li>
</ol>4. análise da diferenciação de células NK usando citometria de fluxo
<ol><li>Em um ponto de tempo apropriado, recolher a suspensão de diferenciar as células e lave com PBS gelado.</li>
	<li>Fixe as células com buffer de fixação da célula de acordo com o manual do produto.</li>
	<li>Lavar as células fixas com PBS gelado e depois Ressuspender 1 x 106 células em 100 µ l de fluxo Cytometry coloração Buffer contendo Cy3 anti-ratinho conjugada com NKp46 e anticorpos CD244 anti-rato PE-conjugados em uma diluição de 1: 100.</li>
	<li>Manche a amostra no escuro à temperatura ambiente por 2 h.</li>
	<li>Resuspenda as amostras coradas com 300 µ l de PBS, em seguida, adquirir dados de FACS e analisar com Cytobank plataforma20 (http://cytobank.org/).</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li>
<li>Rusakiewicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+infiltrates+are+prognostic+factors+in+localized+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).</li>
<li>Mamessier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+enhance+self+tolerance+by+promoting+evasion+from+NK+cell+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).</li>
<li>Stern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-emptive+immunotherapy+with+purified+natural+killer+cells+after+haploidentical+SCT%3A+a+prospective+phase+II+study+in+two+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers.</a> Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+adoptive+transfer+and+in+vivo+expansion+of+human+haploidentical+NK+cells+in+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer.</a> Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).</li>
<li>Rubnitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKAML%3A+a+pilot+study+to+determine+the+safety+and+feasibility+of+haploidentical+natural+killer+cell+transplantation+in+childhood+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia.</a> J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).</li>
<li>Curti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfer+of+alloreactive+haploidentical+KIR+ligand-mismatched+natural+killer+cells+after+infusion+in+elderly+high+risk+acute+myeloid+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients.</a> Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li>
<li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li>
<li>Rouce, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSMAD+pathway+is+an+important+mechanism+for+NK+cell+immune+evasion+in+childhood+B-acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).</li>
<li>Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+tumor+suppression+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression.</a> Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18662538">TGFbeta in cancer.</a> Cell. 134 (2), 215-230 (2008).</li>
<li>Ikushima, H., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signalling%3A+a+complex+web+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).</li>
<li>Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+TGF%CE%B2+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The roles of TGFβ in the tumour microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).</li>
<li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells%3A+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li>
<li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li>
<li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-%CE%B3+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li>
<li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1436033">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li>
<li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytobank%3A+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li>
<li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+NK1.1%2B%2C+Ly49%2B+NK+cells+from+flt3%2B+multipotent+marrow+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li>
<li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677(2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

No presente trabalho, descrevemos um método novo para produzir derivados de medula óssea murino NK células in vitro. O alimentador de célula no sistema original21,22 é substituído com sucesso pelo meio condicional de células OP9, que em grande parte, aumentou a estabilidade do sistema de diferenciação. Além disso, o sistema pode produzir quantidade elevada, e a pureza da NK maduro células para em vitro , bem como na vivo ensaios, o que ...

Progressão de câncer é largamente dependente do tumor microambiente1,2, incluindo o anfitrião-derivado de immunocytes, por exemplo, as células NK. Vários estudos demonstraram que as células NK intratumoral são negativamente correlacionadas com a progressão de tumor3,4. Além disso, estudos clínicos mostraram que a terapia com células NK adotiva é uma estratégia possível para câncer5,6,7,8,9. Imunoterapia baseada em célula NK recentemente foi sugerida como uma opção terapêutica para tumores sólidos, mas os desafios Existem devido a secreção de citocinas imunossupressoras e downregulation de ativação de ligantes no microambiente de tumores sólidos 10,11. Transformar o fator de crescimento-β (TGF-β) tem sido sugerido um papel na carcinogênese supressiva, mas paradoxalmente as células cancerosas também produzem TGF-β1 para apoiar o tumor desenvolvimento12,13,14 , 15. sinalização do TGF-β pode suprimir a atividade citolítica de células NK via receptividade de interferon para baixo-regulação e mediada por CD16 interferon-gama (IFN-γ) produção em vitro16,17, 18.
Apesar de interrupção de TGF-β sinalização no microambiente do tumor pode ser um caminho possível para eliminar cânceres, bloquear completamente a sinalização do TGF-β causará doenças autoimunes, devido à sua função de anti-inflamatórios, como evidenciado pela evolução da efeitos colaterais adversos incluindo inflamação sistêmica, defeitos cardiovasculares e auto-imunidade mouse modelos19. Assim, entender o mecanismo de trabalho de TGF-β-mediada imunossupressão conduzirá à identificação de um alvo terapêutico acessível para tratamento de câncer.
Para elucidar os eventos moleculares necessários para o desenvolvimento de células NK, Williams et al estabeleceu um sistema in vitro para diferenciar as células-tronco hematopoiéticas murino de medula óssea em NK células20. Este sistema facilita em grande parte o estudo mecanicista do desenvolvimento de célula NK, incluindo a identificação dos progenitores romance de NK células21. No entanto, os progenitores da medula óssea devem ser cultivados no sistema com células estromais OP9 de apoio como um alimentador camada20,21, e esta população celular heterogênea em grande parte limita a aplicação adicional de desregulação gene ferramentas (p. ex., silenciamento de genes mediada por siRNA) especificamente aplicada às células NK diferenciadoras.
Aqui, descrevemos um sistema alimentador-livre que se desenvolveu ainda mais, modificando o sistema in vitro de Williams et al.20. Em nosso sistema, as células de alimentador estromais OP9 não são necessárias, e em vez disso OP9 médio condicional é usado sem afetar a diferenciação da NK células in vitroe isto recentemente nos levam a descobrir que o TGF-β é capaz de promover a progressão do câncer através de suprimir o desenvolvimento de células NK E4bp4-dependente no tumor microambiente22. Este novo sistema com sucesso fornece um método livre de plano de fundo para elucidar o mecanismo molecular do desenvolvimento de células NK em condições específicas (por exemplo, elevada TGF-β1, silenciamento de genes mediada por siRNA, etc.) em vitro.

<table><tbody><tr><td>Linha celular OP9</td><td></td><td>ATCC ATCC&reg; CRL-2749&trade; </td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, sem nucleosídeos</td><td>Gibco</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Murino Recombinante IL-7</td><td>PEPROTECH</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Murino Recombinante SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>Murino Recombinante Flt3-Ligante</td><td>PEPROTECH</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Murino IL-2</td><td>PEPROTECH</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX Transfecção Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>1377815</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Fixação de IC&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-8222-49</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Coloração por Citometria de Fluxo&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Anti-camundongo conjugado com PE CD244</td><td>eBioscience</td><td>12-2441-83</td><td></td></tr><tr><td>Anti-camundongo conjugado com Cy3 NKp46</td><td>Bioss</td><td>bs-2417R-cy3</td><td></td></tr><tr><td>Controle sem sentido (NC)</td> <td>Ribobio</td><td>siN05815122147</td><td></td></tr><tr><td>siRNA contra camundongo E4BP4 mRNA</td><td>Ribobio N</td><td>/ A</td><td>5&prime;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3 & principal;</td></tr></tbody></table>

um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino natural killer cells in vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) células pertencem ao sistema imunitário inato e são uma primeira linha de defesa imunológica contra o cancro; no entanto, eles são suprimidos no microambiente do tumor e o mecanismo subjacente ainda é desconhecido. A falta de uma fonte confiável e consistente de células NK limita o progresso da investigação da imunidade de célula NK. Aqui, nós relatamos um sistema em vitro que pode fornecer alta qualidade e quantidade de medula óssea-derivado murino células NK sob uma condição livre de alimentador. Mais importante, demonstramos também que com êxito silenciamento de genes mediada por siRNA inibe a maturação de células NK E4bp4 dependentes usando este sistema. Assim, esta célula NK romance em vitro diferenciar o sistema é uma solução de biomaterial para pesquisa de imunidade.

Obtêm-se resultados representativos do protocolo descrito a seguir. Células de suspensão total da medula óssea foram cultivadas sob o sistema de diferenciação de alimentador-livre durante 11 dias; observou-se aumento significativo da taxa de proliferação de dia 7, em comparação com o número de células totais no dia 0 (Figura 1A). Células NK maduras com alta relação nuclear para o citoplasma e morfologia de citoplasma rico em grânulos foram en...

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir em massa-silenciamento murino células NK usando um sistema de diferenciação de alimentador-livre para estudo mecanicista em vitro e em vivo.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

O objetivo geral deste novo sistema sem alimentador é fornecer um método para produzir em massa células assassinas naturais de alta pureza para ensaios in vitro e in vivo. Este método pode ajudar a responder às principais questões da imunologia inata, incluindo o desenvolvimento de células assassinas naturais e a imunidade ao câncer. A principal vantagem dessa técnica é que esse novo sistema sem alimentador pode aumentar amplamente a pureza das células assassinas naturais produzidas.Isso facilita significativamente os seguintes ensaios in vitro e in vivo. A indicação desta técnica se estende à imunidade natural killer porque a produção em massa de células natural killer murinas pode ser produzida a partir da medula óssea de pacientes com câncer para análise e modificação para imunoterapia pessoal. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o meio consumido deve ser coletado da célula OP9 em fase de crescimento.A demonstração facial desse método é crítica, pois as etapas de instrução da medula óssea são difíceis de aprender, porque os ossos precisam ser estéreis com etanol com tempo ideal para preservar a viabilidade. Para iniciar este procedimento, colete a

a-novel-feeder-free-system-for-mass-production-murine-natural-killer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui nós descrevemos um método eficiente para expandir e purificar um grande número de células NK e avaliar a sua função.

Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

Este vídeo demonstra uma técnica para a expansão de células natural killer (NK) diretamente de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) usando uma linhagem de células alimentadoras. As PBMCs são co-cultivadas com células alimentadoras linfoblastóides geneticamente modificadas que expressam interleucina-21 ligada à membrana (mIL-21), e a cultura é suplementada com as citocinas interleucina-2 (IL-2) e interleucina-15 (IL-15). Juntos, esse coquetel de ligantes leva à expansão prolongada...

Expansão ex vivo de células assassinas naturais de células mononucleares do sangue periférico

Este protocolo descreve o desenvolvimento, a expansão, e in vivo de imagens de células NK derivadas de hESCs e iPSCs.

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

Neste estudo, apresentamos um sistema de cultura in vitro que pode gerar pDCs de forma eficiente por co-cultura de progenitores linfóides comuns com células alimentadoras de AC-6 na presença do ligante Flt3.

In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

Aqui apresentamos um protocolo adaptado que pode ser usado para gerar um grande número de células T natural killer invariantes murinas do baço de camundongo. O protocolo descreve uma abordagem pela qual as células iNKT esplênicas podem ser enriquecidas, isoladas e expandidas in vitro usando um número limitado de animais e reagentes.

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

Descrevemos um protocolo rápido e robusto para enriquecer células T (iNKT) invariantes do assassino natural do baço do rato e expandi-las in vitro para números adequados para estudos in vitro e in vivo.

Purificação e Expansão de Células T Assassinos Naturais Invariantes para Estudos In vitro e In vivo

Aqui, apresentamos um método para expandir o natural killer do sangue periférico (PBNK), células NK de tecidos hepáticos e células do receptor de antígeno quimérico (CAR)-NK derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou sangue do cordão umbilical (CB). Este protocolo demonstra a expansão das células NK e CAR-NK usando células alimentadoras de 221-mIL-21, além da pureza otimizada das células NK expandidas.

Natural Killer (NK) e Método de Expansão Celular CAR-NK usando a Linha Celular B Modificada por IL-21 Ligada à Membrana

O presente protocolo mostra como diferenciar células CD3−/CD45+CD56+ com citotoxicidade leve de células-tronco potenciais expandidas humanas (hEPSCs) em condições de cultura 3D e 2D. Isso permite a validação fenotípica de rotina sem a destruição do microambiente complexo.

Geração de células assassinas naturais a partir de células-tronco de potencial expandido humano

As vesículas extracelulares derivadas de células assassinas naturais (NK-EVs) têm potencial promissor como bioterapêuticos do câncer. Este estudo baseado em metodologia apresenta um fluxo de trabalho de biofabricação escalável em circuito fechado projetado para produzir e isolar continuamente grandes quantidades de NK-EVs de alta pureza. Os testes de controle em processo são realizados em todo o fluxo de trabalho de biofabricação, garantindo que os EVs atendam aos padrões de qualidade para...

Fluxo de trabalho de biofabricação escalável para produzir e isolar bioterapêuticos de câncer baseados em vesículas extracelulares derivadas de células assassinas naturais

Este protocolo descreve um método escalável para a expansão de produtos de Terapias Celulares Adotivas (ACT), nomeadamente células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)-T e células Killer Induzidas por Citocinas (CIK), utilizando dispositivos de expansão rápida permeável a gases (G-Rex), demonstrando crescimento eficiente e robusto em um ambiente clinicamente relevante.

Geração Eficiente e Rápida de Células Assassinas Induzidas por CAR-T e Citocinas em Dispositivos Escaláveis por GMP

Aprenda a produzir células Natural Killer murinas de alta pureza usando um sistema alimentador-livre inovador. Este método facilita estudos de imunologia inata e imunoterapia contra câncer.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Explorar mais vídeos