Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

O objetivo geral deste procedimento é estudar a dinâmica de sistemas proteicos complexos de forma quantitativa com foco em interações correlacionadas, como a cooperatividade. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia quantitativa, onde os complexos de proteínas e suas interações dinâmicas são de importância central. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que o FRET dinâmico multicolorido de molécula única seja aplicado a sistemas biologicamente relevantes.

Antes de montar a câmara de fluxo, corte um canal de fluxo em um filme adesivo transparente de 40 mícrons de espessura, borrife adesivo de fixação rápida no lado não adesivo do filme e deixe o adesivo secar. Para iniciar a montagem da câmara de fluxo, obtenha uma lâmina de quartzo fundido funcionalizada PEG de biotina PEG de três milímetros de espessura com orifícios de entrada e saída. Aplique o lado revestido com adesivo em spray do filme de teto no lado funcionalizado da corrediça, alinhando o canal com os ganchos de entrada e saída.

Aqueça a lâmina a 80 graus Celsius em uma placa quente por um minuto. Pressione o filme na lâmina por 30 segundos usando uma lâmina de microscópio extra para distribuir a pressão uniformemente. Em seguida, deixe o conjunto esfriar por um minuto.

Retire a folha protetora que cobre o adesivo. Coloque uma lamínula no adesivo exposto para formar a câmara de fluxo. Aqueça a câmara a 80 graus Celsius por um minuto.

Pressione a lama de cobertura no adesivo por 30 segundos para selar a câmara e permitir que a câmara montada esfrie. Aplique uma gota de glicerol na face do prisma antes de colocar a câmara de fluxo sobre o prisma. Monte a câmara de fluxo em um suporte para um microscópio TIRF do tipo prisma multicolorido.

Conecte a tubulação de entrada e saída quando terminar. Para começar a configurar o instrumento para a medição de três cores, abra o software da câmera CCD de multiplicação de elétrons, defina o sensor EMCCD para a temperatura mais baixa possível. Defina a velocidade de deslocamento vertical da câmera para 3.3 microssegundos, escolha a tensão normal do clock vertical, defina a taxa de leitura horizontal para 17 Milihertz a 16 bits, o ganho de pré-amplificação para três e o nível de ganho do multiplicador de elétrons para 1000.

Escolha o acionamento de aquisição externa. Defina o tempo de exposição para 70 milissegundos. E a duração da gravação do filme para 750 ciclos de aquisição.

Crie uma nova pasta para os arquivos de medição. Ative o salvamento automático no software EMCCD e defina o formato de arquivo de quadro de filme como TIFF. Defina o caminho do arquivo de salvamento automático para a pasta recém-criada.

Em seguida, abra o software que controla o filtro sintonizável acústico-óptico, o software de controle do laser e o software de disparo sincronizando os lasers, o AOTF, os obturadores ópticos e as câmeras. Use o AOTF para ajustar a potência do laser para cerca de três miliwatts antes de entrar no prisma. Carregue o padrão de disparo que sincroniza todos os dispositivos para a excitação alternada do laser e, em seguida, monte o sample suporte no instrumento.

Coloque a extremidade do tubo de entrada em um tubo de microcentrífuga contendo o tampão do experimento. Conecte a tubulação de saída a uma bomba de seringa configurada para o modo de retirada. Lave a câmara com 150 microlitros de tampão.

Foque a câmera CCD na interface funcionalizada, alinhe os feixes de excitação e alvejar os contaminantes fluorescentes. Em seguida, flua 300 microlitros de uma solução de 0,25 miligrama por mililitro de avidina desglicosilada e tampão para a câmara e incube por um minuto. Lavar a avidina desglicosilada não ligada da câmara com tampão.

Em seguida, flua 300 microlitros de tampão com uma concentração de BSA de 0,5 miligramas por mililitro através da câmara para bloquear defeitos de funcionalização da superfície. Em seguida, carregue a câmara de fluxo com porções de 150 microlitros de Hsp90 biotinilado marcado com fluorescência em tampão contendo BSA em concentrações crescentes de Hsp90 até que a densidade superficial suficiente seja alcançada. Lave a proteína não ligada da câmara com 300 microlitros de tampão contendo BSA.

Carregue 150 microlitros de uma solução de 25 nanomolares de AMP-PMP e BSA marcados contendo tampão na câmara e incube por cinco minutos. Repita o carregamento e a incubação uma vez. Em seguida, use um passo Piezo para mover a câmara de amostra perpendicularmente ao feixe de excitação para alterar o campo de visão conforme desejado.

Ajuste o foco da imagem, se necessário. Inicie as gravações da câmera no software da câmera clicando no botão de sinal de tomada, conforme mostrado. Inicie os ciclos de aquisição de excitação no software de disparo para iniciar a aquisição de dados.

Para iniciar a análise de dados, abra o software de análise e importe os filmes gravados das duas câmeras. Clique em localizar traços para determinar os traços de intensidade de fluorescência correspondentes a moléculas únicas potenciais. Para cada molécula, calcule a soma de todos os traços desse ponto com a mesma cor de excitação.

Avalie os perfis de intensidade em todos os canais para um platô aproximadamente plano na intensidade bruta da junta e uma única etapa de branqueamento para todas as cores de excitação. Procure comportamento anticorrelacionado nos canais de detecção apropriados e a ocorrência de fluorescência vermelha no traço. Se todos os critérios forem atendidos, guarde os traços de fluorescência para análise posterior.

Apenas a molécula indicada atende aos critérios deste exemplo. Exclua traços que não tenham platôs planos, que mostrem eventos piscando em vez de anticorrelação ou que tenham várias etapas de branqueamento. A seleção de traços é uma etapa crítica em todas as técnicas de molécula única.

Somente rastreamentos que atendam a critérios bem definidos devem ser selecionados. Aqui, esses critérios são anti-correlação, etapas únicas de branqueamento e platôs planos. Em seguida, exiba as moléculas salvas uma após a outra e um conjunto de traços de intensidade selecione um intervalo de tempo no qual todos os quatro andares já estão branqueados.

Calcule a intensidade de fundo do feixe para este intervalo de tempo e, em seguida, selecione a faixa de eficiência FRET na qual ambos os corantes em Hsp90 estão presentes, certificando-se de excluir traços com eventos intermitentes. Calcule os traços de fluorescência parcial. Exclua moléculas com uma baixa relação sinal-ruído nos traços.

Em seguida, gere projeções 2D de ligação dos dados de fluorescência parcial e inicie a ferramenta de cálculo da população relativa. Clique em Iniciar. Desenhe um polígono ao redor do pico de interesse.

E clique em contagem para calcular a população relativa para esse pico. Gere um histograma 3D dos dados de fluorescência parcial e normalize o histograma. Exceda os parâmetros iniciais para um ajuste gaussiano 3D e adicione as populações de estado ao final do vetor de parâmetro.

Ajuste os dados e exiba os resultados. Depois de definir a posição e a largura de cada estado no espaço fluorescente parcial 3D, inicialize a interface do Modelo de Markov Oculto. Selecione o número apropriado de estados, o número de dimensões do sinal de entrada e o tipo de entrada.

Otimize os parâmetros HMM para determinar os estimadores de máxima verossimilhança para as probabilidades de transição. Repita a seleção de população, o ajuste e a otimização de HMM para subconjuntos de dados. Por fim, calcule o intervalo de confiança para as probabilidades de transição e recolha os estados conformacionais para simplificar os dados para análise posterior.

Os estados conformacionais da proteína Hsp90 foram estudados com FRET de molécula única de três cores na presença do nucleotídeo repórter marcado AMP-PMP. Cinco estados conformacionais foram distinguíveis por intensidades de fluorescência, com quatro desses estados sendo funcionalmente distintos. O FRET de molécula única de três cores resultou nos dados de fluorescência parcial abrangendo um espaço 3D.

As projeções 2D foram usadas para ajudar a separar os estados, pois todos os estados teoricamente esperados nas condições do experimento são distinguíveis por sua florescência parcial nas projeções 2D. As populações relativas desses estados foram determinadas a partir das projeções 2D e foram usadas como restrições para ajustes gaussianos 3D. A otimização e modelagem subsequentes do conjunto 3D HMM forneceram as probabilidades de transição de estado extraídas.

Intervalos de confiança foram calculados para cada constante de taxa extraída. Repetindo os experimentos na presença de 250 micromolares adicionais AMP-PMP não marcados, elucidou a influência da ligação de um nucleotídeo no segundo sítio de ligação no dímero Hsp90. O recolhimento das conformações ligadas e não ligadas permitiu o cálculo do tempo médio de permanência para a dissociação fluorescente de AMP-PMP de Hsp90 na presença e ausência de AMP-PMP adicional não marcado.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair informações cinéticas de um sistema dinâmico de proteínas usando FRET multicolorido e um microscópio TIRF. Essa técnica abre caminho para pesquisadores em ciências da vida determinarem interações correlacionadas em sistemas multiproteicos. Isso é importante para uma compreensão mais profunda dos mecanismos regulatórios fundamentais, como a cooperatividade.