Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada

O objetivo geral deste ensaio de interferometria de biocamada ou BLI é medir a interação potencial entre a proteína purificada do canal iônico hEAG1 e os lipídios de pequenas moléculas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da farmacologia do canal iônico, como se a pequena molécula de interesse pode interagir diretamente com esse canal iônico e qual é a cinética da interação? A principal vantagem dessa técnica é que ela é um método livre de mão de obra e de alto rendimento.

Apenas uma pequena quantidade de proteína imobilizada é necessária. Geralmente, os indivíduos que são novos nesse método terão dificuldades porque um ensaio bem-sucedido envolve várias etapas, incluindo expressão de proteínas, purificação, rotulagem, sensor ajustado com precisão e análise de dados. Depois de cultivar células T HEK293 que expressam hEAG1 por dois a três dias, colha as células removendo o meio de crescimento e use quatro mililitros de PBS para lavar as células duas vezes.

Descarte o PBS. Transforme as células em dois mililitros de PBS por prato e use uma pipeta de um mililitro para transferir para as células em um tubo de 15 mililitros. Centrifugue a suspensão celular a 420 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, transvase o sobrenadante e use quatro mililitros de tampão de lise para ressuspender o pellet. Incubar a suspensão no gelo durante 30 minutos, fazendo um vórtice completo do lisado de 10 em 10 minutos. Em seguida, centrifugue o lisado celular a 12.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo de cinco mililitros e mantenha-o no gelo para uso imediato. Para preparar a resina de afinidade anti-FLAG M2, suspenda completamente a resina por inversão suave para garantir que o frasco de gel anti-FLAG M2 seja uma suspensão uniforme de grânulos de gel. Transfira imediatamente 400 microlitros de suspensão para um tubo resfriado de 1,5 mililitro.

Em seguida, centrifugue a suspensão a 8.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 30 segundos e descarte cuidadosamente o sobrenadante para lavar o buffer de armazenamento. Para ressuspender o pellet de resina, adicione 500 microlitros de extrato de proteína sobrenadante à resina e transfira a suspensão para um novo tubo de cinco mililitros resfriado. Pipete mais 500 microlitros de extrato de proteína no tubo original para coletar as contas restantes e transfira o extrato para o tubo de cinco mililitros.

Incube a mistura em um shaker a oito rpm e quatro graus Celsius durante a noite para ligar a proteína de fusão FLAG à resina. Em seguida, centrifugue a mistura a 1.000 vezes a gravidade a quatro graus Celsius por 10 minutos. Rejeitar o sobrenadante e lavar o pellet três vezes com 500 microlitros de um x PBS.

Mantenha-o no gelo para uso imediato. Adicione 10 microlitros de três soluções de eluição x FLAG a 390 microlitros de PBS para uma concentração final de 200 nanogramas por microlitro. Em seguida, adicione 400 microlitros de três x solução de eluição FLAG às esferas de gel previamente preparadas.

Incubar a amostra numa incubadora agitada a oito rpm e quatro graus Celsius durante duas horas. Em seguida, centrifugue a resina a 8000 vezes a gravidade por 30 segundos. Transfira o sobrenadante para um tubo novo de 1,5 mililitro e armazene-o a quatro graus Celsius para uso imediato.

Use o ensaio de proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante para determinar a concentração da proteína purificada. Em seguida, use uma amostra de 30 microlitros para análise de Western Blot com um anticorpo anti-Flag para confirmar que a proteína de interesse foi purificada. Para rotular a proteína purificada com biotina, prepare cinco miligramas por mililitro de solução estoque de biotina em PBS.

Para cada teste de dois biossensores, adicione um excesso molar de três vezes de biotina a 20 microgramas de proteína purificada para obter uma biotinilação N-terminal preferível da proteína purificada em PBS. Incubar a amostra no escuro sobre gelo durante pelo menos 30 minutos. Para remover a biotina e o tampão não ligados, troque a proteína por tampão SD.

Transfira a proteína para um dispositivo de ultrafiltração com um corte molecular de 30 kilodaltons. Em seguida, adicione o tampão SD e centrifugue a amostra a 12.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 10 minutos. Remova o ultrafiltrado do tubo da centrífuga.

Adicione 200 microlitros de tampão SD no dispositivo de filtro e centrifugue a amostra novamente. Repita o processo pelo menos três vezes. Colete a amostra trocada de tampão virando o dispositivo de filtragem e coloque-o em um tubo de 1,5 mililitro.

Centrifugue a amostra a 2.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por cinco minutos. Mantenha a amostra no gelo para uso imediato. Para realizar o ensaio BLI, 30 minutos antes do estudo, pré-aqueça o equipamento ligando o instrumento.

Verifique a janela de status do instrumento para confirmar se a máquina está pronta antes de começar. Certifique-se de que a porta do instrumento esteja fechada antes de abrir o software de aquisição de dados e, no assistente de experimento, escolha o Novo experimento cinético. Defina os poços a serem usados na placa de 96 poços clicando com o botão direito do mouse para escolher o buffer, a carga e a amostra.

Para os alvéolos de amostra, a unidade de concentração de PIP2 deve ser introduzida sob a forma de molares. Para definir as etapas do ensaio, escolha uma etapa e clique duas vezes na respectiva coluna. Uma duplicata da definição do ensaio é definida para os sensores de controle.

Defina o rpm para 1.000. Escolha um minuto para a etapa de linha de base e cinco a 10 minutos para carregamento, associação e dissociação, respectivamente. Efectuar o ensaio à temperatura ambiente.

Clique nas colunas que contêm os sensores e clique em preencher para indicar a localização dos sensores na bandeja do sensor. Revise todas as etapas planejadas para verificar se há erros e volte para corrigi-los. Em toda a operação do ensaio BLI, a etapa de revisão de todas as etapas planejadas pode ser negligenciada pelo pesquisador.

No entanto, é muito importante verificar se todas as etapas planejadas estão corretas. Defina o local dos arquivos de dados e clique em ir para iniciar o ensaio. Execute o ensaio e analise os dados de acordo com o protocolo de texto.

Como visto neste experimento de patch clamp em uma célula T HEK293, expressando hEAG1 de forma estável, as correntes de potássio externas dependentes da voltagem sugerem que os canais funcionais de hEAG1 são altamente expressos nas células. Usando o anticorpo anti-FLAG, este Western Blot de hEAG1 de amostras de proteínas purificadas indica a qualidade e especificidade da proteína purificada. A proteína do canal purificado foi biotinilada para realizar um ensaio de interação com o lipídio PIP2 usando o ensaio BLI em tempo real.

Uma curva de ligação típica entre hEAG1 e PIP2 é mostrada aqui. hEAG1 está ligado a PIP2 de maneira dependente da concentração. As concentrações acumuladas de PIP2 correspondem aos traços de dados do biossensor.

Este ensaio representativo mostra as mudanças na interferência óptica em diferentes concentrações de PIP2. Finalmente, um ajuste de curva com a equação de Hill foi obtido a partir do valor de pico do sinal de interferência óptica medido em diferentes concentrações de PIP2 e determinou as constantes de dissociação de equilíbrio entre hEAG1 e PIP2. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de uma hora se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é muito importante lembrar de revisar todas as etapas planejadas, para garantir que este procedimento esteja correto. Seguindo este procedimento, outros métodos, como patch clamp, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como identificar a função desse canal iônico após a ligação da pequena molécula. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da triagem de ligantes de canais iônicos explorarem os novos ligantes na descoberta de medicamentos de canais iônicos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar a proteína do canal iônico e como testar sua interação com pequenas moléculas, com o método BLI.