Espectrometria de Massa em Tandem

A espectrometria de massa em tandem une vários estágios da espectrometria de massa para primeiro isolar uma biomolécula e, em seguida, determinar aspectos de sua composição química. As biomoléculas têm estruturas grandes e complexas, dificultando a determinação de sua composição molecular. A espectrometria de massas em tandem seleciona uma molécula de interesse que é posteriormente fragmentada em múltiplas subunidades, o que pode ajudar a elucidar sua identificação e sequência. Este vídeo mostrará os conceitos de espectrometria de massa em tandem, um procedimento geral e alguns de seus usos em bioquímica.

A espectrometria de massa em tandem começa como um instrumento típico de espectrometria de massa: com uma fonte de íons, que converte a amostra em íons, e um analisador de massa, que separa os íons com base em sua relação massa-carga. Um analisador de massa comum, o quadrupolo, só permite a passagem de íons com uma proporção específica, enquanto os outros colidem com as hastes do aparelho. A espécie permitida, chamada de íon precursor, é a biomolécula de interesse. O íon se move para uma célula de colisão, normalmente outro quadrupolo, onde a energia é aplicada para fragmentar o íon em um padrão previsível.

Esses fragmentos se movem para outro analisador de massa, como um tempo de voo, que separa esses "íons de produto". Os íons do produto são então enviados para o detector, como em um instrumento MS normal. No caso de uma proteína desconhecida, o espectro resultante contém numerosos fragmentos sobrepostos, dificultando a geração de uma sequência completa definitiva da biomolécula. No entanto, o padrão espectral é único para uma determinada proteína. O software de análise compara o espectro a um banco de dados de sequências de peptídeos conhecidas, elucidando a proteína desconhecida dos fragmentos sobrepostos.

Dependendo da amostra e do grau de fragmentação desejado, vários métodos de fragmentação são possíveis. Os padrões de fragmentação dependem de como a energia é transferida, sua quantidade e como ela é distribuída através do íon precursor. A energia pode ser transferida por meio de partículas neutras, radiação ou elétrons. Usando átomos neutros, um processo chamado dissociação induzida por colisão ou CID, cliva principalmente a ligação peptídica entre os aminoácidos, ideal para sua identificação.

Agora que os fundamentos da técnica foram abordados, vejamos a espectrometria de massa em tandem CID sendo usada para estudar um componente dos envelopes de células bacterianas.

Como em todos os experimentos de espectrometria de massa, o primeiro passo é ionizar a amostra. Para biomoléculas, isso normalmente é feito com dessorção a laser assistida por matriz ou ionização por eletrospray. O sinal do íon precursor é então otimizado pelo ajuste da óptica do íon. Uma vez feito, o destino é isolado e o método de fragmentação é escolhido, como CID.

A força de uma tensão aplicada, que acelera o íon precursor na célula de colisão, afeta o grau de fragmentação. Essa tensão é aumentada até que o precursor tenha aproximadamente 10% de abundância em comparação com o íon de produto mais alto. Vários espectros são adquiridos e calculados até que uma relação sinal-ruído suficiente seja alcançada. O número de varreduras necessárias depende da intensidade do sinal do íon precursor original e pode variar de 3 a 300.

O analito neste exemplo, lipídio A de Escherichia coli K-12, tinha 19 fragmentos principais após CID. A estrutura geral do lipídio A é bem conhecida, permitindo que o software reconstrua a composição específica da amostra.

Agora que examinamos o procedimento, vamos ver algumas das maneiras pelas quais a espectrometria de massa em tandem é usada em bioquímica.

Um modo de varredura comum na espectrometria de massa em tandem é o monitoramento de reação selecionado, ou SRM. No SRM, ambos os analisadores de massa são fixados em uma relação massa-carga selecionada, com foco em íons precursores e produtos específicos. Devido ao alto grau de sensibilidade do SRM, os espectros de padrões peptídicos de concentração conhecida podem ser utilizados e comparados com os de amostras desconhecidas, permitindo que proteínas de interesse sejam quantificadas.

As proteínas são comumente modificadas após a tradução, normalmente pela adição de grupos funcionais, como grupos metil, grupos fosfato ou açúcares, conhecidos como glicanos. Estes são importantes nos processos de sinalização celular, elucidando como as células se comunicam umas com as outras. Como a espectrometria de massa em tandem fragmenta as proteínas em componentes menores, é possível determinar a localização do PTM no fragmento específico ou mesmo em um aminoácido. Algumas modificações, como acetilação e trimetilação, são difíceis de diferenciar apenas pela massa, então a separação cromatográfica é realizada antes da espectrometria de massa.

Muitos analitos no sangue do paciente são encontrados em concentrações abaixo do limite de detecção para espectrometria de massa típica. Outra vantagem do SRM é que ele descarta todos os íons do produto, exceto um, aumentando a sensibilidade e aumentando o limite inferior de detecção em até 100 vezes. Neste exemplo, o medicamento imunossupressor, tacrolimus, pode ser detectado em níveis de 1 ng/mL.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre espectrometria de massa em tandem. Este vídeo descreveu a teoria do instrumento, repassou um procedimento geral e explicou algumas das maneiras pelas quais a técnica está sendo utilizada atualmente. Obrigado por assistir!