Célula única Microfluidic análise de Bacillus subtilis

O objetivo geral desta configuração experimental microfluídica é permitir a observação de longo prazo de células bacterianas individuais sob condições ambientais constantes e altamente controladas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia bacteriana, como quais são os padrões de resposta de longo prazo de células individuais ao estresse ou como um fenótipo heterogêneo em uma população varia com o tempo. A principal vantagem dessa técnica é que podemos observar linhagens celulares individuais por dezenas ou mesmo centenas de gerações, sob condições ambientais constantes, uniformes e altamente controladas.

Depois de preparar o polímero PDMS de acordo com o protocolo de texto, coloque um mestre de silicone em um pedaço de folha de alumínio intacta em uma placa de Petri de poliestireno. Despeje a mistura PDMS desgaseificada sobre o mestre a uma profundidade de aproximadamente cinco milímetros. Em seguida, desgaseifique o prato por pelo menos 10 minutos.

Cure o PDMS em um forno a 60 graus Celsius por pelo menos uma hora e resfrie-o à temperatura ambiente. Em seguida, remova a folha de alumínio contendo o PDMS mestre e curado da placa. Marque-o com cuidado e retire a folha de alumínio da parte de trás do mestre.

Em seguida, retire cuidadosamente o PDMS do mestre. Como wafer, normalmente inclui vários dispositivos microfluídicos com dimensões ligeiramente diferentes. Use um bisturi limpo e afiado para cortar um único dispositivo no tamanho apropriado.

Coloque um pedaço de fita adesiva translúcida sobre o lado padronizado do dispositivo para aumentar a visibilidade dos recursos padronizados. As portas de entrada e saída são identificadas como áreas circulares em extremidades opostas dos canais fluídicos visíveis. Vire o dispositivo PDMS com o lado do padrão para baixo e use um punção de biópsia de 0.75 milímetros para perfurar o dispositivo até os pontos marcados.

Em seguida, descarte os perfurações. Uma pinça pode ser necessária para remover as perfurações do dispositivo. Insira a lamínula limpa e seca e o dispositivo PDMS em um limpador de plasma de oxigênio e trate o dispositivo com as configurações mostradas aqui.

Imediatamente após o término do tratamento com plasma, remova o dispositivo e a lamínula do limpador de plasma. Inverta o PDMS e coloque-o no centro da lamínula de forma que o lado do padrão entre em contato com o vidro. Certifique-se de que os canais de alimentação estejam alinhados com o acesso longo da lamínula.

Pressione suavemente para garantir que o PDMS vede contra o vidro. Asse o dispositivo montado em um forno a 60 graus Celsius por pelo menos uma hora. Após o cozimento, verifique manualmente se o PDMS está colado ao vidro empurrando suavemente um canto do dispositivo.

Depois de cortar a tubulação de polímero de acordo com o protocolo de texto, monte as junções em Y para válvulas de aperto, se usá-las, cortando e prendendo comprimentos de dois centímetros de tubo de silicone flexível nas farpas superiores do Y e comprimentos de um centímetro de tubo de silicone na farpa inferior do Y. Em seguida, corte comprimentos de 10 centímetros de tubo de polímero e conecte-os em uma extremidade à junção do interruptor, inserindo-os nos segmentos de tubo de silicone de um centímetro em a farpa inferior do Y.Conecte os comprimentos do tubo na outra extremidade às agulhas de calibre 21 que foram removidas de seus adaptadores de seringa de plástico e dobradas aproximadamente 90 graus a cerca de nove milímetros da extremidade da agulha. Conecte agulhas rombas de calibre 21 a uma extremidade dos segmentos da tubulação que irão das seringas ao aparelho de comutação, inserindo as agulhas na tubulação. Insira as outras extremidades de cada comprimento de tubo nos segmentos de tubo de silicone nas farpas de entrada das junções em Y.

Depois de encher as seringas com meio de crescimento bacteriano, suplementado com BSA, de acordo com o protocolo de texto, conecte as seringas carregadas às agulhas preparadas de calibre 21, conecte ao tubo de entrada e carregue as seringas nas bombas de seringa. Purgue o ar do encanamento de entrada operando as bombas de seringa em uma alta taxa de fluxo e orientando as bombas de seringa verticalmente, batendo nas seringas para trazer bolhas de ar para o topo. Uma vez que o ar tenha sido purgado da seringa, posicione a bomba da seringa horizontalmente e bata ou mova progressivamente as linhas de polímero das seringas, através do aparelho de comutação para desalojar e purgar quaisquer bolhas de ar.

Repita esse processo para o segundo banco de seringas se trocar de mídia. Depois que as bolhas de ar forem purgadas, ajuste a bomba de seringa da fase dois para 1.5 microlitros por minuto e pause o fluxo. Coloque pequenos clipes de aglutinante nos segmentos de tubulação flexível no ramal das junções Y correspondentes à segunda fase média e continue a operar a bomba da fase um para purgar o segundo meio a jusante da junção Y.

Para carregar o dispositivo PDMS, comece colocando suavemente as pontas de micropipeta vazias e finas de carregamento de gel nos orifícios de saída do dispositivo microfluídico. Usando pontas finas de carregamento de gel com a micropipeta P200, passivar o dispositivo injetando meio contendo um miligrama por mililitro de BSA nos orifícios de entrada, observando as pontas e os orifícios de saída para monitorar o enchimento dos canais microfluídicos. Incube o dispositivo em temperatura ambiente por aproximadamente cinco minutos.

Em seguida, usando pontas semelhantes, carregue cada canal com as células ressuspensas usando as pontas no canal de saída para monitorar o progresso das células através do dispositivo. Remova cuidadosamente as pontas de carregamento de gel dos orifícios de saída, trabalhando uma de cada vez para evitar danos ao dispositivo. Centrifugue o dispositivo em uma microcentrífuga de bancada em um adaptador de rotor apropriado a aproximadamente 6.000 vezes g por 10 minutos.

Verifique o carregamento bem-sucedido sob o microscópio, mas sem fixar o dispositivo no suporte da lâmina stage inserto. Monte cuidadosamente o dispositivo carregado em um inserto de platina prendendo a lamínula de cobertura em ambos os lados do PDMS na parte inferior do inserto de platina. Inverta o conjunto do dispositivo de inserção de platina de forma que o PDMS fique voltado para cima e coloque-o em uma superfície macia, como um pano sem poeira.

Ajuste a vazão da bomba de seringa da fase um para 35 microlitros por minuto. Em seguida, trabalhando com uma pista de cada vez, insira a agulha de entrada e, em seguida, a agulha de saída que vai até o copo de resíduos. Depois de inspecionar visualmente o dispositivo quanto a vazamentos, examine a tubulação de saída quanto ao aparecimento de excesso de células que aparecem como uma faixa turva no menisco médio, que se moverá lentamente em direção ao copo de resíduos.

Depois que o dispositivo funcionar por aproximadamente 15 minutos, defina a bomba de seringa da fase um para 1.5 microlitros por minuto e pause o fluxo. Leve toda a bomba e o aparelho do dispositivo para um microscópio fluorescente invertido e reinicie o fluxo médio da fase um a 1,5 microlitros por minuto. Monte cuidadosamente o inserto da platina com o dispositivo no microscópio, usando fita adesiva conforme necessário para direcionar a tubulação de entrada e saída.

Localize as posições apropriadas no dispositivo para imagens e comece a criar imagens conforme desejado. Observe que as células normalmente requerem algumas horas para ler o estado estacionário, o crescimento da fase exponencial, e o início da aquisição da imagem pode ser atrasado conforme desejado, de modo que a imagem comece após o período de equilíbrio. Para alternar o meio entre rodadas sucessivas de imagens, pause o fluxo da bomba de seringa de fase um, solte cuidadosamente os clipes de aglutinante do tubo de silicone da fase dois, movendo cada um para o tubo de silicone no ramo da fase um da junção Y, depois retome o fluxo da bomba de seringa da fase dois e continue a imagem.

Conforme avaliado por microscopia de contraste de fase, antes de conectar o encanamento microfluídico ao dispositivo, o carregamento inicial da célula seria considerado bem-sucedido se todos ou quase todos os canais laterais microfluídicos contivessem uma ou mais células bacterianas. Uma vez que o dispositivo é carregado inicialmente, ele é equilibrado a uma taxa de fluxo relativamente alta. Como mostrado aqui, a inspeção microscópica de um dispositivo equilibrado deve revelar algumas células confinadas em uma única fila na maioria dos canais laterais.

Uma vez que um dispositivo equilibrado é colocado no microscópio sob fluxo de 1,5 microlitros por minuto a 37 graus Celsius, as células retomarão o crescimento uniforme e constante da fase exponencial ao longo de aproximadamente duas horas. As células que retomaram o crescimento da fase exponencial podem ser visualizadas de forma confiável usando microscopia de campo claro ou fluorescência por pelo menos 24 horas. A introdução de um interruptor médio expande a gama de experimentos que podem ser conduzidos, mas também aumenta a frequência de eventos catastróficos de morte celular por meio da presença de bolhas de ar ou aglomerados de células na entrada que se desalojam e passam pelo canal de alimentação.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente cinco horas, se for executada corretamente. Usando este procedimento, com diferentes repórteres fluorescentes, cepas e condições ambientais, uma ampla variedade de fenômenos fisiológicos pode ser examinada, incluindo eventos muito raros ou transitórios.