Bioquímica

A diálise é uma técnica comum usada na bioquímica para separar moléculas baseadas na difusão. Neste procedimento, uma membrana semipermeável permite o movimento de certas moléculas com base no tamanho. Este método pode ser aplicado à remoção de tampão, conhecido como desselting, ou troca de moléculas tampão ou íons de uma solução proteica. Este vídeo abrange os princípios da diálise, juntamente com um procedimento geral.  Várias aplicações da diálise são revisadas, incluindo a remoção de...

A cinética enzimática descreve os efeitos catalíticos das enzimas, que são biomoléculas que facilitam reações químicas necessárias para organismos vivos. Enzimas atuam em moléculas, conhecidas como substratos, para formar produtos. Os parâmetros cinéticos enzimáticos são determinados através de ensaios que medem direta ou indiretamente mudanças no substrato ou concentração do produto ao longo do tempo. Este vídeo abordará os princípios básicos da cinética enzimática (incluindo equações de taxa)...

A ionização de desorpção a laser assistida por matriz (MALDI) é uma fonte de íons de espectrometria de massa ideal para a análise de biomoléculas. Em vez de compostos ionizantes no estado gasoso, as amostras são incorporadas em uma matriz, que é atingida por um laser. A matriz absorve a maior parte da energia; parte dessa energia é então transferida para a amostra, que ioniza como resultado. Os íons de amostra podem então ser identificados usando um analisador de tempo de voo (TOF). Este vídeo...

Em conjunto espectrometria de massa, uma biomolécula de interesse é isolada de uma amostra biológica, e então fragmentada em múltiplas subunidades, a fim de ajudar a elucidar sua composição e sequência. Isso é feito por ter espectrômetros de massa em série. O primeiro espectrômetro ioniza uma amostra e filtrar íons de uma proporção de massa específica para carga. Os íons filtrados são então fragmentados e passados para um segundo espectrômetro de massa onde os fragmentos são analisados. Este...

Cristalização proteica, obtenção de uma rede sólida de biomoléculas, elucida estrutura proteica e permite o estudo da função proteica. A cristalização envolve a secagem da proteína purificada sob uma combinação de muitos fatores, incluindo pH, temperatura, força iônica e concentração de proteínas. Uma vez obtidos cristais, a estrutura proteica pode ser elucidada por difração de raios-X e computação de um modelo de densidade eletrônica. Este vídeo introduz cristalização de proteínas e mostra um...

Na bioquímica, métodos de purificação à base de cromatografia são empregados para isolar compostos de uma mistura complexa. Dois desses métodos utilizados comumente por bioquímicos são a cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de afinidade. Na cromatografia de exclusão de tamanho, uma coluna repleta de contas porosas separa componentes de uma mistura baseada no tamanho. Por outro lado, a cromatografia de afinidade permite uma separação mais específica das biomoléculas usando uma...

Eletroforese de gel bidimensional (2DGE) é uma técnica que pode resolver milhares de biomoléculas a partir de uma mistura. Esta técnica envolve dois métodos de separação distintos que foram acoplados: foco isoelétrico (IEF) e eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de sódio (SDS-PAGE). Isso separa fisicamente compostos através de dois eixos de um gel por seus pontos isoelétricos (uma propriedade eletroquímica) e seus pesos moleculares. O procedimento neste vídeo abrange os principais...

A rotulagem metabólica é usada para sondar as transformações bioquímicas e modificações que ocorrem em uma célula. Isso é feito usando análogos químicos que imitam a estrutura de biomoléculas naturais. As células utilizam análogos em seus processos bioquímicos endógenos, produzindo compostos que são rotulados. O rótulo permite a incorporação de tags de detecção e afinidade, que podem então ser usadas para elucidar vias metabólicas utilizando outras técnicas analíticas bioquímicas, como SDS-PAGE...

O ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) é um procedimento bioquímico usado para elucidar a ligação entre proteínas e ácidos nucleicos. Neste ensaio, um ácido nucleico radiolabeled e proteína de teste são misturados. A vinculação é determinada através da eletroforese gel que separa os componentes com base na massa, carga e conformação. Este vídeo mostra os conceitos da EMSA e um procedimento geral, incluindo preparação de gel e proteína, ligação, eletroforese e detecção. Os...

Medir a concentração é um passo fundamental de muitos ensaios bioquímicos. A determinação da proteína fotométrica aproveita o fato de que quanto mais uma amostra contém substâncias absorventes de luz, menos a luz transmitirá através dela. Como a relação entre concentração e absorção é linear, esse fenômeno pode ser usado para medir a concentração em amostras onde é desconhecido. Este vídeo descreve o básico da determinação da proteína fotométrica e introduz o Bradford Assay e o Método Lowry. O...

A ultracentrifugação gradiente de densidade é uma técnica comum usada para isolar e purificar biomoléculas e estruturas celulares. Esta técnica explora o fato de que, em suspensão, partículas mais densas do que o solvente irão sedimentar, enquanto aquelas que são menos densas flutuarão. Uma ultracentragem de alta velocidade é usada para acelerar esse processo, a fim de separar biomoléculas dentro de um gradiente de densidade, que pode ser estabelecido por camadas de líquidos de densidade...

Os ensaios de co-imunoprecipitação (CoIP) e pull-down são métodos intimamente relacionados para identificar interações proteína-proteína estáveis. Esses métodos estão relacionados à imunoprecipitação, um método para separar uma proteína alvo ligada a um anticorpo de proteínas não ligadas. No CoIP, uma proteína ligada a anticorpos está ligada a outra proteína que não se liga ao anticorpo, isso é seguido por um processo de separação que preserva o complexo proteína-proteína. A diferença nos...

Reconstituição é o processo de devolução de uma biomolécula isolada à sua forma ou função original. Isso é particularmente útil para estudar proteínas de membrana, que permitem funções celulares importantes e afetam o comportamento de lipídios próximos. Para estudar a função das proteínas de membrana purificadas in situ, elas devem ser reconstituídas integrando-as em uma membrana lipídica artificial. Este vídeo introduz conceitos de reconstituição de proteínas de membrana e procedimentos...

A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um fenômeno usado para investigar interações bioquímicas de perto. Na FRET, uma molécula fotoluminescente do doador pode transferir energia não radiativamente para uma molécula aceitadora se seus respectivos espectros de emissão e absorção se sobreporem. A quantidade de energia transferida — e, consequentemente, a emissão global da amostra — depende da proximidade de um par de moléculas fotoluminescentes aceitadoras e doadoras. A...

A ressonância de plasmon superficial (SPR) é o fenômeno óptico subjacente por trás de biosensores livres de rótulos para avaliar a afinidade molecular, cinética, especificidade e concentração de biomoléculas. Em SPR, interações biomoleculares ocorrem em um biosensor feito de uma fina camada de metal em um prisma. As interações em tempo real das biomoléculas podem ser monitoradas medindo as mudanças de luz refletidas na parte inferior do metal. Este vídeo descreve os conceitos básicos da RSE e...