Eletroforese em Gel Bidimensional

A eletroforese em gel bidimensional, ou 2D, é uma técnica que utiliza dois métodos de separação distintos que podem separar milhares de proteínas de uma única mistura. Uma das técnicas, SDS-PAGE ou eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio, não pode separar totalmente misturas complexas sozinhas. A eletroforese em gel 2D acopla o SDS-PAGE a um segundo método, foco isoelétrico ou IEF, que se separa com base em pontos isoelétricos, permitindo a resolução de potencialmente todas as proteínas em um lisado celular. Este vídeo mostrará os princípios da eletroforese em gel 2D, um procedimento geral e algumas de suas aplicações biomédicas.

A eletroforese em gel 2D começa com o IEF como a primeira dimensão. Cada proteína tem um valor de pH, chamado de ponto isoelétrico ou pI, onde a carga líquida é zero. Quando uma proteína é submetida a um campo elétrico, ela se move em direção ao eletrodo com carga oposta. As amostras de interesse são carregadas em tiras de gradiente de pH imobilizado, ou IPG, que possuem anfólitos embutidos, moléculas contendo grupos ácidos e básicos. Um campo elétrico é então aplicado à faixa de gradiente de pH, fazendo com que as proteínas migrem até atingirem o valor de pH correspondente ao seu pI, onde perdem sua carga líquida.

Antes de executar a segunda dimensão, as proteínas incorporadas são tratadas com SDS, desnaturando-as e fornecendo uma carga negativa uniforme. Depois de concluídas, as tiras de IPG são colocadas em um gel de poliacrilamida. Um campo elétrico aplicado atrai as proteínas em direção ao ânodo, com proteínas maiores se movendo mais lentamente através do gel.

Uma vez que a mistura de proteínas tenha sido separada de acordo com o pI e o peso molecular, o mapa do proteoma é visualizado por meio de corantes e as proteínas de interesse são identificadas.

Agora que discutimos os princípios da eletroforese em gel 2D, vamos examinar um procedimento típico de laboratório.

Antes que o experimento possa ser realizado, as proteínas devem ser solubilizadas em meio. A solubilização da amostra é obtida pela desagregação de proteínas com uma combinação de agentes caotrópicos para interromper as interações de ligação de hidrogênio, detergentes não iônicos para evitar a alteração da carga das proteínas, agentes redutores para quebrar ligações dissulfeto e tampões. Para remover proteínas abundantes interferentes e outras moléculas, o material é extraído sequencialmente por centrifugação e coleta do pellet resultante; seguido de tratamento com endonuclease, uma enzima usada para consumir qualquer DNA que interferisse no experimento.

Uma vez que as proteínas tenham sido solubilizadas, as tiras de IPG são preparadas enxaguando com uma solução de limpeza de tiras e deixadas de cabeça para baixo para secar. Cada tira recebe então um número de suporte de tira. Uma vez pronto, o extrato celular é carregado nas tiras em um movimento lento e deslizante da extremidade negativa para a positiva. Para fins de reidratação, papel mata-borrão úmido é colocado em cima do eletrodo e sob as tiras de gel; as tiras IPG são então revestidas no instrumento IEF. Uma alta corrente elétrica é aplicada e as proteínas começam a migrar.

Após a conclusão da primeira dimensão, o gel para SDS-PAGE é preparado em um aparelho de fundição. As tiras IPG são tratadas colocando-as viradas para baixo em um tampão de equilíbrio contendo SDS. A unidade de eletroforese é preparada com a adição de tampão de eletroforese. As tiras de IPG tratadas são coletadas com pinças, colocadas em cima das placas de gel e seladas com solução de vedação de agarose. Uma fonte de voltagem então aplica um campo elétrico, que é mantido até que as proteínas de movimento mais rápido estejam a 1 cm do fundo do gel.

Após a conclusão da eletroforese, as proteínas devem ser visualizadas. Tradicionalmente, isso é realizado por coloração com azul de Coomassie ou nitrato de prata. As proteínas de interesse podem ser transferidas do gel e analisadas por análise de Western blot.

Uma segunda abordagem de identificação envolve a excisão das proteínas do gel, digerindo-as, em seguida, analisando-as por espectrometria de massa.

Agora que revisamos um procedimento, vejamos alguns dos usos da eletroforese em gel 2D.

Um dos usos mais comuns dessa técnica é a identificação de moléculas envolvidas na iniciação e progressão da doença. A eletroforese em gel 2D, juntamente com a espectrometria de massa, pode detectar a regulação positiva ou negativa de proteínas específicas em áreas doentes em comparação com as saudáveis.

Além disso, a eletroforese em gel 2D é útil para acompanhar o progresso da resposta dos pacientes a um potencial medicamento terapêutico. As amostras podem ser colhidas de pacientes em vários momentos após a administração do tratamento. Desta forma, a eletroforese em gel 2D acoplada à análise de Western blot ou espectrometria de massa, pode detectar proteínas associadas a respostas negativas, como inflamação; ou a ausência de proteínas em um estado aliviado.

Outro uso para eletroforese em gel 2D é no estudo da estrutura e função da proteína após modificação pós-traducional, ou PTM, que são adições a proteínas após sua tradução do mRNA. Os PTMs podem regular uma variedade de funções, incluindo sinalização de proteínas, expressão gênica ou causar danos oxidativos. A eletroforese em gel 2D é sensível a modificações como metilação ou acetilação, que podem causar uma mudança no pI, bem como no peso molecular.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre eletroforese em gel 2D. Este vídeo descreveu os princípios da técnica, um procedimento experimental típico, e várias de suas aplicações no campo da biomedicina.

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