Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila
24 de abril de 2018
Ensaios quantitativos de ingestão de alimentos com comida tingido fornecem um robusto e alta produtividade significa avaliar a motivação de alimentação. Combinando o ensaio de consumo de alimentos com thermogenetic e telas de optogenetic é uma poderosa abordagem para investigar os circuitos neurais subjacentes apetite em adultos melanogaster da drosófila.
O objetivo geral deste procedimento é medir quantitativamente a ingestão alimentar de Drosophila adulta, o que fornece um meio de avaliar os efeitos de manipulações genéticas, como ativações termogenéticas e optogenéticas de neurônios. Essas medidas podem ajudar a responder a questões-chave no campo da alimentação, como a neuromecânica da fome, saciedade e apetite. A principal vantagem dessa técnica é que ela quantifica simultaneamente a ingestão de alimentos de vários grupos de moscas, tornando-a especialmente útil para identificar moscas que se alimentam de forma anormal em telas genéticas.
Para começar, reúna suprimentos para preparar o contêiner externo. Suspenda 0,5 gramas de agarose e 50 mililitros de água bidestilada Aqueça com agitação frequente e ferva até dissolver completamente em um agitador magnético com uma placa de aquecimento.
Quando a 1% de agarose esfriar a cerca de 60 graus Celsius, transfira cinco mililitros para um recipiente externo vazio e mantenha o recipiente aberto até que a agarose esfrie à temperatura ambiente para produzir uma almofada de agarose. Em seguida, adicione 0,5 gramas de agarose a 50 mililitros de água bidestilada Aqueça com agitação frequente e ferva até dissolver completamente em um agitador magnético com uma placa de aquecimento.
Quando a 1% de agarose esfriar a cerca de 60 graus Celsius, adicione 1,71 gramas de sacarose à agarose para obter 100 milimoles de sacarose. Adicione 0,25 gramas de corante azul à solução de agarose para obter 0,5% de peso por volume de alimentos tingidos rotulados. Em seguida, prepare o recipiente interno.
Coloque os recipientes vazios dentro de uma superfície plana horizontal. Em seguida, adicione 750 microlitros de alimentos rotulados com corante azul a recipientes individuais para alimentos. Deixe solidificar por pelo menos cinco minutos.
Transfira um recipiente interno cheio para um recipiente externo preparado e posicione-o no centro da almofada de agarose. Prepare câmaras de alimentação com alimentos sem corantes para subtração de fundo. Deixe as câmaras de alimentação abertas em temperatura ambiente por 40 minutos, até que a parede do recipiente externo esteja livre de condensação.
Antes dos experimentos comportamentais, equilibre as câmaras de alimentação preparadas na temperatura experimental de 30 graus Celsius por duas horas para garantir que a temperatura seja relativamente uniforme nas câmaras de alimentação. Para iniciar o processo de alimentação, transfira cuidadosamente 20 moscas de seu frasco doméstico para uma câmara de alimentação pré-aquecida batendo suavemente. Continue o processo de alimentação a 30 graus Celsius por 60 minutos.
Interrompa a alimentação congelando as câmaras de alimentação a 80 graus Celsius negativos por 30 minutos. Transfira cuidadosamente 20 moscas de um frasco para injetáveis para uma câmara de alimentação batendo suavemente. Em seguida, coloque a câmara de lado na configuração de iluminação.
Para manipulação optogenética, use uma série de LEDs laranja como fonte de estimulação de luz e fixe uma placa de plexiglass horizontal acima dos LEDs para apoiar as câmaras de alimentação durante a iluminação. Mantenha a configuração em uma incubadora a 25 graus Celsius com 60% de umidade. Estimule o controle genético das moscas em paralelo com as moscas Taotie-GAL4 UAS CsChrimson, mas em diferentes câmaras de alimentação.
Continue o processo de alimentação por 60 minutos com retroiluminação pela luz laranja. Em seguida, congele as câmaras de alimentação a 80 graus Celsius negativos por 30 minutos. Depois de interromper a alimentação, despeje todas as 20 moscas da câmara de alimentação em um pedaço de papel de pesagem.
Em seguida, transfira-os para um tubo de 1,5 mililitro usando uma escova macia. Adicione 500 microlitros de PBST ao tubo e homogeneize as moscas usando um moinho a 60 hertz por cinco segundos. Em seguida, confirme a homogeneização suficiente por observação quando não houver fragmentos detectáveis de partes do corpo.
Gire os tubos com homogeneizados por 30 minutos a 1300 RPM para limpar os detritos. Após a centrifugação, transfira 100 microlitros de sobrenadante para um poço de placa de 96 poços. Para evitar o erro de cálculo dos absorventes causado por detritos, retire cuidadosamente o tubo usado da centrífuga e solte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o palete.
Depois que todas as amostras forem carregadas, coloque a placa em um leitor de placas para medir os absorventes das amostras em 630 nanômetros. A resposta alimentar foi quantificada por meio da inspeção visual e pontuação de moscas com corante detectável no intestino. Após a ativação dos neurônios Taotie, cerca de 58% das moscas Taotie dTRPA1 exibiram fortes comportamentos alimentares.
E 23% deles apresentaram comportamentos alimentares leves. Os neurônios Taotie-GAL4 ativados agudamente pelo TRPA1 aumentaram drasticamente a ingestão de alimentos, sugerindo que os neurônios marcados com Taotie-GAL4 participam da regulação da ingestão alimentar de Drosophila adulta. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a quantidade de ingestão de alimentos após manipular a atividade dos neurônios para investigar os mecanismos neurológicos de controle alimentar em Drosophila melanogaster adulta.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo discute um ensaio quantitativo de ingestão alimentar utilizando alimento corado para avaliar a motivação alimentar em Drosophila melanogaster adultas. O método permite análise de alto rendimento e pode ser combinado com telogenéticos e optogenéticos para investigar os circuitos neurais envolvidos na regulação do apetite.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Comportamental
- Genética
Antecedentes
- Compreender o comportamento alimentar é essencial para obter insights sobre a regulação do apetite.
- Manipulações genéticas podem influenciar a motivação alimentar e a saciedade.
- São necessários métodos de alto rendimento para analisar múltiplos indivíduos simultaneamente.
- Drosophila melanogaster atua como organismo modelo para o estudo desses mecanismos.
Objetivo do Estudo
- Medir quantitativamente a ingestão alimentar em Drosophila adulta.
- Avaliar os efeitos de manipulações genéticas no comportamento alimentar.
- Investigar os mecanismos neurais da fome e do apetite.
Métodos Utilizados
- Preparação de alimento à base de agarose para o ensaio.
- Uso de alimento corado para rastrear o consumo.
- Aplicação de técnicas termogenéticas e optogenéticas.
- Medição simultânea da ingestão alimentar em múltiplos grupos de moscas.
Resultados Principais
- O ensaio quantifica efetivamente a ingestão alimentar em diversas linhagens genéticas.
- Identifica moscas com padrões alimentares anormais em telas genéticas.
- Fornece insights sobre os circuitos neurais que regulam o apetite.
- Demonstra a robustez do método para análise de alto rendimento.
Conclusões
- O ensaio de ingestão alimentar é uma ferramenta valiosa para o estudo do comportamento alimentar.
- Combinar este método com manipulações genéticas aprimora a compreensão da regulação do apetite.
- Estudos futuros podem aproveitar esta abordagem para explorar comportamentos alimentares complexos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Ensaios quantitativos de ingestão alimentar combinados com a ativação de neurônios em Drosophila permitem a investigação precisa de circuitos neurais que regulam o apetite e o comportamento alimentar. Essa abordagem apoia a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas em vias neurobiológicas implicadas em distúrbios metabólicos e do apetite. A escalabilidade do método e suas saídas quantitativas o posicionam como uma plataforma robusta para triagem genética em alto rendimento e análise funcional de vias em processos de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a validação funcional de alvos neurais que influenciam a motivação alimentar e a saciedade.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao associar a ativação neuronal a resultados comportamentais quantificáveis.
- Facilita a triagem de vias candidatas para investigação adicional em modelos de doenças metabólicas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece um ensaio padronizado e quantitativo para avaliar perturbações genéticas e farmacológicas.
- Oferece medição reprodutível e de alto rendimento da ingestão alimentar em múltiplos grupos experimentais.
- Permite a identificação confiável de fenótipos alimentares anormais em telas genéticas.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha-se a mecanismos relevantes para doenças ao modelar a regulação do apetite em um sistema passível de análise.
- Permite continuidade da descoberta à validação pré-clínica de alvos neurobiológicos.
- Oferece valor preditivo para estudos subsequentes em modelos de ordem superior de distúrbios alimentares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses até a identificação de compostos líderes e a seleção de modelos pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: A medição quantitativa da ingestão alimentar permite a investigação orientada por hipóteses de circuitos neurais.
- Triagem: A padronização e escalabilidade do ensaio sustentam fluxos de trabalho robustos de triagem genética e farmacológica.
- Análises: A quantificação baseada em absorbância fornece leituras objetivas e comparáveis para análise entre condições.
- Pesquisa Translacional: Os resultados funcionais orientam o alinhamento de biomarcadores e a continuidade translacional para alvos relacionados ao apetite.
- Reutilização Empresarial: A plataforma de ensaio é adaptável para diversas manipulações genéticas e campanhas de triagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos neurais e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Fornece resultados padronizados, reprodutíveis e escaláveis de ensaios para uso entre equipes.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos em hipóteses biológicas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de alvos neurobiológicos em pipelines de doenças metabólicas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em genética de Drosophila e técnicas de manipulação neurogenética.
- Exige acesso a leitores de placas, setups de estímulo com temperatura e luz controladas, e infraestrutura básica de biologia molecular.
- Exige padronização entre equipes das condições do ensaio e dos protocolos de análise de dados.
- Adaptável a diversas linhagens genéticas e alvos neuronais no modelo Drosophila.
- As limitações incluem as restrições do organismo modelo e a necessidade de cuidadosa subtração do fundo em medições de absorbância.
