4.11: Ultracentrifugação por Gradiente de Densidade

A ultracentrifugação gradiente de densidade é uma técnica comum usada para isolar e purificar biomoléculas e estruturas celulares. Esta técnica explora o fato de que, em suspensão, partículas mais densas do que o solvente irão sedimentar, enquanto aquelas que são menos densas flutuarão. Uma ultracentragem de alta velocidade é usada para acelerar esse processo, a fim de separar biomoléculas dentro de um gradiente de densidade, que pode ser estabelecido por camadas de líquidos de densidade decrescente em um tubo de centrífuga.

O vídeo abordará os princípios da ultracentrifugação de gradiente de densidade, incluindo um procedimento que demonstra a preparação da amostra, a criação de um gradiente de sacarose, ultracentrifugação e coleta de analitos fracionados. A seção de aplicações discute o isolamento de complexos multi-proteínas, o isolamento de complexos ácidas nucleicos e a separação usando gradientes de densidade de cloreto de césio.

A ultracentrifugação com gradiente de densidade é uma abordagem comum para isolar e purificar estruturas celulares para experimentos bioquímicos. A técnica usa uma centrífuga de alta velocidade, ou ultra, para separar de forma não destrutiva os componentes celulares em um gradiente de densidade. Este vídeo descreve os princípios da ultracentrifugação com gradiente de densidade, fornece um procedimento geral usando um gradiente de sacarose e discute algumas aplicações.

Vamos começar examinando os princípios das ultracentrífugas e gradientes de densidade. Uma suspensão contém partículas em um solvente líquido. Por causa da gravidade, as partículas mais densas que o solvente sedimentam enquanto as menos densas que o solvente flutuam. Quanto maior a diferença de densidade entre a partícula e o solvente, mais rápida a separação.

Uma ultracentrífuga contém uma unidade chamada rotor, que gira a velocidades altamente controladas, simulando um forte campo gravitacional. Dentro deste campo, as diferenças de densidade entre as partículas e o solvente são ampliadas.

A força do campo depende da velocidade de rotação. Mesmo um pequeno rotor a uma velocidade de rotação relativamente baixa pode criar uma força milhares de vezes mais forte do que o campo gravitacional da Terra.

Se um tubo contiver vários líquidos de diferentes densidades, a centrifugação os manterá em camadas separadas em ordem de densidade, com o líquido mais denso mais próximo da base. Essa camada de vários líquidos é chamada de "gradiente de densidade". Existem dois tipos. Em gradientes de degraus, líquidos de densidade decrescente são cuidadosamente colocados em camadas uns sobre os outros. Em gradientes contínuos, os líquidos são misturados em proporções variadas, de modo que a densidade diminui suavemente da base para cima.

As organelas celulares podem ser separadas usando um gradiente escalonado, por meio de "centrifugação de gradiente de densidade isopícnica". Este é o procedimento de centrifugação mais simples e comum.

Este procedimento é usado para separar as estruturas celulares. Quanto mais densa a organela, mais ela desce - com mitocôndrias na parte superior e ácidos nucléicos na parte inferior.

Agora que você conhece os princípios por trás da técnica, vamos vê-la no laboratório.

Antes de iniciar o procedimento, as classificações de velocidade e densidade do fabricante devem ser anotadas e a ultracentrífuga verificada quanto à corrosão. Este procedimento usa um rotor de caçamba oscilante.

Primeiro, o material celular é preparado homogeneizando as células, o que libera suas organelas de forma não destrutiva. O homogenato pode ser fracionado por meio de centrifugação preliminar de baixa velocidade, para remover componentes de baixa densidade. Em seguida, as soluções de sacarose são preparadas.

A sacarose é adicionada em quantidades crescentes para que cada solução seja mais concentrada e, portanto, mais densa do que a anterior. As densidades exatas das soluções dependerão dos componentes a serem separados, que variam entre os organismos. As soluções devem ter densidades entre as dos componentes a serem separados, sendo a última solução mais densa que o componente mais denso da substância a analisar. Técnicas para separar componentes mais densos que a sacarose, como ácidos nucléicos, são descritas nas aplicações.

O gradiente de sacarose agora é criado em um tubo de centrífuga limpo. Uma pipeta é usada para extrair a solução de sacarose mais concentrada. Com o tubo mantido na vertical, a ponta da pipeta é colocada no alto da parede e o líquido é dispensado de forma constante. É importante que a área de trabalho seja mantida livre de vibrações e outros distúrbios.

Depois de substituir a ponta, as soluções restantes são adicionadas em ordem decrescente de densidade. Eles são dispensados com cuidado para formar camadas distintas e evitar misturas. Finalmente, cerca de meio mililitro da amostra celular é adicionado no topo do gradiente e o tubo é pesado. Isso é usado para equilibrar a distribuição de peso, a próxima etapa do processo.

A centrifugação deve começar o mais rápido possível. O tubo é colocado no rotor, que é então equilibrado colocando soluções em branco de igual peso em ranhuras opostas. O rotor é colocado na ultracentrífuga e o sistema selado. A temperatura e a velocidade e o tempo de rotação são definidos. Os valores típicos são 4 ? C com uma força de mais de 100.000 x g por 16 h.

Após a centrifugação, o tubo é retirado do rotor, tomando cuidado para mantê-lo na posição vertical e sem perturbações. Os diferentes componentes celulares foram fracionados em bandas discretas entre as camadas da solução. As frações podem ser coletadas com uma seringa. Alternativamente, o fundo do tubo pode ser perfurado com uma agulha fina e esterilizada e o fluxo de saída coletado em tubos estéreis. Os componentes celulares agora foram isolados. Eles podem ser armazenados em -80 ?C.

Agora que vimos o procedimento básico, vamos dar uma olhada em alguns aplicativos.

Uma aplicação típica é o isolamento de complexos multiproteicos em células vegetais. Neste exemplo, os complexos responsáveis pelo fluxo cíclico de elétrons estão sendo isolados do tilacóide, o local da reação da luz na fotossíntese. Este procedimento usa soluções discretas de 14 a 45% de sacarose. A centrifugação ocorre acima de 100.000 x g por 14 h a 4 ?C.

Como os ácidos nucléicos são mais densos que a sacarose, a centrifugação isopícnica não pode separá-los das organelas de forma não destrutiva.

Uma técnica diferente, conhecida como "centrifugação zonal de taxa" é usada. Ele separa as organelas com base em suas taxas de sedimentação, que dependem não apenas de suas densidades, mas também de suas conformações. Um gradiente contínuo é usado para separar os componentes com base nessa propriedade.

As etapas processuais são semelhantes às dos casos isopícnicos. Neste exemplo, os complexos RNA-ribossomo são isolados usando um gradiente contínuo de 5% a 20%, centrifugado a 230.000 x g. A centrifugação é interrompida após algumas horas para evitar a co-precipitação.

As fitas de ácido nucleico podem ser separadas umas das outras com base na densidade.

Isso ocorre porque os fios ricos em guanina e citosina são mais densos do que aqueles ricos em adenina e tiamina. Nesse caso, o gradiente não pode ser feito de sacarose, porque a sacarose é menos densa que os ácidos nucléicos. Em vez disso, gradientes de cloreto de césio, normalmente de 1,65 a 1,75 g/mL, são usados, pois têm densidade suficiente e baixa viscosidade.

Aqui vemos o DNA do plâncton sendo purificado usando um gradiente contínuo de cloreto de césio. A centrifugação ocorre a mais de 1.000.000 x g por 18 h sob vácuo.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre ultracentrifugação com um gradiente de densidade de sacarose. Agora você deve entender como funciona um gradiente de densidade, como construir um gradiente de degrau e como carregar e operar uma ultracentrífuga. Obrigado por assistir!