Name: Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprenda a produzir células Natural Killer murinas de alta pureza usando um sistema alimentador-livre inovador. Este método facilita estudos de imunologia inata e imunoterapia contra câncer.

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Este estudo foi suportado pelo Research Grants Conselho de Hong Kong (GRF-468513, CUHK3/CRF/12R) e inovação e tecnologia Fund de Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), subvenção directa para pesquisa-CUHK (2016.035) e estudioso de Hong Kong Programa.
H.-Y.L. projetado e supervisionou todas as experiências e contribuiu para a preparação do manuscrito. P.M.-K.T. realizou experimentos, analisaram dados e contribuiu para a preparação do manuscrito. PC-T. T., JY-F.C., J.S.-C., H., p.-M.W., e G.-Y.L. coletou amostras de animais e participou de experiências em animais. J.S., X.-R.H., e K.-F.T. contribuiu para a preparação do manuscrito.

O protocolo para obtenção e diferenciando NK derivadas da medula óssea, células (BM-NK) é baseado em métodos anteriormente publicados20,21,22. Todos os procedimentos com ratos foram aprovados pelo Animal ética Experimental Comité (AEEC) da universidade chinesa de Hong Kong.
1. preparação do OP9 médio condicional
<ol><li>Cultura a linhagem de células de estroma murino OP9 em alfa-MEM, contendo 20% FBS, 100 U/mL penicilina G e estreptomicina 100 µ g/mL, a 37 ° C numa atmosfera de ar/CO2 umidificada (95%: 5%).<ol>
<li>Conte as células com um hemocytometer, então semente 2 x 106 células OP9 para cada frasco de cultura2 75cm com 15 mL de meio. Cultura por 48 h.</li>
		<li>Quando a cultura atinge 80% confluência, lave o frasco com 10 mL de PBS e adicionar 20 mL de meio de alfa-MEM liso (sem FBS e antibióticos) por balão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coletar o OP9 meio de condição do frasco de cultura em 24h, limpar os escombros de célula com filtro de polietersulfona (PES) 0,25 µm e preservar a 4 ° C (uso dentro de 2 semanas).</li>
</ol>2. isolamento de células de medula óssea de rato
<ol><li>Eutanásia em um rato de C57BL/6J de 12 semanas de idade com uma overdose de pentobarbitone (100 mg/kg, injeção intraperitoneal). Confirmar a morte pela falta de respiração, em seguida, colher os ossos fêmur com um corte de faca cirúrgica para as junções entre os ossos e remover os restantes músculos com a lâmina riscando suave.</li>
	<li>Coloque os ossos em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo refrigerado estéril alfa-MEM e em seguida, execute as seguintes etapas em uma armário de biossegurança.</li>
	<li>Descartar o meio de alfa-MEM e enxágue os ossos com etanol a 70% por 30 s.</li>
	<li>Lave os ossos com PBS estéril gelada duas vezes para limpar o restante do etanol.</li>
	<li>Transfira os ossos de uma argamassa contendo 5 mL de PBS gelado e suavemente fragmentam os ossos com um pilão (não pulverizá-los).</li>
	<li>Agite suavemente os ossos e agitando o pilão para liberar as células da medula óssea para a PBS. Recolha as células de medula óssea contendo PBS para um novo tubo de centrifugação de 50 mL.</li>
	<li>Repita a etapa 2.6 para quatro vezes, até que os fragmentos de osso se tornar sólido branco na cor.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 465 x g por 5 min a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda o pellet com 18 mL de água destilada estéril e deixá-lo ficar por 30 s para remover células vermelhas do sangue.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de gelado 10 X PBS para parar a reação, em seguida filtrar a mistura através de um filtro de célula de 70 µm para remover os lisados glóbulos vermelhos.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 465 x g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet com 20 mL de PBS gelado.</li>
	<li>Lave as células, repetindo o passo 2.11 uma segunda vez.</li>
	<li>Transferir o centrifugado para uma 100mm Petri estéril com 10 mL de OP9 médio condicional da etapa 1.2 suplementado com 20% FBS e uma mistura de 0,5 ng/mL murino IL-7, 30 ng/mL mouse SCF e flt3L murino de 100 U/mL.</li>
	<li>Incubar o prato a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 h. transferência das células não anexadas em um novo recipiente de cultura em uma densidade de 5 x 105 viável células/mL (contagem por hemocytometer com azul trypan exclusão de células) com a mesma fórmula média como na etapa 2.13 e incubar a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>No dia 4, alterar a condição de cultura para OP9 condicional meio suplementado com 20% FBS e 2.000 U/mL de murino Il-2.</li>
	<li>Atualizar o meio de cultura a cada 3 dias; células NK maduras podem ser obtidas por 7 dias e qualificadas como na seção 4.</li>
</ol>3. mediada por siRNA Gene Silencing de diferenciar as células NK
<ol><li>Premix o controle siRNA ou absurdo (NC) com um agente de Transfeccao de acordo com o manual do produto.</li>
	<li>Execute o passo 3.1 em qualquer ponto do tempo desde o dia 0.</li>
	<li>Adicionar a 50 nM de siRNA ou mistura de NC para as células da etapa 2.14.</li>
	<li>Repita o passo 3.1 em cada refresco médio (por exemplo, dia 0, 4 e 7) até o ponto de extremidade experimental.</li>
</ol>4. análise da diferenciação de células NK usando citometria de fluxo
<ol><li>Em um ponto de tempo apropriado, recolher a suspensão de diferenciar as células e lave com PBS gelado.</li>
	<li>Fixe as células com buffer de fixação da célula de acordo com o manual do produto.</li>
	<li>Lavar as células fixas com PBS gelado e depois Ressuspender 1 x 106 células em 100 µ l de fluxo Cytometry coloração Buffer contendo Cy3 anti-ratinho conjugada com NKp46 e anticorpos CD244 anti-rato PE-conjugados em uma diluição de 1: 100.</li>
	<li>Manche a amostra no escuro à temperatura ambiente por 2 h.</li>
	<li>Resuspenda as amostras coradas com 300 µ l de PBS, em seguida, adquirir dados de FACS e analisar com Cytobank plataforma20 (http://cytobank.org/).</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li>
<li>Rusakiewicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+infiltrates+are+prognostic+factors+in+localized+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).</li>
<li>Mamessier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+enhance+self+tolerance+by+promoting+evasion+from+NK+cell+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).</li>
<li>Stern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-emptive+immunotherapy+with+purified+natural+killer+cells+after+haploidentical+SCT%3A+a+prospective+phase+II+study+in+two+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers.</a> Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+adoptive+transfer+and+in+vivo+expansion+of+human+haploidentical+NK+cells+in+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer.</a> Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).</li>
<li>Rubnitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKAML%3A+a+pilot+study+to+determine+the+safety+and+feasibility+of+haploidentical+natural+killer+cell+transplantation+in+childhood+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia.</a> J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).</li>
<li>Curti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfer+of+alloreactive+haploidentical+KIR+ligand-mismatched+natural+killer+cells+after+infusion+in+elderly+high+risk+acute+myeloid+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients.</a> Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li>
<li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li>
<li>Rouce, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSMAD+pathway+is+an+important+mechanism+for+NK+cell+immune+evasion+in+childhood+B-acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).</li>
<li>Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+tumor+suppression+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression.</a> Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18662538">TGFbeta in cancer.</a> Cell. 134 (2), 215-230 (2008).</li>
<li>Ikushima, H., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signalling%3A+a+complex+web+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).</li>
<li>Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+TGF%CE%B2+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The roles of TGFβ in the tumour microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).</li>
<li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells%3A+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li>
<li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li>
<li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-%CE%B3+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li>
<li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1436033">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li>
<li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytobank%3A+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li>
<li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+NK1.1%2B%2C+Ly49%2B+NK+cells+from+flt3%2B+multipotent+marrow+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li>
<li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677(2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

No presente trabalho, descrevemos um método novo para produzir derivados de medula óssea murino NK células in vitro. O alimentador de célula no sistema original21,22 é substituído com sucesso pelo meio condicional de células OP9, que em grande parte, aumentou a estabilidade do sistema de diferenciação. Além disso, o sistema pode produzir quantidade elevada, e a pureza da NK maduro células para em vitro , bem como na vivo ensaios, o que ...

Progressão de câncer é largamente dependente do tumor microambiente1,2, incluindo o anfitrião-derivado de immunocytes, por exemplo, as células NK. Vários estudos demonstraram que as células NK intratumoral são negativamente correlacionadas com a progressão de tumor3,4. Além disso, estudos clínicos mostraram que a terapia com células NK adotiva é uma estratégia possível para câncer5,6,7,8,9. Imunoterapia baseada em célula NK recentemente foi sugerida como uma opção terapêutica para tumores sólidos, mas os desafios Existem devido a secreção de citocinas imunossupressoras e downregulation de ativação de ligantes no microambiente de tumores sólidos 10,11. Transformar o fator de crescimento-β (TGF-β) tem sido sugerido um papel na carcinogênese supressiva, mas paradoxalmente as células cancerosas também produzem TGF-β1 para apoiar o tumor desenvolvimento12,13,14 , 15. sinalização do TGF-β pode suprimir a atividade citolítica de células NK via receptividade de interferon para baixo-regulação e mediada por CD16 interferon-gama (IFN-γ) produção em vitro16,17, 18.
Apesar de interrupção de TGF-β sinalização no microambiente do tumor pode ser um caminho possível para eliminar cânceres, bloquear completamente a sinalização do TGF-β causará doenças autoimunes, devido à sua função de anti-inflamatórios, como evidenciado pela evolução da efeitos colaterais adversos incluindo inflamação sistêmica, defeitos cardiovasculares e auto-imunidade mouse modelos19. Assim, entender o mecanismo de trabalho de TGF-β-mediada imunossupressão conduzirá à identificação de um alvo terapêutico acessível para tratamento de câncer.
Para elucidar os eventos moleculares necessários para o desenvolvimento de células NK, Williams et al estabeleceu um sistema in vitro para diferenciar as células-tronco hematopoiéticas murino de medula óssea em NK células20. Este sistema facilita em grande parte o estudo mecanicista do desenvolvimento de célula NK, incluindo a identificação dos progenitores romance de NK células21. No entanto, os progenitores da medula óssea devem ser cultivados no sistema com células estromais OP9 de apoio como um alimentador camada20,21, e esta população celular heterogênea em grande parte limita a aplicação adicional de desregulação gene ferramentas (p. ex., silenciamento de genes mediada por siRNA) especificamente aplicada às células NK diferenciadoras.
Aqui, descrevemos um sistema alimentador-livre que se desenvolveu ainda mais, modificando o sistema in vitro de Williams et al.20. Em nosso sistema, as células de alimentador estromais OP9 não são necessárias, e em vez disso OP9 médio condicional é usado sem afetar a diferenciação da NK células in vitroe isto recentemente nos levam a descobrir que o TGF-β é capaz de promover a progressão do câncer através de suprimir o desenvolvimento de células NK E4bp4-dependente no tumor microambiente22. Este novo sistema com sucesso fornece um método livre de plano de fundo para elucidar o mecanismo molecular do desenvolvimento de células NK em condições específicas (por exemplo, elevada TGF-β1, silenciamento de genes mediada por siRNA, etc.) em vitro.

<table><tbody><tr><td>Linha celular OP9</td><td></td><td>ATCC ATCC&reg; CRL-2749&trade; </td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, sem nucleosídeos</td><td>Gibco</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Murino Recombinante IL-7</td><td>PEPROTECH</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Murino Recombinante SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>Murino Recombinante Flt3-Ligante</td><td>PEPROTECH</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Murino IL-2</td><td>PEPROTECH</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX Transfecção Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>1377815</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Fixação de IC&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-8222-49</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Coloração por Citometria de Fluxo&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Anti-camundongo conjugado com PE CD244</td><td>eBioscience</td><td>12-2441-83</td><td></td></tr><tr><td>Anti-camundongo conjugado com Cy3 NKp46</td><td>Bioss</td><td>bs-2417R-cy3</td><td></td></tr><tr><td>Controle sem sentido (NC)</td> <td>Ribobio</td><td>siN05815122147</td><td></td></tr><tr><td>siRNA contra camundongo E4BP4 mRNA</td><td>Ribobio N</td><td>/ A</td><td>5&prime;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3 & principal;</td></tr></tbody></table>

um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino natural killer cells in vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) células pertencem ao sistema imunitário inato e são uma primeira linha de defesa imunológica contra o cancro; no entanto, eles são suprimidos no microambiente do tumor e o mecanismo subjacente ainda é desconhecido. A falta de uma fonte confiável e consistente de células NK limita o progresso da investigação da imunidade de célula NK. Aqui, nós relatamos um sistema em vitro que pode fornecer alta qualidade e quantidade de medula óssea-derivado murino células NK sob uma condição livre de alimentador. Mais importante, demonstramos também que com êxito silenciamento de genes mediada por siRNA inibe a maturação de células NK E4bp4 dependentes usando este sistema. Assim, esta célula NK romance em vitro diferenciar o sistema é uma solução de biomaterial para pesquisa de imunidade.

Obtêm-se resultados representativos do protocolo descrito a seguir. Células de suspensão total da medula óssea foram cultivadas sob o sistema de diferenciação de alimentador-livre durante 11 dias; observou-se aumento significativo da taxa de proliferação de dia 7, em comparação com o número de células totais no dia 0 (Figura 1A). Células NK maduras com alta relação nuclear para o citoplasma e morfologia de citoplasma rico em grânulos foram en...

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir em massa-silenciamento murino células NK usando um sistema de diferenciação de alimentador-livre para estudo mecanicista em vitro e em vivo.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

O objetivo geral deste novo sistema sem alimentador é fornecer um método para produzir em massa células assassinas naturais de alta pureza para ensaios in vitro e in vivo. Este método pode ajudar a responder às principais questões da imunologia inata, incluindo o desenvolvimento de células assassinas naturais e a imunidade ao câncer. A principal vantagem dessa técnica é que esse novo sistema sem alimentador pode aumentar amplamente a pureza das células assassinas naturais produzidas.Isso facilita significativamente os seguintes ensaios in vitro e in vivo. A indicação desta técnica se estende à imunidade natural killer porque a produção em massa de células natural killer murinas pode ser produzida a partir da medula óssea de pacientes com câncer para análise e modificação para imunoterapia pessoal. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o meio consumido deve ser coletado da célula OP9 em fase de crescimento.A demonstração facial desse método é crítica, pois as etapas de instrução da medula óssea são difíceis de aprender, porque os ossos precisam ser estéreis com etanol com tempo ideal para preservar a viabilidade. Para iniciar este procedimento, colete as células OP9 de um frasco de cultura. Adicione FBS para interromper a digestão da tripsina.Colete as células OP9 e centrifugue a 465 vezes a gravidade por cinco minutos. Depois disso, suspenda novamente o pellet celular. Usando um hemocitômetro, conte as células.Em seguida, semeie duas vezes 10 a seis células em 15 mililitros de meio alfa-mem em um frasco de cultura de 75 centímetros quadrados e incube por 48 horas. Quando as células estiverem 80% confluentes, lave-as com 10 milímetros de solução salina tamponada com fosfato e adicione 20 mililitros de meio alfa-mem simples sem antibióticos e soro bovino fetal às células. Incubar por 24 horas.No dia seguinte, colete o meio condicionado OP9 removendo os detritos celulares com um filtro e preserve a quatro graus Celsius. Injete uma overdose de 100 miligramas por quilograma de pentobarbital intraperitoneal para sacrificar um camundongo de 12 semanas de idade. Depois de confirmar a falta de respiração, excise os ossos do fêmur com uma faca cirúrgica.Remova os músculos restantes coçando suavemente com uma lâmina. Transfira os ossos em um tubo de centrífuga de 50 mililitros cheio de meio alfa-mem estéril resfriado e mantenha em um gabinete de biossegurança. Em seguida, expulse o meio alfa-mem e lave os ossos com etanol a 70% por 30 segundos.Novamente, lave os ossos com solução salina tamponada com fosfato estéril gelado duas vezes para remover qualquer etanol restante. Após a lavagem, transfira os ossos para um almofariz contendo cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato gelado e fragmente os ossos com um pilão. Gire o pilão suavemente para liberar as células da medula óssea na solução salina tamponada com fosfato.Transfira a solução salina tamponada com fosfato contendo células da medula óssea em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue o tubo a 465 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante.Extraia até que o osso fique branco para obter o rendimento máximo. Em seguida, ressuspenda o pellet com 18 mililitros de água destilada estéril e aguarde 30 segundos para remover os glóbulos vermelhos. Em seguida, adicione dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato gelado 10X para interromper a reação.Use um filtro de células de 70 micrômetros para remover os glóbulos vermelhos lisados. Em seguida, centrifugue os tubos a 465 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 20 mililitros de solução salina tamponada com fosfato gelado.Centrifugue as células mais uma vez. Em seguida, transfira o pellet celular em uma placa de Petri estéril de 100 mililitros contendo 10 mililitros de meio condicional OP9, suplementado com reagentes adicionais. Transfira a placa de Petri em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por duas horas.Remova todas as células e sementes soltas em uma nova placa de cultura contendo meio condicional OP9 e coloque em uma incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos. No quarto dia, substituir o meio de cultura por meio condicional OP9, suplementado com 20% de soro fetal bovino e 2.000 unidades por mililitro de interleucina murina 2. Continue trocando o meio de cultura a cada três dias até o sétimo dia para obter as células assassinas naturais maduras.Siga o manual do produto para pré-misturar o pequeno RNA interferente ou controle sem sentido com o reagente de transfecção no zero, quarto e sétimo dia de troca do meio até o ponto final experimental. Adicione 50 nanomolares de pequeno RNA interferente, ou mistura sem sentido, às células soltas durante o refresco médio. Colete as células de diferenciação em um ponto de tempo apropriado.Centrifugue as células a 465 vezes a gravidade por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e lave o pellet celular com solução salina tamponada com fosfato gelado. Depois de lavar as células fixas com solução salina tamponada com fosfato gelado, ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão de coloração por citometria de fluxo contendo anticorpos conjugados com SY3.Depois disso, ressuspenda as amostras em 300 microlitros de solução salina tamponada com fosfato para análise por fax. Uma curva de crescimento representativa demonstrando a taxa de proliferação das células da medula óssea em diferenciação em células natural killer em sistema livre de alimentador. O gráfico mostra um aumento significativo na taxa de proliferação das células no sétimo dia.Uma imagem representativa de campo brilhante mostrando células assassinas naturais diferenciadas em um novo sistema livre de alimentador. As células natural killer maduras exibiram alta proporção nuclear para citoplasmática com uma morfologia citoplasmática granular. Um gráfico de barras representativo mostrando o efeito de pequenos RNAs interferentes nas células da medula óssea submetidas à diferenciação em células assassinas naturais no sexto dia.O gráfico mostra uma redução significativa nos níveis de mRNA de E4bp4 e pequenas células natural killer tratadas com RNA interferente em comparação com o grupo controle. Dados de citometria de fluxo representativos demonstrando o efeito de E4bp4 silenciado na diferenciação de células natural killer derivadas da medula óssea de maneira dependente de TGF beta-1 Smad3. Os dados mostram que o knockdown do mRNA de E4bp4 diminui muito na produção de células assassinas naturais maduras no sexto dia em comparação com o controle sem sentido.Pequena produção diminuída mediada por RNA interferente de células assassinas naturais é resgatada pela supressão de TGF beta-1 Smad3 com um inibidor micromolar de SIS3 Smad3 em comparação com o pequeno grupo transfectado de RNA interferente. Uma vez dominado, este estudo pode ser feito em duas horas se for realizado corretamente. Seguir este procedimento permite que modificações genéticas, como bloqueio de genes e superexpressão, possam ser conduzidas para responder a perguntas adicionais, como os mecanismos de regulação da atividade das células assassinas naturais, bem como o desenvolvimento.A primeira eu tive a ideia para esse método quando estava expandindo as células assassinas naturais no sistema antigo. A presença das células fetais diminuiu a carga e a eficiência do siRNA para o gene de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir células assassinas naturais massivas de alta qualidade a partir deste sistema local in vitro.Não se esqueça de que trabalhar com reagentes de extração de RNA pode ser extremamente perigoso e sempre devem ser tomadas precauções ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui nós descrevemos um método eficiente para expandir e purificar um grande número de células NK e avaliar a sua função.

Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

Este vídeo demonstra uma técnica para a expansão de células natural killer (NK) diretamente de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) usando uma linhagem de células alimentadoras. As PBMCs são co-cultivadas com células alimentadoras linfoblastóides geneticamente modificadas que expressam interleucina-21 ligada à membrana (mIL-21), e a cultura é suplementada com as citocinas interleucina-2 (IL-2) e interleucina-15 (IL-15). Juntos, esse coquetel de ligantes leva à expansão prolongada...

Expansão ex vivo de células assassinas naturais de células mononucleares do sangue periférico

Este protocolo descreve o desenvolvimento, a expansão, e in vivo de imagens de células NK derivadas de hESCs e iPSCs.

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

Neste estudo, apresentamos um sistema de cultura in vitro que pode gerar pDCs de forma eficiente por co-cultura de progenitores linfóides comuns com células alimentadoras de AC-6 na presença do ligante Flt3.

In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

Aqui apresentamos um protocolo adaptado que pode ser usado para gerar um grande número de células T natural killer invariantes murinas do baço de camundongo. O protocolo descreve uma abordagem pela qual as células iNKT esplênicas podem ser enriquecidas, isoladas e expandidas in vitro usando um número limitado de animais e reagentes.

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

Descrevemos um protocolo rápido e robusto para enriquecer células T (iNKT) invariantes do assassino natural do baço do rato e expandi-las in vitro para números adequados para estudos in vitro e in vivo.

Purificação e Expansão de Células T Assassinos Naturais Invariantes para Estudos In vitro e In vivo

Aqui, apresentamos um método para expandir o natural killer do sangue periférico (PBNK), células NK de tecidos hepáticos e células do receptor de antígeno quimérico (CAR)-NK derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou sangue do cordão umbilical (CB). Este protocolo demonstra a expansão das células NK e CAR-NK usando células alimentadoras de 221-mIL-21, além da pureza otimizada das células NK expandidas.

Natural Killer (NK) e Método de Expansão Celular CAR-NK usando a Linha Celular B Modificada por IL-21 Ligada à Membrana

O presente protocolo mostra como diferenciar células CD3−/CD45+CD56+ com citotoxicidade leve de células-tronco potenciais expandidas humanas (hEPSCs) em condições de cultura 3D e 2D. Isso permite a validação fenotípica de rotina sem a destruição do microambiente complexo.

Geração de células assassinas naturais a partir de células-tronco de potencial expandido humano

As vesículas extracelulares derivadas de células assassinas naturais (NK-EVs) têm potencial promissor como bioterapêuticos do câncer. Este estudo baseado em metodologia apresenta um fluxo de trabalho de biofabricação escalável em circuito fechado projetado para produzir e isolar continuamente grandes quantidades de NK-EVs de alta pureza. Os testes de controle em processo são realizados em todo o fluxo de trabalho de biofabricação, garantindo que os EVs atendam aos padrões de qualidade para...

Fluxo de trabalho de biofabricação escalável para produzir e isolar bioterapêuticos de câncer baseados em vesículas extracelulares derivadas de células assassinas naturais

Este protocolo descreve um método escalável para a expansão de produtos de Terapias Celulares Adotivas (ACT), nomeadamente células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)-T e células Killer Induzidas por Citocinas (CIK), utilizando dispositivos de expansão rápida permeável a gases (G-Rex), demonstrando crescimento eficiente e robusto em um ambiente clinicamente relevante.

Geração Eficiente e Rápida de Células Assassinas Induzidas por CAR-T e Citocinas em Dispositivos Escaláveis por GMP

Aprenda a produzir células Natural Killer murinas de alta pureza usando um sistema alimentador-livre inovador. Este método facilita estudos de imunologia inata e imunoterapia contra câncer.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

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