Name: Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprenda a medir a ingestão alimentar quantitativa em Drosophila melanogaster adultos usando alimento corante e técnicas termogenéticas ou optogenéticas. Este método de alta vazão permite identificar padrões anormais de alimentação em telas genéticas e investigar os circuitos neurais que regulam o apetite.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo nacional pesquisa básica programa da China (2012CB825504), Nacional Natural Science Foundation da China (91232720 e 9163210042), da Academia Chinesa de Ciências (CAS) (GJHZ201302 e SMC015-QYZDY-SSW), Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1119434) e 100-talentos programa de CAS para Y. Zhu.

1. preparar a câmara de alimentação
Nota: A câmara de alimentação para criação de etiquetas de corante alimentar ensaio consiste de duas partes: o recipiente externo (como uma capa) e o interior contêiner (como fonte de alimento).
<ol><li>Modificar o recipiente externo de um frasco de vidro para o cultivo da drosófila com (diâmetro interno de 31,8 mm) e uma altura de 80 mm (figura 1A, 1C). Cobrir o fundo do recipiente com uma camada de agarose a 1% (5 mL) para manter a configuração de alimentação adequadamente humedecidas e servir como um substrato macio para as moscas andar em cima (figura 1B). O recipiente, desse modo, oferece um ambiente controlado mas naturalista, carregando com o mínimo de estresse ou perturbação para as moscas.<ol>
<li>Prepare o recipiente externo. Suspender a 0,5 g de agarose em 50 mL de água bidestilada, calor com agitação frequente e ferva até para dissolver completamente em um agitador magnético com uma placa de calor.</li>
		<li>Quando esfria de agarose a 1% para cerca de 60 ° C, transferir 5ml de agarose a 1% para um vazio fora do recipiente (figura 1B) e deixe o recipiente ficar aberto até arrefecido à temperatura ambiente para produzir uma almofada de agarose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare alimentos tingir-etiquetados. Composição dos alimentos tingir-etiquetados varia de acordo com diferentes fins experimentais. Aqui está um exemplo de preparar o alimento tingir-etiquetados, contendo apenas a sacarose.<ol>
<li>Adicionar 0,5 g de agarose a 50 mL de água bidestilada, calor com agitação frequente e deixe ferver até para dissolver completamente em um agitador magnético com uma placa de calor.</li>
		<li>Quando a agarose 1% acima esfria a cerca de 60 ° C, adicione 1,71 g de sacarose para o agarose para obter sacarose 100 mM.</li>
		<li>Adicione 0,25 g de corante azul (erioglaucine dissódico) para a solução de agarose para obter comida de tingir-etiquetados de 0,5% (p/v).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar o interior recipiente. Colocar o vazio dentro de recipientes sobre uma superfície plana e horizontal e, em seguida, adicione 750 µ l de comida azul tingir-etiquetados para recipiente de alimento individuais, deixe solidificar durante pelo menos 5 min. Nota: Dentro do recipiente é um pequeno prato de plástico com diâmetro interno de 13,6 mm e uma altura de 7,5 mm (figura 1A, 1C). Ele está cheio de comida tingir-etiquetados e então está posicionado no centro da almofada do agarose do recipiente externo.</li>
	<li>Transferir um enchido dentro de contêiner para um recipiente fora preparado e posicioná-lo no centro do painel de agarose. Deixe-as câmaras de alimentação ficar aberto à temperatura ambiente por 40 min até a parede do recipiente externo é livre de condensação. Nota: Parede seca é necessária para impedir que as moscas sendo preso na parede, entrando em contato com gotas de água.</li>
	<li>Preparar a alimentação câmaras com comida sem corantes (mesma composição mas sem tingem) para subtração de fundo.</li>
</ol>2. preparação de moscas
Nota: Fêmea adulta voa 5 a 10 dias após a eclosão são normalmente utilizados para ensaios de alimentação. É recomendável para moscas de genótipos diferentes, incluindo controles de genéticas, de preparar e testar em paralelo. 20 moscas (a partir de uma câmara de alimentação) geram um ponto de dados.
<ol><li>Considere a densidade de população para a criação de moscas adultas. Normalmente, controle a densidade de população, variando o número de moscas parentais de acordo com as tensões e as dimensões dos frascos de cultura. Por exemplo, transferir 15 machos e 30 fêmeas de Cantão-S para um frasco de cultura com (de 31,8 mm de diâmetro) e uma altura de 80 mm e deixe as fêmeas para pôr ovos para um dia, em seguida, remover que o adulto voa.</li>
	<li>Prepare-se para ativação thermogenetic moscas.<ol>
<li>Use o sistema de Gal4/UAS38 para expressar dTRPA133 em vários neurônios por cruzamento que UAS-dTrpA1 voa com diferentes linhas de motorista GAL4 (Figura 2B).</li>
		<li>Mantenha as moscas adultas no padrão alimentar de 22 ° C, umidade relativa de 60% e um ciclo claro-escuro de 12 h/12 h.</li>
		<li>Dois dias antes da alimentação do ensaio, classificar e coletar moscas num CO2 bloco voar sob um microscópio estéreo em um frasco de alimentos frescos e manter uma densidade de 20 moscas por frasco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se para a ativação de optogenetic moscas.<ol>
<li>Use o sistema de Gal4/UAS38 para expressar CsChrimson36 nos neurônios diferentes por moscas de UAS-CsChrimson cruzando com linhas diferentes de motorista GAL4.</li>
		<li>Coletar recém eclosed (dentro de 24 h) moscas e transferi-los em um frasco com o alimento padrão contendo 400 µM all-trans-retinal.</li>
		<li>Para prevenir a ativação prematura, embrulhar os frascos de criação com folha de alumínio e em seguida, colocá-los em uma caixa escura para proteger moscas de estimulação de luz indesejada. Manter as moscas a 25 ° C, umidade de 60% no escuro por 4-6 dias.</li>
		<li>Dois dias antes do ensaio de alimentação, fêmea tipo voa em CO2 pad voar sob um microscópio estéreo. Recolher 20 moscas no frasco de um alimento e mantê-los no escuro antes do teste de alimentação.</li>
		<li>Realizar todas as operações sob a luz ofuscante tão rapidamente quanto possível, para evitar os efeitos causados pela luz ambiente. Usar uma lâmpada de LED colocada longe da área de trabalho, a intensidade na área de trabalho é 5 µW/cm2. Nota: Uso de fome Cantão-S voa como um controle positivo para o ensaio de alimentação. Privar estas moscas de comida e manter em agarose a 1% por 24 horas antes do teste de alimentação. Os níveis de consumo de alimentos destas moscas ajudam a avaliar as flutuações diárias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. thermogenetic ativação
<ol><li>Conduzir experimentos de alimentação todas ao mesmo tempo do dia, em torno de Zeitgeber tempo 4-631,,32, para minimizar variações devido ao ritmo circadiano.</li>
	<li>Prepare uma incubadora (ou uma pequena sala com um aquecedor de temperatura controlada) como o ambiente de aquecimento.</li>
	<li>Antes de experimentos comportamentais, equilibrar as câmaras de alimentação preparadas à temperatura experimental (30 ° C) por 2 h assegurar que a temperatura é uniforme relativo na câmara de alimentação.</li>
	<li>Para iniciar o processo de alimentação, cuidadosamente transferi 20 moscas de seu frasco em casa em uma câmara de alimentação pré-aquecida tocando suave. Continuar o processo de alimentação a 30 ° C por 60 min ( Figura 3A) . Nota: Frequentes agitações, tais como abertura e fechamento da porta de incubadora, afetar adversamente o comportamento alimentar, assim, devem ser minimizadas.</li>
	<li>Cesse a alimentação a 60 min por congelamento as câmaras de alimentação de-80 ° C (ou a-20 ° C) por 30 min. Nota: Congelamento ajuda a parar as mamadas em todas as câmaras em simultâneo. Congelamento de moscas a-80 ° C tem duas finalidades, para eutanásia as moscas e para armazenamento até homogeneização por até uma semana.</li>
	<li>Para o grupo de controle de temperatura, transferi 20 moscas para uma temperatura ambiente alimentando câmara com cor de corante alimentar para iniciar o processo de alimentação a 22 ° C por 60 min.</li>
	<li>Cesse a alimentação do grupo de controle de temperatura congelando as câmaras a-80 ° C (ou a-20 ° C) por 30 min.</li>
</ol>4. Optogenetic ativação
<ol><li>Conduzir experimentos de alimentação todas ao mesmo tempo do dia, em torno de Zeitgeber tempo 4-631,,32, para minimizar variações devido ao ritmo circadiano.</li>
	<li>Transferir com cuidado 20 moscas de um frasco para uma câmara de alimentação suave tocando e em seguida, colocar a câmara lateralmente sobre a instalação de iluminação (Figura 4A, 4B).<ol>
<li>Para manipulação de optogenetic, usar uma matriz de LEDs laranja (607 nm) como a fonte da luz de estimulação e fixar uma placa horizontal do plexiglás acima os LEDs para apoiar a alimentação câmaras durante a iluminação. Manter a instalação em uma incubadora a 25 ° C, com 60% de umidade (Figura 4A, 4B).</li>
		<li>Estimular as controle genético de moscas em paralelo com o Taotie > CsChrimson voa, mas em diferentes câmaras de alimentação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Continue o processo de alimentação para 60 min com iluminação traseira pela luz laranja.<ol>
<li>Determinar as intensidades de iluminação ideal para optogenetics experimentalmente36. Para o Taotie > CsChrimson moscas, uma intensidade de 2,2 mW/mm2 induz paralisia (cessação de locomoção) e perda de controle postural, portanto, use uma intensidade intermediária de 0.1 mW/mm2 para estimular o Taotie > CsChrimson voa durante o teste de alimentação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cesse a alimentação por congelamento câmaras de alimentação de-80 ° C (ou a-20 ° C) por 30 min.</li>
</ol>5. visual estimativa de consumo de alimentos
Nota: A abordagem de Pontuação visual fornece uma estimativa semi-quantitativa de consumos de alimentos. Embora não seja tão objectiva quanto o método óptico, este método permite a passar por um grande número de estirpes voar em tempo hábil, tornando-o adequado para a primeira rodada de uma tela de genética para rapidamente reduzir a lista de candidatos para testes adicionais.
<ol><li>Após o processo de alimentação, anestesiar e marcar as moscas em um CO2 almofada voar sob um microscópio estéreo. Dar Pontuação individual para cada mosca com base no volume e intensidade de cor de corante de comida em seu abdômen (Figura 2A). Nota: Critérios para estimativa visual: o sistema de Pontuação tem 4 níveis de ingestão de alimentos, correspondentes a diferentes volumes e intensidades de alimentos coloridos no abdômen.<ol>
<li>Pontuação voa sem detectável cor de corante alimentar uma pontuação de 0; aqueles com corante azul (mal detectável) fraco ou com cor de corante alimentar ocupando menos de um terço do volume do abdome dar uma pontuação de 1.</li>
		<li>Pontuação voa com intensa cor de corante alimentar, ocupando metade do abdome um placar de 2.</li>
		<li>Aqueles com intensa tingido conteúdo ocupando metade do abdome superior a marcar uma pontuação de 3 (Figura 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule a proporção de moscas com pontuações diferentes em cada condição experimental (Figura 2B).</li>
</ol>6. colorimétrica quantificação do consumo de alimentos
<ol><li>Após cessação da alimentação, despejar todas as 20 moscas de uma alimentação de câmara em um pedaço de papel de pesagem, em seguida, transferi-los para um tubo de 1,5 mL, usando uma escova macia. Nota: Não tome todas as câmaras de armazenamento-80 ° C ao mesmo tempo para evitar moscas, furar a parede da câmara devido a condensação de água na câmara fria.</li>
	<li>Adicionar 500 µ l de PBST ao tubo e homogeneizar as moscas usando um moinho de moedura em 60Hz para 5 s.<ol>
<li>Confirme a homogeneização suficiente pela observação quando existem não detectáveis fragmentos de partes do corpo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gire os tubos com homogenates por 30 min a 13.000 rpm para limpar os escombros.</li>
	<li>Após a centrifugação, transferi 100 µ l do sobrenadante para um poço de uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Depois que todas as amostras são carregadas, coloquei a placa em um leitor de placa para medir a absorvância das amostras em 630 nm.</li>
	<li>Para remover a absorvância de fundo, subtrair o valor da absorvância dos sobrenadantes de moscas alimentados com comida sem tintura valor da absorvância do líquido sobrenadante de moscas alimentados com comida azuis. Nota: Esta etapa é opcional, dependendo das composições dos alimentos utilizados. Quando um alimento voar (sem tintura) gera a absorvância a 630 nm, é necessário efectuar este passo para eliminar o fundo.</li>
</ol>

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Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Este relatório concentra-se no processo técnico de ensaios de alimentação corante-rotulagem de consumo de alimentos no contexto de thermogenetic e ativação de optogenetic para manipular os neurônios controlando a alimentação. Este protocolo simples e de confiança vai ajudar a elucidar a função dos neurônios do candidato na alimentação de controle, para medir a preferência alimentar de moscas e para identificar novos jogadores nos circuitos de controle de alimentação através de telas de genética baseada em alimentação<sup...

Quantificar a quantidade de comida ingerida é importante para avaliar vários aspectos da alimentação controles pelo cérebro em responder às necessidades internas (tais como Estados de fome) e fatores externos (como a qualidade dos alimentos e palatabilidade)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. nos últimos anos, os esforços de decifrar os substratos neurais de controle de alimentação em Drosophila levam ao desenvolvimento de vários ensaios para diretamente a quantificar a quantidade de comida ingerida ou servir como um indicador de alimentação motivação 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
O ensaio de alimentador capilar (CAFE)12,13 foi desenvolvido para medir a quantidade de consumo de alimentos líquidos em uma conta de vidro. O ensaio CAFE é altamente sensível e reprodutível17 e simplifica a medição do consumo de alimentos, especialmente para quantificação de alimentação a longo prazo18. No entanto, este ensaio requer as moscas para subir até a ponta da conta e alimentar de ponta-cabeça, que não é adequado para todas as estirpes. Além disso, porque as moscas a ser testado usando o ensaio de café têm de ser criados no alimento líquido, o efeito destas condições no status de metabolismo ou desnutrição a potencial de criação permanece ser determinado.
O ensaio de Proboscis extensão resposta (PER)11,14 conta a frequência de respostas de extensão narigudo em direção a toques suaves de gotas de comida. POR ensaio provado-se como uma excelente maneira de avaliar alimentação motivação de mosca individual e bundas a influência de palatabilidade e conteúdo de alimentos18,19. No entanto, não é uma quantificação directa da quantidade de ingestão.
Recentemente, foi desenvolvido um método semiautomático, manual do ensaio (MAFE)15, de alimentação. Em MAFE, uma única mosca imobilizada é alimentada manualmente com uma conta que contém o alimento. Dado que as respostas de extensão de narigudo e consumo de alimentos podem ser monitorados simultaneamente, MAFE é adequado para avaliar valores de nutrientes e os efeitos da manipulação farmacológica. No entanto, imobilizando uma mosca pode afetar negativamente seu desempenho comportamental, incluindo a alimentação.
Além disso, voar Proboscis e atividade Detector (FlyPAD)10 foi desenvolvido para quantificar automaticamente o comportamento alimentar. Usando métodos de visão de máquina, FlyPAD registros de interações físicas entre uma mosca e comida para quantificar a frequência e duração das extensões de tromba como um indicador de alimentação motivação. FlyPAD fornece uma abordagem de alto rendimento para monitorar os comportamentos de alimentação de uma mosca em movimento livre, embora a sensibilidade e a robustez deste sistema continua a ser confirmada por mais de12estudos.
Estratégias de rotulagem são frequentemente usadas para estimar a ingestão de alimentos em moscas. É comum de rotular os alimentos com traçadores químicos e, após a alimentação, medir a quantidade de traçador ingerido para calcular a quantidade de ingestão de alimentos. Traçadores radioativos,16,17,20,21,22,23,24,25 permitir a detecção através da cutícula sem homogeneização das moscas. Este método fornece notavelmente baixa variabilidade e alta sensibilidade18e é viável para o estudo de longo prazo da ingestão de alimentos. No entanto, a disponibilidade de radioisótopos utilizáveis e diferentes taxas de absorção e excreção devem ser tida em conta quando se trabalha com este ensaio.
Rotulagem e rastreamento de ingestão de alimentos com cores de alimentos tóxicos é um mais simples e mais segura alternativa2,3,26,,27,28. Moscas são homogeneizadas após a alimentação com alimentos que contenham corantes solúveis e não absorvível, e a quantidade do corante ingerido mais tarde é quantificada utilizando um espectrofotômetro3,24,28,29 . A estratégia de rotulagem é fácil de executar e fornece alta eficiência, mas com uma ressalva. O volume de ingestão de alimentos, estimado a partir da tintura ingerida é menor que o volume real porque excreção começa tão cedo quanto 15 min depois moscas Iniciar alimentação17. Além disso, o ensaio avalia a ingestão de comida tipicamente dentro de um período de 60 min, que só é adequado para investigação do comportamento alimentar a curto prazo24,28. Além disso, vários fatores internos e externos, tais como o genótipo17, gênero17, acasalou estado17, criação de densidade30, ritmo circadiano31,32e comida de qualidade3 , 8 , 16, ingestão de alimentos de influência. Portanto, a alimentação duração talvez precise ser ajustado de acordo com as condições experimentais específicas. Além de facilitar a quantificação da ingestão de alimentos, cores de alimentos também são usadas para avaliar opções de comida a2,19,27e visualizar o menisco em uma conta no CAFE ensaio12.
Aqui, apresentamos uma protocolo combinado manipulação da atividade neuronal com abordagem de criação de etiquetas de tintura. Esta estratégia tem sido provada útil em nosso estudo neurogenetic alimentando o controle em adultos de moscas de fruta24. O método de Pontuação visual permite uma rápida estimativa do consumo de alimentos; assim, é útil para o rastreio através de um grande número de estirpes em tempo hábil. Os candidatos a partir da tela são então analisados em detalhe, usando um método colorimétrico para fornecer objectivas e quantificação exacta em estudo adicional.
Além de ensaios de alimentação, também descrevemos o thermogenetic27,33,34,35 e optogenetic36 métodos forçosamente ativando neurônios alvo em Drosophila. Para ativar os neurônios por thermogenetic a operação é simples e conveniente com Drosophila transitória do Receptor potencial Ankyrin 1 (dTRPA1), que é um canal de cação de temperatura e voltagem-dependente que aumenta a excitabilidade neuronal quando a temperatura ambiente temperatura se eleva acima de 23 ° C33,,37; no entanto, testes com animais em altas temperaturas podem produzir efeitos adversos sobre o comportamento. Outra abordagem eficaz para ativar os neurônios em Drosophila é usando o optogenetics com CsChrimson36, que é uma variante avermelhado do channelrhodopsin que aumenta a excitabilidade dos neurônios quando expostos à luz. Optogenetics oferece a maior resolução temporal e a menor perturbação de comportamentos do que thermogenetics. Combinando a medição quantitativa de ingestão de alimentos com a manipulação da atividade neuronal representa uma abordagem eficaz para estudar os mecanismos neurais de alimentação.
Descrevemos em detalhe a preparação da câmara de alimentação e as moscas a ser testado. Usando moscas Taotie-Gal4 como um modelo24, descrevemos ativando neurônios por thermogenetics e optogenetics. Dois ensaios de quantificação do consumo de alimento com comida tingir-etiquetados são também descritos no protocolo.

<table><tbody><tr><td>UAS-CsChrimson</td><td>Bloomintoon</td><td>55135</td><td></td></tr><tr><td>UAS-dTrpA1</td><td>Bloomintoon</td><td>26263</td><td></td></tr><tr><td>TDC1-GAL4&nbsp;</td><td>Bloomintoon</td><td>9312</td><td></td></tr><tr><td>TDC2-GAL4</td><td>Bloomintoon</td><td>9313</td><td></td></tr><tr><td>sNPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornecido por Z. Zhao</td></tr><tr><td>NPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornecido por Y. Rao</td></tr><tr><td>TH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornecido por Y. Rao</td></tr><tr><td>5-HT-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornecido por Y. Rao</td></tr><tr><td>AKH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornecido por Y. Rao</td></tr><tr><td>dip2-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornecido por Y. Rao</td></tr><tr><td>Taotie-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornecido por J. Carlson</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Sal dissódico de erioglaucina</td><td>Sigma</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>all-trans-retinal&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>R2500</td><td>armazenado na escuridão</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-01</td><td></td></tr><tr>Alimento <td></td><td>para moscas</td><td>1 L de alimento contém: 77,7 g de fubá, 32,19 g de fermento, 5 g de ágar, 0,726 g de CaCl2, 31,62 g de sacarose, 63,2 g de glicose, 2 g de sorbato de potássio, pH&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 1x tampão PBS&nbsp;</td><td></td><td>1 L 1X PBS contém: 8 g de Nacl, 0,2 g de Kcl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, tampão</td> PBST de pH 7,4 <td></td></tr><tr><td></td><td>1X PBS com 1% de Triton X-100</td><td></td>&nbsp;<td></td></tr><tr><td> Moinho de moagem</td><td>Shang Hai Jing Xin</td><td>Tissuelyser-24</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Ning Bo Jiang Nan</td><td>HWS-80</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético com placa de aquecimento</td><td>Espectrômetro Chang Zhou Bo Yuan</td><td>CJJ 78-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>CCS200/M</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Multiskan GO Tipo: 1510, REF 51119200</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo de fluorescência&nbsp;</td><td>Leica</td><td>&nbsp; Microscópio estéreo M205FA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica&nbsp;</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente externo</td><td>Jiang Su Hai Men</td><td>frasco de vidro com um diâmetro de 31,8 mm e uma altura de 80 mm (dimensão interna)</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente interno&nbsp;</td>Prato de plástico da <td>fábrica de máquinas Beijing Yi Ran</td><td>com um diâmetro de 13,6 mm e uma altura de 7,5 mm (dimensão interna)</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf de 1,5 mL</td><td>Hai Men Ning Mong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Placa de 96 poços</td><td>Corning Incorporated</td><td>&nbsp; Costar 3599</td><td></td></tr><tr><td>LEDs</td><td>Xin Xing Yuan Guangdian</td><td>607 nm, 3W&nbsp;</td><td>https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058</td></tr></tbody></table>

combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em drosophila

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Consumo de alimentos está sob o controle apertado do cérebro, que integra o estado fisiológico, palatabilidade e conteúdo nutricional dos alimentos e questões de comandos para iniciar ou parar a alimentação. Decifrando os processos subjacentes a tomada de decisão oportuna e moderada alimentação traz implicações importantes em nossa compreensão de distúrbios fisiológicos e psicológicos relacionados ao controle de alimentação. Métodos quantitativos, simples e robustos são necessários para mensurar a ingestão de alimentos de animais após manipulação experimental, como à força, aumentando as atividades de certos neurônios do alvo. Aqui, nós introduzimos a ensaios de alimentação corante-rotulagem-based para facilitar o estudo neurogenetic de controle de alimentação em adultos de moscas de fruta. Podemos rever ensaios de alimentação disponíveis e em seguida descrever nossos métodos passo a passo da configuração para análise, que combinam thermogenetic e manipulação de optogenetic de neurônios controlando alimentação motivação com ensaio de ingestão de alimentos tingir-etiquetados. Também discutimos as vantagens e limitações dos nossos métodos, em comparação com outros ensaios de alimentação, para ajudar os leitores a escolher um ensaio apropriado.

Thermogenetic tela.
Anormalmente, aumento do apetite faz com que a ingestão de alimentos elevados, independentemente de necessidades fisiológicas. Utilizamos este regime para projetar um elevado-throughput comportamental tela para obter alças genéticas de neurônios relacionados à fome e saciado Estados (Figura 1). A tela rendeu Taotie-Gal424. Quando os neurônios ...

Ensaios quantitativos de ingestão de alimentos com comida tingido fornecem um robusto e alta produtividade significa avaliar a motivação de alimentação. Combinando o ensaio de consumo de alimentos com thermogenetic e telas de optogenetic é uma poderosa abordagem para investigar os circuitos neurais subjacentes apetite em adultos melanogaster da drosófila.

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

O objetivo geral deste procedimento é medir quantitativamente a ingestão alimentar de Drosophila adulta, o que fornece um meio de avaliar os efeitos de manipulações genéticas, como ativações termogenéticas e optogenéticas de neurônios. Essas medidas podem ajudar a responder a questões-chave no campo da alimentação, como a neuromecânica da fome, saciedade e apetite. A principal vantagem dessa técnica é que ela quantifica simultaneamente a ingestão de alimentos de vários grupos de moscas, tornando-a especialmente útil para identificar moscas que se alimentam de forma anormal em telas genéticas.Para começar, reúna suprimentos para preparar o contêiner externo. Suspenda 0,5 gramas de agarose e 50 mililitros de água bidestilada Aqueça com agitação frequente e ferva até dissolver completamente em um agitador magnético com uma placa de aquecimento.Quando a 1% de agarose esfriar a cerca de 60 graus Celsius, transfira cinco mililitros para um recipiente externo vazio e mantenha o recipiente aberto até que a agarose esfrie à temperatura ambiente para produzir uma almofada de agarose. Em seguida, adicione 0,5 gramas de agarose a 50 mililitros de água bidestilada Aqueça com agitação frequente

combining-quantitative-food-intake-assays-forcibly-activating-neurons

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

Larvas de Drosophila são capazes de associar estímulos odor com recompensa gustativa. Aqui nós descrevemos um paradigma comportamental simples que permite a análise da aprendizagem associativa apetitiva olfativo.

Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

Este vídeo descreve o ensaio de preferência de sabor, um método comportamental usado para medir a atração ou evitação por soluções coloridas com sabor diferente, avaliando a coloração abdominal da mosca após a ingestão da substância preferida. O protocolo apresentado demonstra o procedimento usado para medir a preferência das moscas por soluções de concentrações variadas de sacarose.

Ensaio de Preferência de Sabor: Um Método para Medir o Comportamento Alimentar em Drosophila

Este vídeo descreve o ensaio CApillary FEeder, ou CAFE, um método comportamental que mede a ingestão de alimentos e a preferência de moscas-das-frutas desenfreadas. O protocolo apresentado mostra como realizar o ensaio com evaporação mínima dos capilares cheios de líquido usados para fornecer o alimento e rastrear sua ingestão.

O ensaio CApillary FEeder (CAFE): um método para rastrear o consumo e a preferência alimentar em Drosophila

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em Drosophila

Nós descrevemos um protocolo para induzir gratificante e nonrewarding experiências em moscas da fruta (Drosophila melanogaster), utilizando o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

O ensaio CApillary FEeder (CAFE) é um método simples, econômico e altamente confiável para investigar os mecanismos subjacentes à ingestão de alimentos. Usado com o organismo modelo genético altamente versátil Drosophila melanogaster, ele fornece um meio poderoso de obter novos insights sobre os mecanismos regulatórios da ingestão de alimentos.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Descrito aqui é um protocolo que permite a quantificação colorimétrica da quantidade de alimentos comidos dentro de um intervalo definido de tempo por larvas de melanogaster Drosophila expostas a dietas de diferentes qualidades macronutrientes. Esses ensaios são conduzidos no contexto de uma tela termogenética neuronal.

Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila

Apresentamos um protocolo para um ensaio de alimentação de duas opções para moscas. Este ensaio de alimentação é rápido e fácil de executar e é adequado não apenas para pesquisas de laboratório de pequena escala, mas também para telas comportamentais de alto rendimento em moscas.

Um ensaio rápido de preferência alimentar em Drosophila

O ensaio alimentador de microplacos oferece um método econômico de alta produtividade para quantificar o consumo de alimentos líquidos em Drosophila. Um dispositivo impresso em 3D conecta uma microplaca de 96 poços na qual as moscas estão alojadas em uma microplaca de 1536 poços da qual as moscas consomem uma solução de alimentação com um corante rastreador. O declínio do volume da solução é medido espectrofotometricamente.

Um ensaio alimentador de microplaco de alta produtividade para quantificação do consumo em Drosophila

Uma abordagem de imagem de cálcio permite o registro de respostas induzidas pelo paladar no cérebro de moscas acordadas enquanto uma solução é aplicada ao labelo. As respostas gustativas primárias em Drosophila melanogaster são usadas como exemplo, mas este protocolo pode ser adaptado para estudar neurônios a jusante ou outras espécies.

In vivo Imagem de cálcio de respostas neurais induzidas pelo paladar em Drosophila adulta

Aprenda a medir a ingestão alimentar quantitativa em Drosophila melanogaster adultos usando alimento corante e técnicas termogenéticas ou optogenéticas. Este método de alta vazão permite identificar padrões anormais de alimentação em telas genéticas e investigar os circuitos neurais que regulam o apetite.

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

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