O rombencéfalo Mouse como um modelo para o estudo embrionário neurogênese

O objetivo geral deste procedimento é permitir a análise histológica e de órgãos inteiros do rombencéfalo embrionário de camundongo durante o desenvolvimento. Este método permite o estudo dos desenvolvimentos na neurogênese no rombencéfalo de um organismo modelo de mamífero. O rombencéfalo de camundongo em desenvolvimento é um excelente modelo para estudar a atividade da progênese neural devido à sua arquitetura plana que facilita a observação de padrões de neurogênese em todo o órgão.

Comece este procedimento com a eutanásia de uma rata grávida cronometrada usando um procedimento eticamente aprovado no estágio gestacional necessário. Usando uma tesoura afiada, abra a cavidade peritoneal e excise cuidadosamente o útero. Coloque o útero excisado contendo os embriões em um prato de plástico de 60 milímetros contendo 20 mililitros de PBS gelado.

Realize todas as dissecações adicionais usando um microscópio de dissecação. Usando a pinça relojoeira número cinco, rasgue a parede do músculo uterino para expor os embriões. Solte cada embrião cortando o cordão umbilical e remova o saco vitelino.

Depois de transferir cada embrião para um prato de plástico limpo com PBS gelado, use a pinça relojoeira número 55 para cortar a cabeça. Opcionalmente, retenha um pequeno pedaço de tecido para isolamento do DNA genômico e subsequente genotipagem. Usando a pinça relojoeira número 55, excise o tecido que contém o rombencéfalo paralelo e imediatamente abaixo do neuro epitélio do rombencéfalo para separá-lo do tecido facial e do prosencéfalo.

Posicione o rombencéfalo e o tecido caudal da cabeça, com o lado dorsal para cima, e identifique o quarto ventrículo que é coberto por uma fina camada de tecido conhecida como placa do teto. Perfure cuidadosamente a placa do teto usando a pinça Relojoeiro número 55 e retire o excesso de tecido com uma pinça, movendo-se rostralmente ao longo da linha média sobre o mesencéfalo e depois caudalmente sobre o rombencéfalo posterior e a medula espinhal. O cérebro posterior deve agora ser exposto em uma preparação de livro aberto.

Para preparar os rombencéfalos para a marcação imunológica de montagem total, use a pinça relojoeira número 55 para retirar cuidadosamente a cabeça restante do mesênquima e quaisquer meninges presas ao lado da casca do rombencéfalo. Remova o tecido do mesencéfalo e da medula espinhal para deixar apenas o tecido do rombencéfalo. Para preparar os rombencéfalos para o cisco de vibratomo e criosecção, use a pinça relojoeira número 55 para remover o mesencéfalo e o tecido da medula espinhal.

Transfira os rombencéfalos do prato de plástico para tubos de dois mililitros de fundo redondo usando uma pipeta Pasteur. Depois de aspirar todo o PBS, fixe o rombencéfalo por duas horas a quatro graus Celsius com agitação suave em formaldeído recém-descongelado a 4% por volume dissolvido em PBS. Finalmente, enxágue o rombencéfalo três vezes com PBS.

Se necessário, reidratar os rombencéfalos em delírios decrescentes em série de metanol em PBS à temperatura ambiente por cinco minutos em cada concentração. Em seguida, transfira para o rombencéfalo para PBS. Permeabilize o rombencéfalo por 30 minutos a quatro graus Celsius em PBS contendo PBT com agitação suave.

Em seguida, incube o rombencéfalo por uma hora a quatro graus Celsius em PBT contendo 10% de soro de cabra inativado pelo calor. Em seguida, incube os rombencéfalos durante a noite, como antes, em PBT contendo 1% de soro inativado pelo calor e anticorpos primários. No dia seguinte, lave os rombencéfalos a quatro graus Celsius com PBT por uma hora cada.

Após a lavagem, incubar o rombencéfalo durante a noite a quatro graus Celsius em PBT contendo os anticorpos secundários conjugados com fluoróforo apropriados direcionados contra os anticorpos primários usados. Mantenha os rombencéfalos no escuro a partir deste ponto para proteger os fluoróforos do fotobranqueamento. Depois de lavar como antes com PBT, pós-fixar os rombencéfalos em 4% de formaldeído em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente para preservação a longo prazo da ligação de anticorpos.

Enquanto isso, cubra uma lâmina de microscópio de vidro com duas camadas de fita isolante preta e retire um pequeno quadrado da fita em camadas para criar uma bolsa grande o suficiente para segurar o rombencéfalo. Depois de enxaguar brevemente o rombencéfalo duas vezes em PBS, transfira-o para a bolsa com uma pipeta Pasteur. Remova o excesso de líquido e adicione um reagente anti-desbotamento apropriado na bolsa.

Em seguida, cubra lentamente o rombencéfalo com uma lamínula de vidro para evitar prender bolhas de ar sob a lamínula. Sele a lamínula e fixe-a na lâmina com uma fina camada de esmalte. Armazene o slide a quatro graus Celsius no escuro até a aquisição da imagem.

Incorpore os rombencéfalos em agarose derretida a 3% de peso por volume preparado em água destilada. O corte transfere seções do rombencéfalo para uma espessura de 70 mícrons usando um vibratome. Transfira cada seção recém-cortada com um pincel para um poço de um prato de 24 poços contendo PBS gelado.

Depois de rotular as seções flutuantes conforme detalhado no protocolo de texto, lave-as brevemente em PBS. Transfira cuidadosamente as seções flutuantes para uma lâmina de microscópio de vidro usando um pincel. Limpe o excesso de PBS ao redor da seção usando papel mata-borrão ou lenço de papel.

Não as seções que usam 80% de glicerol em PBS. E cubra-os lentamente com uma lamínula de vidro para evitar prender bolhas de ar. Armazene o slide a quatro graus Celsius no escuro até a aquisição da imagem.

Incube os rombencéfalos em 30% de peso por volume de sacarose em PBS a quatro graus Celsius para proteger os rombencéfalos antes do congelamento. Mergulhe os rombencéfalos em composto óptico de temperatura de corte ou OCT. Em seguida, congele-os rapidamente transferindo os moldes contendo as chuvas traseiras para isopentano resfriado entre 40 e 50 graus Celsius em gelo seco.

Em seguida, corte as seções do rombencéfalo de transferência para uma espessura de 10 mícrons usando um criostato. Transfira as seções do rombencéfalo para lâminas de microscópio eletrostaticamente adesivas. Incube as lâminas em temperatura ambiente por 15 minutos para secar as seções nas lâminas.

Em seguida, lave as seções criogênicas com PBS para dissolver a OCT. Marque uma barreira hidrofóbica ao redor das seções criogênicas usando uma caneta PAP. Visualize as amostras usando um microscópio de varredura a laser epifluorescente ou confocal equipado com lentes adequadas para lâminas montadas em meios aquosos, bem como filtros ópticos adequados para os fluoróforos usados para imunomarcação.

Para obter imagens de rombencéfalo inteiro ou de uma seção do rombencéfalo, use uma lente para ampliação de 10 vezes. Para visualizar as áreas do rombencéfalo para quantificação, use uma ampliação de 40 vezes. E para visualizar células individuais, use uma lente com uma ampliação de 63 vezes.

Aqui são mostrados resultados representativos de rombencéfalos imunomarcados para observar a divisão de células progenitoras neurais na zona ventricular. Essas imagens foram obtidas usando o marcador mitótico fosfohistona H3 em estágios consecutivos de desenvolvimento. As seções transversais de vibratomo foram marcadas após um pulso de uma hora de EdU para destacar as células progenitoras neurais do rombencéfalo submetidas à migração nuclear intercinética, bem como as células mitoticas positivas para fosfo-histona H3 na superfície ventricular.

A proporção geral de células progenitoras neurais auto-renovadoras pode ser determinada calculando a porcentagem de células duplamente positivas Ki67 BrdU em amarelo entre todas as células BrdU positivas em vermelho e amarelo em seções criogênicas transversais do rombencéfalo de embriões um dia após a administração de BrdU. As seções de vibratomo do rombencéfalo também podem ser imunomarcadas com um anticorpo para a proteína de filamento intermediário Nestin, também conhecida como RC-2, para visualizar as extremidades e saliências das células progenitoras neurais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar uma preparação de montagem plana ou seções de tecido transversal do rombencéfalo.

Uma vez dominado, até 10 rombencéfalos podem ser dissecados em menos de uma hora. Ao tentar este procedimento, é importante usar PBS gelado se primeiro se familiarizar com a microdissecção do rombencéfalo, pois isso facilita a separação das meninges, além de garantir a preservação do tecido. Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo, podem ser realizados em suspensões de células únicas do rombencéfalo para separar os progenitores neurais de outros tipos de células.

O estabelecimento dessa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurobiologia do desenvolvimento explorarem os mecanismos da neurogênese de mamíferos usando o rombencéfalo como uma alternativa aos modelos convencionalmente usados na medula espinhal e no prosencéfalo. Este método pode fornecer informações sobre a neurogênese do rombencéfalo de mamíferos, mas também pode ser aplicado a outros vertebrados em desenvolvimento, dado o grau de semelhança estrutural e molecular entre as espécies. Essa técnica pode ajudar na descoberta de novos mecanismos que controlam a neurogênese e ajudar a determinar se aqueles identificados em outras partes do eixo são recapitulados nessa parte do cérebro dos vertebrados.