Protocolo Experimental para Detecção de Função Mitocondrial em Hepatócitos Expostos a Pesticidas Organoclorine

É um messer que chama responder a uma pergunta-chave que você tem também em uma função de campo, como o nível ATP e as taxas de consumo de oxigênio. A nova ou a única página antiga, essa técnica é que é fácil de executar e é muito para uma avaliação especial da função mitocondrial celular. Para começar este experimento, sementes 20.000 células HepG2 em uma placa de Petri de fundo de vidro.

Adicione beta-hexacloclohexano ou B-HCH na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24 horas. Prepare uma solução de sonda de fluorescência verde mitocondrial milimão adicionando DMSO a umidrómico de cultura celular DMEM. Em seguida, adicione um mililitro por prato desta solução para as células em pratos de petri de fundo de vidro.

E incubar a 37 graus Celsius por 45 minutos. Após a incubação, remova a solução de sonda fluorescente verde mitocondrial das células. Adicione um mililitro por prato de recém-preparado a 37 graus Celsius DMEM meio de cultura celular.

Para detectar fluorescência verde nas mitocôndrias, observe as células sob um microscópio confocal. Para avaliar os níveis de ATP celular, sementes para 20.000 células HepG2 em seis placas de poço. Adicione beta-HCH e incubar a 37 graus Celsius por 24 horas.

Adicione 200 microliters de tampão de lise às células em cada poço. Centrifugar a 12.000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius, e proceder com a coleta de supernasces como descrito no protocolo de texto. Adicione 100 microliters tampão de detecção ATP à placa.

Adicione 100 microlitadores de supernascer de células coletadas a uma placa de 96 poços à temperatura ambiente e procedemos a detectar ATP celular por um luminômetro como descrito no protocolo de texto. Para avaliação do potencial da membrana mitocondrial, cresça células HepG2 em seis placas de poço com a adição de beta-HCH, como descrito anteriormente. Colete as células digerindo-as com 0,5 mililitros 0,25% EDTA por um minuto a 37 graus Celsius.

Adicione um IMEM mililitro para parar a digestão e transfira as células digeridas para tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar os tubos a 1000 vezes G por três minutos, e depois descartar o supernasal. Diluir a pelota celular com 0,5 mililitros de cultura celular média e 0,5 mililitros JC1 diluente de membrana mitocondrial.

E incubar por 20 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, centrifugar os tubos a 600 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius, e depois lavar a pelota celular de acordo com o protocolo de texto. Depois de centrifugar a pelota lavada, remova o sobrenatante.

E suspenda a pelota em 0,5 mililitros de tampão de tingimento JC1. Analise as células manchadas do JC1 através da citometria de fluxo para detectar fluorescência verde e vermelha. Quando o monômero JC1 for detectado, coloque a luz de excitação em 490 nanômetros e a luz de emissão para 530 nanômetros.

Quando o polímero JC1 for detectado, coloque a luz de excitação em 525 nanômetros e a luz de emissão para 590 nanômetros. Para analisar a taxa de consumo de oxigênio, as células hepG2 sementes em uma placa de cultura celular de 96 poços em uma densidade de 4.500 células por 100 microliters por poço. Após 24 horas de incubação a 37 graus Celsius, certifique-se de que as células de cada poço estejam cobertas com meio.

Antes de executar o software OCR, carregue a microplacão com cartucho e a placa de cultura celular em um analisador de fluxo extracelular, conforme descrito no protocolo de texto. Abra o software OCR e no menu suspenso dos aplicativos, escolha o kit de teste de estresse mito celular e clique no botão do aplicativo iniciar. Em seguida, clique no botão de teste de estresse de execução.

Quando a tela de teste de estresse celular aparecer, digite o número de células semeando por poço na caixa de número de semeadura celular e o OCR médio na caixa OCR de célula basal. Digite a concentração final de trabalho para cada reagente e, em seguida, injete os reagentes. Clique no próximo botão.

Quando a tela de informações do grupo aparecer, atribua um grupo a poços não atribuídos, escolhendo uma cor e dando um nome. Em seguida, clique nos poços apropriados. Clique no botão seguinte e na tela de layout de injeção de teste de estresse que aparece, clique em iniciar o teste de estresse no analisador.

Após a execução concluída, siga as instruções no software e, em seguida, remova e descarte o cartucho e a placa de célula. A intensidade média da coloração fluorescente verde mitocondrial diminuiu nas células HepG2 expostas ao beta-HCH. Isso mostra que há uma diminuição no número mitocondrial e aumento das mitocôndrias danificadas consistentes com o aumento da concentração de pesticidas.

Além disso, os níveis de ATP nas células HepG2 diminuíram com o aumento das concentrações de exposição beta-HCH, mostrando a diminuição da função das mitocôndrias nessas células. Após a coloração jc1 para potencial de membrana mitocondrial, ou MMP, o cítômetro de fluxo mostrou alta fluorescência JC1 verde vermelha em células HepG2 intactas. Isso se deveu à presença de agregados JC1 fluorescentes vermelhos, que são um sinal de alta MMP.

Em células tratadas com beta-HCH, a fluorescência JC1 verde vermelha diminuiu devido à presença de monômeros JC1 fluorescentes verdes, um sinal de baixa MMP. Finalmente, a taxa de consumo de oxigênio também diminuiu com o aumento das concentrações de exposição beta-HCH, mostrando ainda que este pesticida prejudica a função mitocondrial adequada. Oh, bem, tente este procedimento, é importante, porém, lembrar de ver que as células são apropriadas para testá-lo.

Após seu desenvolvimento, isso definitivamente abre caminho para pesquisas no campo da função fundamental explorarem organismos relevantes no papel médico associado a ele. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar uma quantidade ou qualidade, capacidade, agora membro ou potencial sob função de folha de bico.