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Medir a concentração é um passo fundamental de muitos ensaios bioquímicos. A determinação da proteína fotométrica aproveita o fato de que quanto mais uma amostra contém substâncias absorventes de luz, menos a luz transmitirá através dela. Como a relação entre concentração e absorção é linear, esse fenômeno pode ser usado para medir a concentração em amostras onde é desconhecido.
Este vídeo descreve o básico da determinação da proteína fotométrica e introduz o Bradford Assay e o Método Lowry. O procedimento no vídeo cobrirá um típico ensaio de Bradford. As aplicações abrangidas incluem a medição direta de volumes muito pequenos de ácidos nucleicos para caracterizar concentração e pureza, determinação da eficiência do acoplamento de um material biomimético, e outra variação da determinação da proteína fotométrica usando corante Remazol.
Determinar a concentração de uma proteína em amostras é um passo fundamental em muitos ensaios bioquímicos. A determinação fotométrica pode ser feita com pequenos tamanhos de amostra. Quanto mais uma amostra contém substâncias absorventes de luz, menos a luz transmitirá através dela. Isso fornece uma medição quantitativa das substâncias absorventes. Esses conceitos são tão fundamentais para a ciência que os artigos que introduziram duas das técnicas estão nos três trabalhos mais citados de todos os tempos. Este vídeo mostrará os conceitos por trás de algumas das técnicas mais comuns de determinação de proteínas fotométricas, como são realizadas e como os dados coletados são analisados.
A determinação da proteína fotométrica baseia-se na relação entre concentração e absorção de luz. Esta é conhecida como a Lei Beer-Lambert, que afirma que a concentração de uma espécie absorvente de luz é proporcional à sua absorção.
Este princípio está por trás de todos os métodos de determinação de proteína fotométrica.
Para análise direta de absorção, os valores de absorção de amostras de proteínas não residenciais são medidos. Por causa de suas cadeias laterais aromáticas, resíduos de triptofano e tyrosina dão as leituras de maior absorvência a um comprimento de onda de 280 nm.
No entanto, esses aminoácidos - que são dois dos menos frequentemente encontrados em proteínas - estão presentes em diferentes quantidades em cada proteína, de modo que cada determinação é única. Para superar essa limitação, foram desenvolvidos ensaios mais complexos - que não dependem desses aminoácidos.
Um exemplo é o Ensaio de Bradford, onde o corante colorido é adicionado à amostra. O corante, conhecido como Coomassie Blue, responde proporcionalmente quanto mais proteína presente, mais eventos vinculativos com o corante.
Em seguida, a concentração proteica é determinada medindo a absorvância do corante Coomassie Blue, que absorve a luz a 594 nm. No entanto, o ensaio de Bradford é linear sobre uma pequena gama de concentrações, por isso as diluições são frequentemente necessárias antes da análise.
O Método Lowry combina o reagente Biuret, uma solução alcalina de íons de cobre que reagem com ligações de peptídeos, e o reagente Folin-Ciocâlteu, que oxida resíduos de proteína aromática. A mudança de cor resultante da amostra é proporcional à concentração proteica.
A absorção do reagente Folin reduzido pode ser determinada em 750 nm. Como a absorção direta, cada proteína tem uma resposta única, e deve ser calibrada para a proteína de interesse. Agora que revisamos os princípios básicos por trás de alguns dos ensaios mais comuns, vamos ver como a absorção direta e o ensaio de Bradford são realizados.
Para iniciar uma análise direta de absorção, o espectotômetro é calibrado com um branco para determinar a absorção zero. As soluções padrão são preparadas para uso na criação da curva de calibração. Em seguida, uma alíquota do primeiro padrão é adicionada a um cuvette e colocada no espectrômetro.
O valor de absorção em 280 nm é então registrado. Este processo é repetido para cada padrão, usando uma cuvette limpa para cada execução. Uma vez concluída, uma curva de calibração é criada plotando a absorvência versus concentração. A inclinação desta linha é o coeficiente molar atenuante, que relaciona a absorção à concentração.
Em seguida, a amostra desconhecida é adicionada a um cuvette, e o valor de absorção é registrado. Como a análise de dados para os diferentes métodos de determinação fotométrica é semelhante, vamos cobrir isso depois de olharmos para o ensaio de Bradford.
Aqui, o ensaio de proteína de Bradford é realizado com um padrão BSA em uma placa de 96 poços. Para começar, as soluções de estoque da BSA estão preparadas.
As soluções desconhecidas são diluídas com água deionizada para garantir que as concentrações estejam dentro do alcance do ensaio. Dependendo do kit, o corante Coomassie também pode exigir diluição. Em seguida, a curva de calibração é configurada adicionando os padrões BSA à placa de 96 poços.
A água desionizada é adicionada para atingir a concentração necessária para gerar uma curva padrão. A amostra desconhecida deve ser adicionada à placa em triplicados para garantir que uma medição precisa seja tomada. Corante coomassie é adicionado a cada poço, misturando-se com a pipeta.
A água desionizada é adicionada a um vazio, bem como um branco, para medir a absorvência. Depois de esperar 5 min para o corante se ligar, a absorvância é medida em um leitor de placas a 590 nm.
Agora que fizemos alguns ensaios, vamos ver como analisar os dados. Cada método de determinação de proteína fotométrica é baseado na Lei Beer-Lambert.
A absorvância medida dos padrões é usada para criar uma curva de calibração, que é então usada para determinar a concentração de amostras desconhecidas. Esta curva pode ser plotada manualmente, embora ferramentas espectrofotométricas mais novas criem a curva de calibração uma vez que todos os padrões tenham sido medidos. Esses sistemas também calcularão a concentração de proteínas à medida que amostras desconhecidas forem analisadas.
Agora que revisamos como analisar dados de determinação de proteína fotométrica, vamos ver algumas das maneiras como esses procedimentos são utilizados.
Os princípios da determinação da proteína fotométrica também podem ser usados para medir diretamente a concentração de ácido nucleico. O espectrofotômetro de nanodrop aceita amostras de volume muito pequeno em um pedestal opticamente ativo. A absorção é então medida, e o sistema determina automaticamente a concentração de ácido nucleico. Como as proteínas e outras fontes podem interferir nas medições, a pureza amostral é determinada analisando as razões de absorção de 260 a 280 nm e 260 a 230 nm. Ácidos nucleicos puros normalmente produzem proporções de aproximadamente 1,8 e aproximadamente 2,0 para DNA e RNA, respectivamente.
A determinação da proteína fotométrica também pode ser usada na produção de materiais biomiméticos, que são inspirados da natureza para obter respostas celulares específicas. Os adesivos recombinantes são ligados a contas de poliestireno para simular o apego bacteriano às células hospedeiras. O ensaio de Bradford é usado para determinar a eficiência de acoplamento da adesão recombinante às contas na produção do material biomimético.
Os ensaios alternativos de proteína fotométrica podem ser usados na detecção e caracterização de antimicrobianos proteicos. Remazol brilhante corante R azul é covalentemente ligado a bactérias mortas pelo calor. O antimicrobiano proteico é incubado na solução tingida. Em seguida, a amostra é centrifugada, e a absorção do supernante a 595 nm é medida usando um espectrofotômetro microplatográfico. O aumento da absorvência, pelo corante solúvel liberado no sobrenasal das bactérias rotuladas, é uma medida quantitativa da atividade enzimática.
Você acabou de assistir o vídeo do JoVE sobre determinação de proteína fotométrica. Este vídeo descreveu os princípios subjacentes da determinação fotométrica, passou por cima de procedimentos gerais para alguns ensaios comuns, e cobriu alguns novos avanços nas técnicas. Obrigado por assistir!
Medir a concentração é um passo fundamental de muitos ensaios bioquímicos. A determinação da proteína fotométrica aproveita o fato de que quanto mais uma amostra contém substâncias absorventes de luz, menos a luz transmitirá através dela. Como a relação entre concentração e absorção é linear, esse fenômeno pode ser usado para medir a concentração em amostras onde é desconhecido.
Este vídeo descreve o básico da determinação da proteína fotométrica e introduz o Bradford Assay e o Método Lowry. O procedimento no vídeo cobrirá um típico ensaio de Bradford. As aplicações abrangidas incluem a medição direta de volumes muito pequenos de ácidos nucleicos para caracterizar concentração e pureza, determinação da eficiência do acoplamento de um material biomimético, e outra variação da determinação da proteína fotométrica usando corante Remazol.
Determinar a concentração de uma proteína em amostras é um passo fundamental em muitos ensaios bioquímicos. A determinação fotométrica pode ser feita com pequenos tamanhos de amostra. Quanto mais uma amostra contém substâncias absorventes de luz, menos a luz transmitirá através dela. Isso fornece uma medição quantitativa das substâncias absorventes. Esses conceitos são tão fundamentais para a ciência que os artigos que introduziram duas das técnicas estão nos três trabalhos mais citados de todos os tempos. Este vídeo mostrará os conceitos por trás de algumas das técnicas mais comuns de determinação de proteínas fotométricas, como são realizadas e como os dados coletados são analisados.
A determinação da proteína fotométrica baseia-se na relação entre concentração e absorção de luz. Esta é conhecida como a Lei Beer-Lambert, que afirma que a concentração de uma espécie absorvente de luz é proporcional à sua absorção.
Este princípio está por trás de todos os métodos de determinação de proteína fotométrica.
Para análise direta de absorção, os valores de absorção de amostras de proteínas não residenciais são medidos. Por causa de suas cadeias laterais aromáticas, resíduos de triptofano e tyrosina dão as leituras de maior absorvência a um comprimento de onda de 280 nm.
No entanto, esses aminoácidos - que são dois dos menos frequentemente encontrados em proteínas - estão presentes em diferentes quantidades em cada proteína, de modo que cada determinação é única. Para superar essa limitação, foram desenvolvidos ensaios mais complexos - que não dependem desses aminoácidos.
Um exemplo é o Ensaio de Bradford, onde o corante colorido é adicionado à amostra. O corante, conhecido como Coomassie Blue, responde proporcionalmente quanto mais proteína presente, mais eventos vinculativos com o corante.
Em seguida, a concentração proteica é determinada medindo a absorvância do corante Coomassie Blue, que absorve a luz a 594 nm. No entanto, o ensaio de Bradford é linear sobre uma pequena gama de concentrações, por isso as diluições são frequentemente necessárias antes da análise.
O Método Lowry combina o reagente Biuret, uma solução alcalina de íons de cobre que reagem com ligações de peptídeos, e o reagente Folin-Ciocâlteu, que oxida resíduos de proteína aromática. A mudança de cor resultante da amostra é proporcional à concentração proteica.
A absorção do reagente Folin reduzido pode ser determinada em 750 nm. Como a absorção direta, cada proteína tem uma resposta única, e deve ser calibrada para a proteína de interesse. Agora que revisamos os princípios básicos por trás de alguns dos ensaios mais comuns, vamos ver como a absorção direta e o ensaio de Bradford são realizados.
Para iniciar uma análise direta de absorção, o espectotômetro é calibrado com um branco para determinar a absorção zero. As soluções padrão são preparadas para uso na criação da curva de calibração. Em seguida, uma alíquota do primeiro padrão é adicionada a um cuvette e colocada no espectrômetro.
O valor de absorção em 280 nm é então registrado. Este processo é repetido para cada padrão, usando uma cuvette limpa para cada execução. Uma vez concluída, uma curva de calibração é criada plotando a absorvência versus concentração. A inclinação desta linha é o coeficiente molar atenuante, que relaciona a absorção à concentração.
Em seguida, a amostra desconhecida é adicionada a um cuvette, e o valor de absorção é registrado. Como a análise de dados para os diferentes métodos de determinação fotométrica é semelhante, vamos cobrir isso depois de olharmos para o ensaio de Bradford.
Aqui, o ensaio de proteína de Bradford é realizado com um padrão BSA em uma placa de 96 poços. Para começar, as soluções de estoque da BSA estão preparadas.
As soluções desconhecidas são diluídas com água deionizada para garantir que as concentrações estejam dentro do alcance do ensaio. Dependendo do kit, o corante Coomassie também pode exigir diluição. Em seguida, a curva de calibração é configurada adicionando os padrões BSA à placa de 96 poços.
A água desionizada é adicionada para atingir a concentração necessária para gerar uma curva padrão. A amostra desconhecida deve ser adicionada à placa em triplicados para garantir que uma medição precisa seja tomada. Corante coomassie é adicionado a cada poço, misturando-se com a pipeta.
A água desionizada é adicionada a um vazio, bem como um branco, para medir a absorvência. Depois de esperar 5 min para o corante se ligar, a absorvância é medida em um leitor de placas a 590 nm.
Agora que fizemos alguns ensaios, vamos ver como analisar os dados. Cada método de determinação de proteína fotométrica é baseado na Lei Beer-Lambert.
A absorvância medida dos padrões é usada para criar uma curva de calibração, que é então usada para determinar a concentração de amostras desconhecidas. Esta curva pode ser plotada manualmente, embora ferramentas espectrofotométricas mais novas criem a curva de calibração uma vez que todos os padrões tenham sido medidos. Esses sistemas também calcularão a concentração de proteínas à medida que amostras desconhecidas forem analisadas.
Agora que revisamos como analisar dados de determinação de proteína fotométrica, vamos ver algumas das maneiras como esses procedimentos são utilizados.
Os princípios da determinação da proteína fotométrica também podem ser usados para medir diretamente a concentração de ácido nucleico. O espectrofotômetro de nanodrop aceita amostras de volume muito pequeno em um pedestal opticamente ativo. A absorção é então medida, e o sistema determina automaticamente a concentração de ácido nucleico. Como as proteínas e outras fontes podem interferir nas medições, a pureza amostral é determinada analisando as razões de absorção de 260 a 280 nm e 260 a 230 nm. Ácidos nucleicos puros normalmente produzem proporções de aproximadamente 1,8 e aproximadamente 2,0 para DNA e RNA, respectivamente.
A determinação da proteína fotométrica também pode ser usada na produção de materiais biomiméticos, que são inspirados da natureza para obter respostas celulares específicas. Os adesivos recombinantes são ligados a contas de poliestireno para simular o apego bacteriano às células hospedeiras. O ensaio de Bradford é usado para determinar a eficiência de acoplamento da adesão recombinante às contas na produção do material biomimético.
Os ensaios alternativos de proteína fotométrica podem ser usados na detecção e caracterização de antimicrobianos proteicos. Remazol brilhante corante R azul é covalentemente ligado a bactérias mortas pelo calor. O antimicrobiano proteico é incubado na solução tingida. Em seguida, a amostra é centrifugada, e a absorção do supernante a 595 nm é medida usando um espectrofotômetro microplatográfico. O aumento da absorvência, pelo corante solúvel liberado no sobrenasal das bactérias rotuladas, é uma medida quantitativa da atividade enzimática.
Você acabou de assistir o vídeo do JoVE sobre determinação de proteína fotométrica. Este vídeo descreveu os princípios subjacentes da determinação fotométrica, passou por cima de procedimentos gerais para alguns ensaios comuns, e cobriu alguns novos avanços nas técnicas. Obrigado por assistir!
Determinar a concentração de uma proteína em amostras é uma etapa fundamental em muitos ensaios bioquímicos. A determinação fotométrica pode ser feita com amostras pequenas. Quanto mais uma amostra contiver substâncias absorventes de luz, menos a luz será transmitida através dela. Isso fornece uma medição quantitativa das substâncias absorventes. Esses conceitos são tão fundamentais para a ciência que os artigos que introduziram duas das técnicas estão nos três artigos mais citados de todos os tempos. Este vídeo mostrará os conceitos por trás de algumas das técnicas de determinação fotométrica de proteínas mais comuns, como elas são realizadas e como os dados coletados são analisados.
A determinação fotométrica de proteínas é baseada na relação entre concentração e absorção de luz. Isso é conhecido como Lei de Beer-Lambert, que afirma que a concentração de uma espécie absorvente de luz é proporcional à sua absorbância.
Este princípio está subjacente a todos os métodos fotométricos de determinação de proteínas.
Para análise de absorção direta, os valores de absorbância de amostras de proteínas inalteradas são medidos. Devido às suas cadeias laterais aromáticas, os resíduos de triptofano e tirosina fornecem as leituras de absorbância mais altas em um comprimento de onda de 280 nm.
No entanto, esses aminoácidos - que são dois dos menos encontrados nas proteínas - estão presentes em quantidades diferentes em cada proteína, portanto, cada determinação é única. Para superar essa limitação, ensaios mais complexos - que não dependem desses aminoácidos - foram desenvolvidos.
Um exemplo é o Ensaio de Bradford, onde corante colorido é adicionado à amostra. O corante, conhecido como Coomassie Blue, responde proporcionalmente - quanto mais proteína presente, mais eventos de ligação com o corante.
Em seguida, a concentração de proteína é determinada medindo a absorbância do corante Coomassie Blue ligado, que absorve luz a 594 nm. No entanto, o ensaio de Bradford é linear em uma faixa curta de concentrações, portanto, as diluições são frequentemente necessárias antes da análise.
O Método Lowry combina o reagente Biureto, uma solução alcalina de íons de cobre que reagem com ligações peptídicas, e o reagente Folin-Cioc?lteu, que oxida resíduos de proteínas aromáticas. A mudança de cor resultante da amostra é proporcional à concentração de proteína.
A absorvância do reagente de Folin reduzido pode ser determinada a 750 nm. Assim como a absorção direta, cada proteína tem uma resposta única e deve ser calibrada para a proteína de interesse. Agora que revisamos os princípios básicos por trás de alguns dos ensaios mais comuns, vamos ver como a absorção direta e o ensaio de Bradford são realizados.
Para iniciar uma análise de absorção direta, o espectrofotômetro é calibrado com um branco para determinar a absorbância zero. As soluções padrão são preparadas para uso na criação da curva de calibração. Em seguida, uma alíquota do primeiro padrão é adicionada a uma cubeta e colocada no espectrofotômetro.
O valor de absorbância a 280 nm é então registrado. Este processo é repetido para cada padrão, usando uma cubeta limpa para cada corrida. Uma vez concluída, uma curva de calibração é criada plotando a absorbância versus concentração. A inclinação desta linha é o coeficiente de atenuação molar, que relaciona a absorbância com a concentração.
Em seguida, a amostra desconhecida é adicionada a uma cubeta e o valor de absorbância é registrado. Como a análise de dados para os diferentes métodos de determinação fotométrica é semelhante, abordaremos isso depois de examinarmos o ensaio de Bradford.
Aqui, o ensaio de proteína de Bradford é realizado com um padrão BSA em uma placa de 96 poços. Para começar, as soluções de estoque da BSA são preparadas.
As soluções desconhecidas são diluídas com água deionizada para garantir que as concentrações estejam dentro da faixa do ensaio. Dependendo do kit, o corante Coomassie também pode exigir diluição. Em seguida, a curva de calibração é configurada adicionando os padrões BSA à placa de 96 poços.
A água deionizada é adicionada para atingir a concentração necessária para gerar uma curva padrão. A amostra desconhecida deve ser adicionada à placa em triplicados para garantir uma medição precisa. O corante Coomassie é adicionado a cada poço, misturando com a pipeta.
A água deionizada é adicionada a um poço vazio como um branco, para medir a absorbância. Depois de esperar 5 minutos para que o corante se ligue, a absorbância é medida em um leitor de placas a 590 nm.
Agora que realizamos alguns ensaios, vamos ver como analisar os dados. Cada método fotométrico de determinação de proteínas é baseado na Lei de Beer-Lambert.
A absorbância medida dos padrões é usada para criar uma curva de calibração, que é então usada para determinar a concentração de amostras desconhecidas. Essa curva pode ser plotada manualmente, embora as ferramentas espectrofotométricas mais recentes criem a curva de calibração assim que todos os padrões forem medidos. Esses sistemas também calcularão a concentração de proteínas à medida que amostras desconhecidas forem analisadas.
Agora que revisamos como analisar dados fotométricos de determinação de proteínas, vejamos algumas das maneiras pelas quais esses procedimentos são utilizados.
Os princípios da determinação fotométrica de proteínas também podem ser usados para medir diretamente a concentração de ácidos nucleicos. O espectrofotômetro nanodrop aceita amostras de volume muito pequeno em um pedestal opticamente ativo. A absorbância é então medida e o sistema determina automaticamente a concentração de ácido nucleico. Como as proteínas e outras fontes podem interferir nas medições, a pureza da amostra é determinada pela análise das taxas de absorbância de 260 a 280 nm e 260 a 230 nm. Os ácidos nucléicos puros normalmente produzem proporções de aproximadamente 1,8 e aproximadamente 2,0 para DNA e RNA, respectivamente.
A determinação fotométrica de proteínas também pode ser usada na produção de materiais biomiméticos, que são inspirados na natureza para provocar respostas celulares específicas. As adesinas recombinantes são ligadas a grânulos de poliestireno para simular a ligação bacteriana às células hospedeiras. O ensaio de Bradford é usado para determinar a eficiência de acoplamento da adesão recombinante aos grânulos na produção do material biomimético.
Ensaios fotométricos alternativos de proteínas podem ser usados na detecção e caracterização de antimicrobianos proteicos. O corante R azul brilhante Remazol é covalentemente ligado a bactérias mortas pelo calor. A proteína antimicrobiana é incubada na solução tingida. Em seguida, a amostra é centrifugada e a absorvância do sobrenadante a 595 nm é medida usando um espectrofotômetro de microplacas. O aumento da absorbância, pelo corante solúvel liberado no sobrenadante pelas bactérias marcadas, é uma medida quantitativa da atividade enzimática.
Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre determinação fotométrica de proteínas. Este vídeo descreveu os princípios subjacentes da determinação fotométrica, abordou os procedimentos gerais para alguns ensaios comuns e cobriu alguns novos avanços nas técnicas. Obrigado por assistir!
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