Eletroforese em Gel Bidimensional
Eletroforese de gel bidimensional (2DGE) é uma técnica que pode resolver milhares de biomoléculas a partir de uma mistura. Esta técnica envolve dois m…
Eletroforese de gel bidimensional (2DGE) é uma técnica que pode resolver milhares de biomoléculas a partir de uma mistura. Esta técnica envolve dois métodos de separação distintos que foram acoplados: foco isoelétrico (IEF) e eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de sódio (SDS-PAGE). Isso separa fisicamente compostos através de dois eixos de um gel por seus pontos isoelétricos (uma propriedade eletroquímica) e seus pesos moleculares.
O procedimento neste vídeo abrange os principais conceitos do 2DGE e um procedimento geral para caracterizar a composição de uma solução proteica complexa. Três exemplos dessa técnica são mostrados na seção de aplicações, incluindo detecção de biomarcadores para iniciação e progresso da doença, monitoramento do tratamento em pacientes e estudo de proteínas após modificação pós-transacional (TEPT).
Iniciar sessão ou para aceder ao conteúdo completo. Saiba mais sobre o acesso da sua instituição ao conteúdo JoVE aqui
A eletroforese em gel bidimensional, ou 2D, é uma técnica que utiliza dois métodos de separação distintos que podem separar milhares de proteínas de uma única mistura. Uma das técnicas, SDS-PAGE ou eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio, não pode separar totalmente misturas complexas sozinhas. A eletroforese em gel 2D acopla o SDS-PAGE a um segundo método, foco isoelétrico ou IEF, que se separa com base em pontos isoelétricos, permitindo a resolução de potencialmente todas as proteínas em um lisado celular. Este vídeo mostrará os princípios da eletroforese em gel 2D, um procedimento geral e algumas de suas aplicações biomédicas.
A eletroforese em gel 2D começa com o IEF como a primeira dimensão. Cada proteína tem um valor de pH, chamado de ponto isoelétrico ou pI, onde a carga líquida é zero. Quando uma proteína é submetida a um campo elétrico, ela se move em direção ao eletrodo com carga oposta. As amostras de interesse são carregadas em tiras de gradiente de pH imobilizado, ou IPG, que possuem anfólitos embutidos, moléculas contendo grupos ácidos e básicos. Um campo elétrico é então aplicado à faixa de gradiente de pH, fazendo com que as proteínas migrem até atingirem o valor de pH correspondente ao seu pI, onde perdem sua carga líquida.
Antes de executar a segunda dimensão, as proteínas incorporadas são tratadas com SDS, desnaturando-as e fornecendo uma carga negativa uniforme. Depois de concluídas, as tiras de IPG são colocadas em um gel de poliacrilamida. Um campo elétrico aplicado atrai as proteínas em direção ao ânodo, com proteínas maiores se movendo mais lentamente através do gel.
Uma vez que a mistura de proteínas tenha sido separada de acordo com o pI e o peso molecular, o mapa do proteoma é visualizado por meio de corantes e as proteínas de interesse são identificadas.
Agora que discutimos os princípios da eletroforese em gel 2D, vamos examinar um procedimento típico de laboratório.
Antes que o experimento possa ser realizado, as proteínas devem ser solubilizadas em meio. A solubilização da amostra é obtida pela desagregação de proteínas com uma combinação de agentes caotrópicos para interromper as interações de ligação de hidrogênio, detergentes não iônicos para evitar a alteração da carga das proteínas, agentes redutores para quebrar ligações dissulfeto e tampões. Para remover proteínas abundantes interferentes e outras moléculas, o material é extraído sequencialmente por centrifugação e coleta do pellet resultante; seguido de tratamento com endonuclease, uma enzima usada para consumir qualquer DNA que interferisse no experimento.
Uma vez que as proteínas tenham sido solubilizadas, as tiras de IPG são preparadas enxaguando com uma solução de limpeza de tiras e deixadas de cabeça para baixo para secar. Cada tira recebe então um número de suporte de tira. Uma vez pronto, o extrato celular é carregado nas tiras em um movimento lento e deslizante da extremidade negativa para a positiva. Para fins de reidratação, papel mata-borrão úmido é colocado em cima do eletrodo e sob as tiras de gel; as tiras IPG são então revestidas no instrumento IEF. Uma alta corrente elétrica é aplicada e as proteínas começam a migrar.
Após a conclusão da primeira dimensão, o gel para SDS-PAGE é preparado em um aparelho de fundição. As tiras IPG são tratadas colocando-as viradas para baixo em um tampão de equilíbrio contendo SDS. A unidade de eletroforese é preparada com a adição de tampão de eletroforese. As tiras de IPG tratadas são coletadas com pinças, colocadas em cima das placas de gel e seladas com solução de vedação de agarose. Uma fonte de voltagem então aplica um campo elétrico, que é mantido até que as proteínas de movimento mais rápido estejam a 1 cm do fundo do gel.
Após a conclusão da eletroforese, as proteínas devem ser visualizadas. Tradicionalmente, isso é realizado por coloração com azul de Coomassie ou nitrato de prata. As proteínas de interesse podem ser transferidas do gel e analisadas por análise de Western blot.
Uma segunda abordagem de identificação envolve a excisão das proteínas do gel, digerindo-as, em seguida, analisando-as por espectrometria de massa.
Agora que revisamos um procedimento, vejamos alguns dos usos da eletroforese em gel 2D.
Um dos usos mais comuns dessa técnica é a identificação de moléculas envolvidas na iniciação e progressão da doença. A eletroforese em gel 2D, juntamente com a espectrometria de massa, pode detectar a regulação positiva ou negativa de proteínas específicas em áreas doentes em comparação com as saudáveis.
Além disso, a eletroforese em gel 2D é útil para acompanhar o progresso da resposta dos pacientes a um potencial medicamento terapêutico. As amostras podem ser colhidas de pacientes em vários momentos após a administração do tratamento. Desta forma, a eletroforese em gel 2D acoplada à análise de Western blot ou espectrometria de massa, pode detectar proteínas associadas a respostas negativas, como inflamação; ou a ausência de proteínas em um estado aliviado.
Outro uso para eletroforese em gel 2D é no estudo da estrutura e função da proteína após modificação pós-traducional, ou PTM, que são adições a proteínas após sua tradução do mRNA. Os PTMs podem regular uma variedade de funções, incluindo sinalização de proteínas, expressão gênica ou causar danos oxidativos. A eletroforese em gel 2D é sensível a modificações como metilação ou acetilação, que podem causar uma mudança no pI, bem como no peso molecular.
Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre eletroforese em gel 2D. Este vídeo descreveu os princípios da técnica, um procedimento experimental típico, e várias de suas aplicações no campo da biomedicina.
Obrigado por assistir!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the two separation methods used in 2D gel electrophoresis?
Two-dimensional gel electrophoresis couples isoelectric focusing (IEF) with SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). IEF separates proteins in the first dimension based on their isoelectric points, where each protein has a specific pH value with zero net charge. SDS-PAGE then separates proteins in the second dimension by molecular weight, allowing resolution of thousands of proteins from a single mixture.
Q2: How does isoelectric focusing separate proteins in the first dimension?
In isoelectric focusing, proteins are loaded onto immobilized pH gradient (IPG) strips containing ampholytes, molecules with both acidic and basic groups. An electric field is applied, causing proteins to migrate until they reach the pH matching their isoelectric point (pI), where their net charge becomes zero and they stop moving. This precise separation by charge allows proteins with different pI values to be resolved.
Q3: Why is sample solubilization necessary before 2D gel electrophoresis?
Sample solubilization de-aggregates proteins using chaotropic agents to disrupt hydrogen bonds, nonionic detergents to preserve protein charge, and reducing agents to break disulfide bonds. This preparation also includes treatment with endonuclease to remove interfering DNA. Proper solubilization ensures proteins are fully dispersed and ready for separation without interference from other cellular components.
Q4: What happens to proteins during the SDS-PAGE second dimension?
After IEF, IPG strips are treated with SDS-containing equilibration buffer, which denatures proteins and provides them with a uniform negative charge. The strips are then placed on polyacrylamide gels, and an electric field draws proteins toward the anode. Larger proteins move more slowly through the gel matrix, allowing separation by molecular weight and creating a two-dimensional separation pattern.
Q5: How are proteins visualized and identified after 2D gel electrophoresis?
After electrophoresis, proteins are visualized using stains such as Coomassie blue or silver nitrate, creating a proteome map. Proteins of interest can then be identified through Western blot analysis or by excision from the gel, digestion, and analysis by tandem mass spectrometry principle instrumentation uses to determine protein identity and modifications.
Q6: What biomedical applications does 2D gel electrophoresis have?
2D gel electrophoresis is used to identify molecules involved in disease initiation and progression by detecting protein up- or down-regulation in diseased versus healthy areas. It also monitors patient response to therapeutic drugs by detecting inflammation-associated proteins or their absence in treated states. Additionally, it studies protein structure and function following posttranslational modifications like methylation or acetylation, which shift isoelectric point and molecular weight.
Q7: Why can't SDS-PAGE alone fully separate complex protein mixtures?
SDS-PAGE separates proteins only by molecular weight, which means proteins of similar size but different charges cannot be distinguished. Many complex mixtures contain numerous proteins with overlapping molecular weights, making complete separation impossible with a single dimension. Coupling SDS-PAGE with isoelectric focusing in 2D gel electrophoresis adds a second separation axis based on charge, enabling resolution of potentially all proteins in a cell lysate.