Name: Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprenda a medir a interação entre o canal iônico hEAG1 e pequenas moléculas lipídicas usando o ensaio de interferometria de bio-camada (BLI). Este método de alta vazão permite analisar a cinética de ligação com quantidades mínimas de proteína purificada.

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Este trabalho é apoiado pelo centro de Bio-ID e SJTU fundo de investigação interdisciplinar em medicina e engenharia (YG2016QN66), Fundação Nacional de ciências naturais da China (31271217) e nacional pesquisa básica programa da China (2014CB910304).

Nota: A linha de celular HEK-293T continuamente expressando a proteína de canal com a tag bandeira hEAG1 é construída por transfecting um plasmídeo Lentivirus pCDH contendo a sequência de DNA de hEAG1 com uma bandeira no C-terminal distal em células HEK-293T seguido o resistente a puromicina seleção conforme descrito anteriormente15.
1. afinidade purificação da proteína de canal hEAG1 bandeira-tag de células HEK-293T
<ol><li>Descongele as células expressando estàvel hEAG1 canais de nitrogênio líquido na água quente (37 ° C) rapidamente. As células (cerca de 5 x 106 células de congelados) as sementes em um prato de 10 cm. Crescer a célula pernoite no modificado da águia de Dulbecco (DMEM) meio suplementado com 8 mL, 10% de soro bovino fetal (FBS) 100 penicilina unidades/mL, 100 estreptomicina μg/mL, 4 mM L-glutamina e mudou o meio, no dia seguinte.</li>
	<li>Verificar a fluorescência de GFP dessas células HEK-293T usando um microscópio fluorescente para certificar-se que a elevada percentagem de células estàvel express hEAG1 canais no sistema de cultivo. Trypsinize exponencialmente crescentes células com 1 mL de tripsina 0,25% por 1 min em temperatura ambiente e thenadd 2 mL de soro contendo líquido de cultura para finalizar a digestão. Transferência de 400 μL de suspensão de células para um prato de 15 cm, contendo 15 mL de meio DMEM completo. Prepare quatro pratos de 15 cm no total.</li>
	<li>
Após 2 – 3 dias cultura quando as células chegam a cerca de 90% da colheita dessas células confluência.
	<ol>
<li>Remover o meio de crescimento das células e lavá-los duas vezes com 4 mL de tampão fosfato salino (1X PBS, pH = 7,4).</li>
		<li>Descarte o PBS após a lavagem.</li>
		<li>Raspe as células em 2 mL 1X PBS para cada prato usando raspagem de célula e transferência das células raspadas com 1ml Pipetar para um tubo de 15 mL.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 5 min à 420 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Decantar e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda o pellet de células no total 4 mL de tampão de lise (10 mM HEPES, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de NaCl, 1% NP-40, pH 7.0, inibidor de protease completa contidos) por 30 min no gelo e o vórtice completamente o lisado cada 10 min.</li>
		<li>Centrifugue a célula lisada por 10 min a 12.000 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Transferir o sobrenadante para um tubo de 5 mL e mantê-lo em gelo para uso imediato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare a resina de afinidade do anti-FLAG M2.
	<ol>
<li>Suspenda cuidadosamente a resina (fornecida como uma suspensão de 50% na reserva de loja) gentilmente por inversão para certificar-se de que o frasco do gel de afinidade M2 anti-FLAG é uma suspensão uniforme dos grânulos do gel.</li>
		<li>Imediatamente transfira 400 μL de suspensão para um tubo de refrigerados 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão por 30 s em 8, 000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante cuidadosamente para limpar o buffer de armazenamento.</li>
		<li>Adicionar 500 μL 1X PBS para a resina e suspender a pelota com pipeta de 1 mL. Centrifugar a suspensão por 30 s em 8, 000 x g a 4 ° C e descartar a sobrenadante PBS cuidadosamente. Repita estas etapa de lavagem para limpar o buffer armazenado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 500 μL proteína extrato líquido sobrenadante preparado no passo 1.3.8 para a pelota de resina para suspender o sedimento e a suspensão de transferência para um novo tubo de 5ml refrigerada. Repita este passo novamente para certificar-se sem grânulos do gel de esquerda. Adicione o extrato de proteína esquerdo à mistura.</li>
	<li>Incube a mistura durante a noite em um shaker a 8 rpm a 4 ° C, para capturar a proteína de fusão de bandeira.</li>
	<li>Centrifugue a mistura após incubação de 12 h de 10 min a 1, 000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento três vezes com 500 μL de 1X PBS. Mantê-lo em gelo para uso imediato.</li>
	<li>
Proteína de eluição hEAG1 a bandeira com 3x do peptídeo sinalizador.
	<ol>
<li>Prepare a solução de eluição de bandeira X 3. Dissolver 3 peptídeo sinalizador X na solução estoque de 500 μL (0,5 M Tris-HCl, NaCl de 1 M, pH = 7,5) em uma concentração de 8 μg/μL.</li>
		<li>Adicione 10 μL 3 x solução de eluição de bandeira para 390 μL de PBS para ser uma solução de concentração final de 200 ng/μL.</li>
		<li>Adicione 400 μL de solução de eluição de bandeira x 3 para os gel de grânulos preparados no passo 1.8.</li>
		<li>Incubar a amostra no shaker a 8 rpm por 2 h a 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugue a resina por 30 s em 8, 000 x g.</li>
		<li>Transferir o sobrenadante para um tubo 1,5 mL e armazená-lo em 4 ° C, para uso imediato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. a concentração do ensaio e confirmação de bandeira purificado Fusion hEAG1 pelo BCA proteína Kit de ensaio e mancha ocidental
<ol><li>Determine a concentração de proteína purificada usando o kit de ensaio de proteína BCA de acordo com instruções do fabricante.</li>
	<li>Use 30 amostra μL para análise ocidental para confirmar que a proteína de interesse tinha sido purificada usando um anticorpo anti-FLAG como descrito anteriormente,15.</li>
</ol>3. rotulagem a proteína purificada-Channel com biotina para o ensaio BLI
<ol><li>Prepare 5 mg/mL solução stock de biotina em PBS. Para cada teste (dois biosensores), adicione um 3 vezes excesso molar de biotina a 20 μg purificado proteína, para alcançar um preferível biotinylation N-terminal da proteína purificada em PBS.</li>
	<li>Incube a amostra no escuro no gelo pelo menos 30 min.</li>
	<li>Preparar o tampão de diluição (SD) de amostra: PBS com albumina de soro bovino de 0.02% polissorbato 20 e 0.1% (BSA, pH 7,4).</li>
	<li>Execute a ultrafiltração para alterar o buffer da proteína purificada de canal para o buffer de SD. Remover a biotina não acoplada usando o dispositivo de ultrafiltração com peso molecular de corte de 30 kDa, adicionando o buffer de SD e centrifugação da amostra a 12.000 x g, durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o ultrafiltrate do tubo de centrífuga de dispositivo de ultrafiltração, juntar 200 μL de tampão de SD para o dispositivo de filtro e centrifugação da amostra a 12.000 x g, durante 10 minutos a 4° C. Repita esta operação pelo menos três vezes.</li>
	<li>Para coletar o buffer trocado amostra, inverteu Introduza o dispositivo de filtro em um tubo de 1,5 mL e centrifugação-los a 2.000 x g, durante 5 min a 4 ° C. Manter a amostra em gelo para uso imediato.</li>
</ol>4. preparação da solução de2 PIP para ensaio
<ol><li>Prepare a solução-mãe de PIP2 (1 mM) em desionizada H2O, sonicating por 30 min no gelo como descrito anteriormente,17. Conservar a solução em frascos de vidro a-20 ° C e diluí-la para as concentrações finais imediatamente antes de experimentos por vigorosa num Vortex.</li>
</ol>5. BLI ensaio
<ol><li>Ligue o equipamento e verifique a janela "status de instrumento" para confirmar que a máquina está em estado "pronto" para escaldar o equipamento pelo menos durante 30 min antes do estudo da BLI.</li>
	<li>Certifique-se de que fechar a porta do aparelho antes de abrir o software de aquisição de dados e escolher a "nova experiência cinética" no assistente do experimento.</li>
	<li>Defina os poços para ser usado na placa de 96 poços pelo botão direito escolher tampão, carga e amostra. Para poços de amostra, a unidade de concentração de proteína de hEAG1 biotinilado bandeira fusão deve ser entrada como molar (10 μg, 0.09 μM).</li>
	<li>Defina as etapas de ensaio, incluindo a linha de base, carregamento, associação e dissociação. Escolha uma etapa de ensaio e clique duas vezes na coluna respectiva. Uma cópia da definição de ensaio é definida para sensores de controle. Defina o rpm como 1.000. Escolha 1 min para etapa da linha de base e 5-10 min para carregamento, associação e dissociação, respectivamente. Realize o teste à temperatura ambiente (cerca de 24 ° C). Nota: Existem dois processos principais: a proteína de canal biotinilado aos sensores de carga e análise da interação com pequenas moléculas de compostos. Eles podem ser continuamente procedeu (linha de base, carregamento, linha de base, associação e dissociação). Alternativamente, eles podem ser procedeu separadamente para não desperdiçar os compostos do teste quando o primeiro carregamento parte vencida.</li>
	<li>Clique em colunas que contêm os sensores e clique em "Preenchimento" para indicar as localizações dos sensores na bandeja do sensor.</li>
	<li>Reveja tudo planejados passos para verificar erros e voltar para corrigi-los.</li>
	<li>Defina a localização dos arquivos de dados e clique em "Go" para iniciar o ensaio. Nota: Os sensores precisam prewetted pelo menos 10 min no buffer de SD, se tiver sido feito este passo, em seguida, a configuração de "Experimento início posterior" deve ser ignorada. Se não, definir um atraso de s 600 antes de prewetting os sensores.</li>
	<li>Coloquei uma placa de 96 poços a preta na parte inferior da bandeja e insira o encaixe a bandeja com a placa do assento A1 canto da placa. Para os poços carregar os sensores, 200 μL de tampão de ensaio por bem adicionar 2 poços na linha A e 2 poços na linha B da placa de 96 poços.</li>
	<li>Prepare outra placa de 96 poços preta como a placa da amostra e encher os poços com buffer de SD 200 μL na linha B como controle ou biotinilado solução de proteína do hEAG1 (10 μg) na linha A, conforme atribuído durante a programação na etapa 5.3. Nota: Evite a introdução de bolhas.</li>
	<li>Abra a porta do aparelho e insira a bandeja de sensor e placa da amostra no suporte do prato esquerdo e direito, respectivamente. Verifica que a placa de sensor da bandeja e a amostra estão posicionados corretamente, com base na forma do suporte da placa à esquerda e o marcador de "A1" no canto superior direito do suporte da placa direita. Feche a porta e começar o ensaio.</li>
</ol>6. análise de dados
<ol><li>Abra o software de análise de dados e carregar a pasta que contém os dados do ensaio. Clique em "Transformação" para entrar na interface de menu processamento e podemos ver as curvas de cinéticas crus coloridas.</li>
	<li>Sob Step1: "Seleção de dados", clique em "Seleção de Sensor". No "Sensor bandeja #1", clique em poços do sensor somente humedecido com buffer de SD e clique com o botão direito para "Alterar Sensor tipo" a "Sensor de referência". Sobre o ' mapa de placa de amostra ", designar os todos os poços de ligação não-específica e clique com o botão direito para"Mudança bem tipo"a"Referência bem".</li>
	<li>Assinale a caixa antes de "Subtração" da etapa 2 e ponto de "referência duplo".</li>
	<li>Na etapa 3: "Alinhar eixo Y", selecione "Baseline" como a etapa de alinhamento. Para "Intervalo de tempo", digite os últimos 10 s essa linha de base de (ou seja, de: 0,1 a: 59.8).</li>
	<li>Na etapa 4: "Etapa inter correção", selecione "alinhar a linha de base" para minimizar deslocamentos de sinal entre as etapas de associação e dissociação.</li>
	<li>Na etapa 5: "Processo", selecione a função de filtragem Savitzky-Golay na maioria dos casos e prossiga "Processar dados".</li>
	<li>Salvar dados brutos para posterior análise de dados usando outro software no passo 7: "Salvar resultados".</li>
	<li>
Clique em "análise | Encaixe de curva".
	<ol>
<li>Para "Passo a analisar", escolha "Associação | Dissociação". Para o "Modelo", selecione 1:1. Nota: nós escolhemos 1:1 modelo porque equipar bem os nossos dados originais e evitar a possibilidade de sobre encaixe sob 1:2 ou 2:1 modelo devido a sua alta liberdade. Mas outras opções estão disponíveis aqui e podem ser devidamente escolhidas para outras análises de montagem para os modelos de ligação diferente do analito.</li>
		<li>Para o "Encaixe", escolha Global (completo). Para "Group By", selecione "Cor". Selecione "Rmax desvinculados por Sensor" para permitir o encaixe independente de resposta máxima do sinal (Rmax).</li>
		<li>Clique em "Ajustar curvas!" para iniciar a análise de regressão não linear. Em nosso estudo, utilizaram-se equação de Hill e única função exponencial.</li>
		<li>Clique em "exportação de dados | Relatório de salvar"para salvar resultados de encaixe. Ou clique em "exportação de dados | Exportar os resultados do encaixe"para salvar os dados brutos para mais gráficos e análise de dados com outros softwares.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Interactions+with+Model+Lipid+Membranes%3A+Applications+in+Drug+Discovery+and+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery.</a> Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).</li>
<li>van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Property-based+design%3A+Optimization+of+drug+absorption+and+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics.</a> J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).</li>
<li>Papo, N., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+peptide+membrane+interaction+using+surface+plasmon+resonance%3A+Differentiation+between+pore+formation+versus+membrane+disruption+by+lytic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides.</a> Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).</li>
<li>Fechner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%21+Label-free+detection+of+small+molecule-protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).</li>
<li>Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Bio-Layer+Interferometry+for+the+analysis+of+protein%2Fliposome+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).</li>
<li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Aided+Mol.+Des%22%5BJournal%5D)">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-layer+Interferometry+for+Measuring+Kinetics+of+Protein-protein+Interactions+and+Allosteric+Ligand+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects.</a> J. Vis. Exp. (84), e51383(2014).</li>
<li>Occhiodoro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+human+ether-a-go-go+potassium+channel+expressed+in+myoblasts+at+the+onset+of+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Lett%22%5BJournal%5D)">Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion.</a> Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).</li>
<li>Pardo, L. A., Stuhmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eag1%3A+An+emerging+oncological+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Eag1: An emerging oncological target.</a> Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).</li>
<li>Simons, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+voltage-gated+potassium+channel+gene+KCNH1+cause+Temple-Baraitser+syndrome+and+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy.</a> Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).</li>
<li>Kortum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+KCNH1+and+ATP6V1B2+cause+Zimmermann-Laband+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome.</a> Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).</li>
<li>Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eag1+K%2B+Channel%3A+Endogenous+Regulation+and+Functions+in+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).</li>
<li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+EAG+channels+are+directly+modulated+by+PIP2+as+revealed+by+electrophysiological+and+optical+interference+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations.</a> Sci. Rep. 6, (2016).</li>
<li>Do, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+dynamic+binding+capacity+of+resins+for+the+purification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PREP%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins.</a> PREP. 60 (2), 147-150 (2008).</li>
<li>Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+specificities+of+inwardly+rectifying+K%2B+channels+for+phosphoinositides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides.</a> J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).</li>
<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+drug+targets+are+there%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">How many drug targets are there?</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).</li>
<li>Suh, B. C., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+is+a+necessary+cofactor+for+ion+channel+function%3A+How+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+High-affinity+Antibody-antigen+Binding+Kinetics+Using+Four+Biosensor+Platforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms.</a> J. Vis. Exp. (122), e55659(2017).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Verificados como os alvos terapêuticos primários de mais de 13% de drogas atualmente conhecidas para o tratamento de uma variedade de doenças humanas, incluindo distúrbios cardiovasculares e neurológicos18canais iônicos de membrana. Remendo-braçadeira de gravação, o padrão ouro para medir o funcional de canais iônicos com pequenas moléculas, tem sido amplamente utilizada para ligantes de canal de íon de triagem. No entanto, tais abordagens eletrofisiológicas não podem demonstrar se as moléculas pe...

Como alvo as proteínas de canal de íon superfície acessível de célula com pequenas moléculas oferece um enorme potencial para a triagem de ligante e descoberta de drogas biológicas a1,2,3. Assim, um instrumento adequado é necessário para estudar a interação entre o canal iônico e pequenas moléculas e sua função correspondente. A gravação da remendo-braçadeira tem demonstrada para ser uma técnica única e insubstituível em ensaio funcional de canal de íon. No entanto, determinar se as pequenas moléculas alvo diretamente canais iônicos exigir outras tecnologias. Tradicionalmente, o ensaio de ligação do ligante radioativo foi usado para observar a cinética de ligação entre pequenas moléculas e sua proteína de canal de íon do alvo. No entanto, o uso desta técnica é limitado por causa de sua exigência em etiquetar radioativo e deteção. Além disso, a etapa pré-requisito para rotular o ligante pequeno no estudo impede seu uso em muitos tipos de canais iônicos sem ligante específico conhecido. Algumas técnicas de etiqueta livre tais como espectroscopia NMR, difração de raios x, microescala thermophoresis (MST)4 e ressonância de plasmon de superfície (SPR) tem sido usadas para medir as interações da proteína-pequena molécula. Mas esses tipos de ensaios geralmente não podem fornecer informações suficientes por causa da dificuldade para obter a proteína completo, baixa resolução de dinâmica, baixa taxa de transferência e de alto custo5. Em contraste com estas técnicas, bio-camada interferometria (BLI) está emergindo como uma metodologia romance livre de rótulo para superar estas desvantagens para detecção de interações proteína-pequena molécula por imobilizando um pequenas quantidades de amostra de proteína nas superfícies das Biosensor e medir a mudança da ótica sinais6,7. Como uma plataforma de biosensor promissor, técnica BLI já é realizada para observar a interação de moléculas pequenas com água natural proteínas solúveis como um anticorpo monoclonal humano CR80208 e o procedimento de ensaio detalhado tem sido relatado em uma anterior artigo9. Embora o papel fundamental da proteína de canal de íon para descoberta de novos alvos terapêuticos tem sido reconhecido, o ensaio de interação molécula de proteína-pequeno de canal íon baseado em BLI não foi descrito.
O ser humano canais éter à go-go (hEAG1) são expressos em vários tipos de células cancerosas e sistema nervoso central, que faz com que o canal um potencial alvo terapêutico de muitos cancros e distúrbios neuronal10,11, 12,13,14. O estudo eletrofisiológico em nosso laboratório confirmou o efeito inibitório de fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP2) do hEAG1 canal15. Com base em nossos resultados, teste PIP2 diretamente a interação com o hEAG1, usando a técnica BLI pode ser como um modelo para outros tipos de interação composto de íon canal molécula de proteína-pequeno especialmente para esses canais sem ligantes específicos. De acordo com as instruções de ensaio BLI, estamos preparados biotinilado hEAG1 proteínas e imobilizado-los na superfície do streptavidin (SA) dicas biosensor seguiram de interação-os para soluções de2 PIP para observar sua vinculação direta entre o proteínas e os lipídios. Após a fixação do PIP2 para hEAG1 a superfície revestida de proteína, a espessura da camada na superfície aumenta, que diretamente correlaciona o deslocamento espectral e pode ser medido em tempo real16. A cinética de ligação pode ser determinada devido a uma mudança positiva na etapa de associação e uma mudança negativa na etapa da dissociação. De acordo com este princípio, nós purificado da proteína de canal de íon hEAG1 funcional de HEK-239T expressão estável sistema usando o método de purificação de afinidade para manter o estado funcional in vitro , em seguida, medido a cinética de ligação de concentração diferente PIP2e rendeu um semblable dados cinéticos, como observado em medidas eletrofisiológicas15. A estreita correspondência entre os resultados do BLI e medições eletrofisiológicas demonstram pela primeira vez a adequação do BLI como uma ferramenta analítica adequada para interação de molécula de proteína-pequeno membrana do canal de íon.

<table><tbody><tr><td>DMEM/Meio de Alta Glicose</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>1697550</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de células</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>150 mm X 25 mm</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Substituto</td><td>Amresco</td><td>E109</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610476</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610440</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A600332</td><td></td></tr><tr><td>Monolaurato de polioxietileno-20-sorbitano</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>3x peptídeo FLAG</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Octet-RED96</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>30-5048</td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição de dados</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>Versão 7.1</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de dados</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>Versão 7.1</td><td></td></tr><tr><td>Biosensor/Streptavidin</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>18-5019</td><td></td></tr><tr><td>Placa de microtitulação</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina</td><td>ThermoFisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Máquina centrífuga</td><td>ThermoFisher</td><td>75004250</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Escada de proteína prestada</td><td>ThermoScientific</td><td>318120</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de ultrafiltração</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC503008</td><td>NMWL de 30 kDa</td></tr><tr><td>fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2)</td><td>Sigma</td><td>P9763</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal ANTI-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>1:2000 diluição</td></tr><tr><td>cabra anti-camundongo HRP-conjugado anticorpo secundário Santa</td><td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>1:5000 diluição</td></tr> Kit de <tr><td>ensaio de proteína BCA aprimorado</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de coquetel de inibidores de protease</td><td>Roche</td><td>04693159001</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600 Sistema de imagem</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Western blot</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de bio-camada

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

O ensaio de interferometria (BLI) bio-camada é uma ferramenta valiosa para a medição da proteína-proteína e interações da proteína-pequena molécula. Aqui, descrevemos primeiro a aplicação desta técnica romance livre de rótulo para estudar a interação de EAG1 humano proteínas de canal (hEAG1) com a pequena molécula PIP2. hEAG1 canal tem sido reconhecida como potencial alvo terapêutico por causa de sua superexpressão aberrante em cânceres e algumas mutações de ganho-de-função envolvida em alguns tipos de doenças neurológicas. Nós purificada proteínas de canal hEAG1 de um sistema de expressão estável mamíferos e medido a interação com PIP2 por BLI. A medida bem sucedida da cinética de ligação entre a proteína hEAG1 e PIP2 demonstra que o ensaio BLI é uma abordagem de alto rendimento potencial usada para a seleção de romance pequeno-molécula ligante em farmacologia do canal de íon.

Nós purificado a bandeira hEAG1 canal proteína da fusão da HEK-293T células estàvel Blumental hEAG1. A função desta proteína de fusão foi demonstrada usando o método da remendo-braçadeira e a qualidade e a especificidade da proteína purificada são confirmadas por Western blot (Figura 1). A proteína purificada canal é biotinilado para realizar um ensaio de interação com os lipídios (PIP2) usando o ensaio BLI em tempo real. A configuração de ensaio d...

O protocolo aqui descreve as interações da proteína de canal de íon hEAG1 purificado com a pequena molécula lipídica ligante fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP2). A medida demonstra que BLI poderia ser um método potencial para rastreio de ligante de canal novela pequena molécula íon.

Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

O objetivo geral deste ensaio de interferometria de biocamada ou BLI é medir a interação potencial entre a proteína purificada do canal iônico hEAG1 e os lipídios de pequenas moléculas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da farmacologia do canal iônico, como se a pequena molécula de interesse pode interagir diretamente com esse canal iônico e qual é a cinética da interação? A principal vantagem dessa técnica é que ela é um método livre de mão de obra e de alto rendimento.Apenas uma pequena quantidade de proteína imobilizada é necessária. Geralmente, os indivíduos que são novos nesse método terão dificuldades porque um ensaio bem-sucedido envolve várias etapas, incluindo expressão de proteínas, purificação, rotulagem, sensor ajustado com precisão e análise de dados. Depois de cultivar células T HEK293 que expressam hEAG1 por dois a três dias, colha as células removendo o meio de crescimento e use quatro mililitros de PBS para lavar as células duas vezes.Descarte o PBS. Transforme as células em dois mililitros de PBS por prato e use uma pipeta de um mililitro para transferir para as células em um tubo de 15 mililitros. Centrifugue a suspensão celular a 420

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Biochemistry

Bioquímica

Neste vídeo, demonstramos a tecnologia de interferometria de biocamada (BLI) para detectar as interações intermoleculares entre ligantes e analitos alvo em tempo real. O BLI mede as mudanças no padrão de interferência da luz branca refletida por uma camada de ligantes imobilizados na superfície de um biossensor à medida que interagem com os analitos em solução.

Tecnologia de interferometria de biocamada para detectar interações entre ligante e analito

Os protocolos aqui descrever os ensaios cinéticos de interações proteína-proteína com Bio-camada Interferometria. Tipo F ATP sintase, que está envolvida no metabolismo da energia celular, pode ser inibida pela sua subunidade ε em bactérias. Temos adaptado Bio-camada de interferometria para estudar as interacções do complexo catalítico com o domínio C-terminal do inibidor ε.

Interferometria Bio-layer para Medição Cinética de interações proteína-proteína e alostéricas Ligante Effects

Aqui nós apresentamos um protocolo para monitorar a montagem e desmontagem da toxina antraz usando interferometria biolayer (BLI). Na sequência de montagem/desmontagem na superfície biosensor, os grandes complexos de proteínas são liberados da superfície para visualização e identificação dos componentes dos complexos usando microscopia eletrônica e espectrometria de massa, respectivamente.

Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

As interações de fatores de transcrição (TFs) com a RNA polimerase são geralmente estudadas usando ensaios de pulldown. Nós aplicamos uma tecnologia da interferometria de Biolayer (BLI) para caracterizar a interação de GrgA com o polymerase do RNA do chlamydial. Comparado aos ensaios de pulldown, o BLI detecta associação e dissociação em tempo real, oferece maior sensibilidade e é altamente quantitativo.

Aplicação de interferometria Biolayer (BLI) para o estudo de interações proteína-proteína em transcrição

Este protocolo descreve como usar a microscopia TIRF para rastrear canais iônicos individuais e determinar sua atividade em membranas lipídicas suportadas, definindo assim a interação entre o movimento da membrana lateral e a função do canal. Ele descreve como preparar as membranas, registrar os dados e analisar os resultados.

Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

Este artigo descreve um protocolo para estudar as interações DNA-proteína usando um sistema de interferometria de biocamada (BLI) baseado em estreptavidina. Ele descreve as etapas e considerações essenciais para a utilização da cinética de ligação básica ou avançada para determinar a afinidade de ligação de equilíbrio (KD) da interação.

Analisando interações DNA-proteína com interferometria de biocamada baseada em estreptavidina

A interacção entre os canais HCN e a sua sub-unidade auxiliar tem sido identificada como um alvo terapêutico em Perturbação Depressiva Major. Aqui, um método baseado em polarização de fluorescência para identificar pequenas moléculas inibidoras desta interacção proteína-proteína, é apresentada.

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

As interações proteína-proteína podem ocorrer tanto no núcleo quanto no citoplasma de uma célula. Para investigar essas interações, a co-imunoprecipitação tradicional e o ensaio moderno de ligação de proximidade são aplicados. Neste estudo, comparamos esses dois métodos para visualizar a distribuição das interações NF90-RBM3 no núcleo e no citoplasma.

Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Assay

Descrevemos os procedimentos detalhados e estratégias para medir as propriedades mecânicas e mecânicas vias desdobramento de moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica. Também mostramos resultados representativos como uma referência para a seleção e a justificativa de gravações de molécula de proteína única boa.

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

Canais de íon Mechanosensitive muitas vezes são estudados em termos de sensibilidade de fluxo fluido/cisalhamento força com gravação de remendo-braçadeira. No entanto, dependendo do protocolo experimental, os resultados no fluxo fluidos-regulamentos de canais iônicos pode ser errôneo. Aqui, nós fornecemos métodos de prevenção e corrigir esses erros com uma base teórica.

Medição da concentração de íons na camada limite Unstirred com pipeta aberto Patch-Clamp: implicações no controle de canais iônicos por fluido fluem

Aprenda a medir a interação entre o canal iônico hEAG1 e pequenas moléculas lipídicas usando o ensaio de interferometria de bio-camada (BLI). Este método de alta vazão permite analisar a cinética de ligação com quantidades mínimas de proteína purificada.

Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada (Vídeo) | JoVE Journal

Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada

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