Cristalização de proteínas

A cristalização de proteínas é o processo de obtenção de uma forma sólida treliçada de uma proteína. Esses cristais são especialmente valiosos para os biólogos estruturais, auxiliando no estudo da função das proteínas. Outras técnicas, como espectrometria de massa ou SDS-PAGE, só podem fornecer informações sobre a estrutura unidimensional das proteínas. A cristalização de proteínas é complementada pelas técnicas de expressão de proteínas recombinantes e difração de raios-x. Este vídeo mostrará os princípios da cristalização de proteínas, um procedimento laboratorial geral e várias de suas aplicações no campo bioquímico.

A primeira etapa necessária no processo é obter quantidades de miligramas de proteína muito pura, normalmente usando a expressão de proteínas recombinantes. O gene correspondente à proteína de interesse é clonado em um vetor de expressão, e a proteína expressa é fundida a uma etiqueta de afinidade, como a poli-histidina, para auxiliar na purificação por cromatografia de afinidade. Para saber mais, veja o vídeo desta coleção sobre cromatografia de afinidade.

A formação da proteína purificada em cristais depende da combinação adequada de muitos fatores, incluindo pH, força iônica, concentrações de precipitante e proteína, temperatura e taxa de equilíbrio. O método mais comum usado é a difusão de vapor, da qual existem duas categorias: gota suspensa e gota sentada. Uma gotícula contendo proteína pura, tampão e precipitante, que é um sólido iônico que se liga às moléculas de água, reduzindo a disponibilidade de água para a proteína e imitando uma maior concentração de proteína, está em um micropoço fechado com um reservatório com uma mistura mais altamente concentrada do mesmo tampão e precipitante. No início, as concentrações de proteína e precipitante são muito baixas para causar cristalização. Durante o curso do experimento, a água vaporiza da gotícula e se acumula no reservatório; Uma diminuição na quantidade de água na gotícula faz com que o sistema fique supersaturado e pode ocorrer nucleação, seguida de cristalização. A transferência líquida de água da gota está em equilíbrio e o sistema é mantido até que o processo seja concluído.

Para visualizar a estrutura 3D, a difração de raios-x é usada. Para obter dados de raios-x de um cristal, ele é colocado em um feixe de raios-x monocromático, onde é exposto ao feixe em todos os ângulos. Cada exposição fornece uma imagem, onde cada ponto é um raio-x difratado, que emerge do cristal e é registrado por um detector. Os dados são combinados para produzir um modelo do arranjo dos átomos dentro do cristal. A estrutura cristalina resultante demonstra a colocação tridimensional dos átomos, com uma resolução típica de 2 angstroms.

Agora que abordamos os princípios da cristalização de proteínas, vejamos um protocolo generalizado.

Para iniciar o procedimento, um vetor de expressão contendo o gene de interesse é transformado em células. As células são incubadas e, na fase intermediária, a expressão é iniciada pela adição de um indutor, como o IPTG, que desencadeia a transcrição do mRNA do gene. Após a expressão da proteína, o material bruto é suspenso em tampão de lise e, em seguida, clarificado por centrifugação.

O lisado clarificado é então carregado em uma coluna de níquel, e a proteína marcada com poli-histidina se liga à coluna enquanto todas as outras biomoléculas são lavadas.

Uma vez obtidos vários miligramas de proteína pura, ela está pronta para cristalização por difusão de vapor. Uma bandeja suspensa de 24 poços é preenchida com concentrações variadas de soluções tampão de cloreto de sódio e acetato de sódio. Para o método de gota sentada, volumes iguais de proteína e solução de reservatório são pipetados na prateleira acima de cada poço e, em seguida, a bandeja é coberta com fita transparente. A bandeja é então colocada em uma câmara de incubação e os poços são monitorados quanto ao crescimento no dia seguinte e, em seguida, a cada poucos dias.

Uma vez obtido um cristal adequado, ele está pronto para a análise de difração de raios-x. O cristal é montado em um goniômetro para posicionar o cristal em orientações selecionadas. O cristal é iluminado com um feixe monocromático de raios-x em todos os ângulos, produzindo um padrão de difração. O software converte as imagens bidimensionais, tiradas em diferentes orientações, em um modelo tridimensional da densidade dos elétrons dentro do cristal, determinando as posições dos átomos no cristal.

Agora que revisamos um procedimento, vamos revisar algumas aplicações úteis da cristalização de proteínas e outra técnica de cristalização.

A cristalização de proteínas pode ser usada para o design de medicamentos in silico. A estrutura tridimensional da proteína básica 2 da polimerase do vírus Influenza, que tem sido associada à infecção viral em mamíferos, foi determinada por cristalização e difração de raios-x. Os potenciais locais de ligação na proteína são visualizados e, com o uso de um programa de encaixe, foi projetada uma molécula tridimensional que se inseriria em uma fenda na proteína.

A cocristalização de complexos proteína-DNA também é uma técnica útil. As proteínas de ligação ao DNA modulam uma ampla variedade de funções biológicas, como transcrição e polimerização do DNA e reparo do DNA; e as estruturas cristalinas desses complexos podem fornecer informações sobre a função da proteína, o mecanismo e a natureza da interação específica. A proteína SeqA de E. coli, um regulador negativo da replicação do DNA, foi co-cristalizada com DNA hemimetilado.

Proteínas integrais de membrana, como receptores acoplados à proteína G, ou GCPRs, são difíceis de cristalizar devido à sua quantidade limitada de área de superfície polar disponível para formar contatos de rede cristalina, o que levou ao desenvolvimento da cristalização de proteínas assistida por proteína de fusão. Genes que codificam o receptor adrenérgico ?2, um GCPR e uma lisozima foram inseridos em um vetor de expressão. A cristalização da proteína de fusão ?2AR- lisozima foi alcançada devido ao aumento da superfície hidrofílica extracelular sobre o ?2AR naturalmente hidrofóbico, fornecido pela lisozima, necessário para formar interações de empacotamento na rede cristalina.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre cristalização de proteínas. Este vídeo descreveu seus princípios, um protocolo generalizado e alguns de seus usos no campo biomédico. Obrigado por assistir!