Name: Célula única Microfluidic análise de Bacillus subtilis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprenda análise microfluídica de célula única em Bacillus subtilis para observação de linhagens bacterianas por múltiplas gerações. Este método permite estudar respostas celulares ao estresse em condições controladas.

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Este projecto foi financiado pelo National Institutes of Health, sob GM018568. Este protocolo foi realizado em parte no centro para sistemas de nanoescala (CNS), um membro do nacional nanotecnologia coordenada infra-estrutura de rede (NNCI), que é apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob prêmio NSF n º 1541959. CNS é parte da Universidade de Harvard. Muitos agradecimentos são devidos a Thomas Norman e Nathan Senhor por seu trabalho em conceber e fabricar o modelo mestre, usado para os dispositivos mostrados aqui e na construção da versão original do aparelho. Também agradecemos a Johan Paulsson por sua valiosa colaboração assessoria e agradecer aos membros de seu laboratório para seus conselhos e melhorias contínuas para aparelhos microfluidic bacteriana.

1. PDMS dispositivo Casting
<ol><li>Em um ambiente livre de poeira, mistura de polímero PDMS e agente de cura, na proporção de 10:1 e desgaseificar sob vácuo durante pelo menos 10 minutos.</li>
	<li>Coloque um mestre de silício (ou mesmo uma réplica de epóxi ou poliuretano) num pedaço de papel alumínio ininterrupta em uma placa de Petri de poliestireno. Despeje a mistura PDMS a desgaseificado sobre o mestre a uma profundidade de aproximadamente 5 mm. Degas a placa de Petri de pelo menos 10 min. Use uma ligeira corrente de ar para quebrar as bolhas de superfície. Nota: As dimensões do dispositivo dois-tiered utilizados são fornecidas no acompanha arquivo CAD.5 (Veja o arquivo complementar 1). Um mestre de réplica de plástico pode flutuar parcialmente durante a desgaseificação; Se isso ocorrer, pressione a réplica com um aplicador de plástico limpo.</li>
	<li>Cura de PDMS para pelo menos 1 h em estufa a 60 ° C e esfriar até a temperatura ambiente. Retire o papel alumínio contendo o PDMS mestre e curado da placa de Petri. Com cuidado, retire a folha de alumínio na parte de trás do mestre e, em seguida, Retire cuidadosamente o PDMS com o mestre. Nota: Como alternativa, PDMS podem ser curadas durante a noite à temperatura ambiente. A relativa fragilidade de um mestre de bolacha de silicone pode ser superada usando adesivo epóxi de vínculo permanentemente o wafer de uma polegada de 1/16-disco de alumínio de espessura do mesmo tamanho como a bolacha.</li>
	<li>Como uma bolacha normalmente inclui vários dispositivos microfluídicos com dimensões ligeiramente diferentes (ver arquivo complementar 1), corta um único dispositivo de tamanho usando um bisturi limpo e afiado. Nota: Para a rotina de trabalho de b. subtilis , use dispositivos com trincheiras de célula 1.0-µm de largura, que são marcadas com um C ou F no arquivo CAD que acompanha.</li>
</ol>2. dispositivo de perfuração e de ligação
<ol><li>Lugar um pedaço de escritório translúcido fita (ver Tabela de materiais) sobre lado padrão do dispositivo para aumentar a visibilidade das características padronizadas. As portas de entrada e saída são identificadas como áreas circulares em lados opostos dos canais fluídico visíveis (Figura 1). Para melhorar a sua visibilidade quando fazendo buracos no dispositivo para os pinos de entrada e de saída, marque as entradas e saídas com pontos usando um marcador de ponta fina. Nota: Para garantir que os pinos de entrada e saída não estão lotados, todos os outros canais é um soco, começando com o canal sob o designador alfabética para o dispositivo.</li>
	<li>Inverter o dispositivo PDMS para que lado padrão é baixo e perfurar o dispositivo para os pontos marcados usando um soco biópsia 0.75 mm; Descarte o punchings. Nota: Os dispositivos são perfurados com lado padrão para baixo porque o buraco gerado pelo soco biópsia normalmente é ligeiramente queimado onde o soco entra o polímero. Socar o dispositivo em uma orientação invertida garante que o buraco no lado padrão possui uma borda afiada.</li>
	<li>Usando um estereomicroscópio, certifique-se que os furos perfurados se sobrepõem com as áreas de entrada e saída do dispositivo. Use uma pinça de ponta fina para remover quaisquer fragmentos alheios de PDMS dos furos perfurados.</li>
	<li>Use fita adesiva para remover poeira de ambos os lados do dispositivo e local em uma placa de Petri limpa poliestireno. Prepare um vidro de tampa 22 x 40 mm, molhando com 100% de álcool isopropílico e esfregando com uma limpeza de salas limpas; seco com um fluxo de ar livre de poeira ou de azoto.</li>
	<li>Coloque o perfurado PDMS dispositivo recurso lado acima juntamente com o vidro limpo em um plasma de oxigênio líquido de limpeza.<ol>
<li>Plasma-tratar o dispositivo com as seguintes configurações: vácuo, mTorr 70; Ó2 pressão, mTorr 200; duração, 15 s; poder, 30 w. imediatamente depois que termina o período de tratamento de plasma, remover o dispositivo e a tampa de vidro do plasma líquido de limpeza.</li>
		<li>Inverta o PDMS e colocá-lo no centro da tampa de vidro, para que lado padrão entra em contato com o vidro; Certifique-se de que os canais de alimentação (correndo entre as áreas de entrada e saída) estão alinhados com o eixo longo do vidro tampa. Pressione suavemente para garantir que os selos PDMS contra o vidro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asse o dispositivo montado em um forno pelo menos 1 h a 60 ° C. Após o cozimento, verificar manualmente que o PDMS é ligadas ao vidro, empurrando suavemente em um canto do dispositivo. Nota: Uma vez que o dispositivo é ligado, ele deve ser usado em 24h, como o polímero se tornará cada vez mais hidrofóbico com o aumento de tempo após o tratamento de plasma.</li>
</ol>3. Microfluidic encanamento preparação
<ol><li>Corte comprimentos de polímero (diâmetro interno (ID) 0,02 polegadas, diâmetro externo (OD) 0.06 polegadas) de tubos de comprimentos adequados a partir da bomba de seringa ao aparelho de comutação (se usado) e o dispositivo quando montado no microscópio. Corte como muitos comprimentos como existem microfluidic lanes.</li>
	<li>Montar Y entroncamentos para válvulas de pressão (se estiver usando), corte e anexando 2-cm comprimentos de silicone flexível, tubulação (0,03 polegadas ID, 0,065 polegada OD) para as farpas superiores do "Y" e comprimentos de 1 cm de tubo de silicone para o barb inferior do "Y".</li>
	<li>Corte de 10 cm (ou apropriados) comprimentos de tubagem de polímero; conectá-los em uma extremidade para a junção de interruptor inserindo-os para os segmentos de tubulação do silicone 1 cm sobre o barb inferior do "Y". Conectá-los na outra extremidade para agulhas de 21G que foram removidos de seus adaptadores de seringa plástica e dobrados aproximadamente 90 ° aproximadamente 9 mm da extremidade da agulha.</li>
	<li>Agulhas sem corte 21G Conecte uma das extremidades dos segmentos de tubulação que será executado a partir as seringas ao aparelho de interruptor, inserindo as agulhas para o tubo. Insira as outras extremidades de cada comprimento de tubo dos segmentos de tubulação do silicone sobre as farpas de entrada dos cruzamentos a Y. Nota: Use algum tipo de aparelho para segurar as válvulas de pressão e as junções no lugar; Isto pode facilmente ser feito de uma caixa de dica micropipeta (Figura 2D).</li>
	<li>Comprimentos de tubo de polímero para transportar resíduos da tomada do dispositivo para um copo de resíduos de corte. Conectá-los em uma extremidade para agulhas torcidas de 21G preparado como descrito acima. Fita a outra extremidade dos tubos para um copo de resíduos.</li>
	<li>Preparar volumes adequados de meios contendo 0,1 mg/mL albumina de soro bovino (BSA) e preencher o tamanho desejado e o número de seringas. Conecte as seringas BSA-carregado para as agulhas de 21G preparado anexadas para as seringas de tubos e carga de entrada em bombas de seringa. Nota: para o típicos experimentos 5 canais do dispositivo são usadas, cada um com uma seringa de 20 mL. Um experimento em que o meio é comutado exigirá 2 bancos de 5 seringas cada. Aqui, a bomba que contém o primeiro banco é referida como a bomba de fase-1, e a bomba que contém o segundo banco, com o pós-interruptor médio, é conhecida como a bomba de fase-2.</li>
	<li>Purgue o ar do encanamento a entrada executando as bombas de seringa em uma taxa de fluxo elevada (> 500 µ l/min), começando orientando as bombas de seringa verticalmente e tocando as seringas para trazer as bolhas de ar no topo. Uma vez que o ar tem sido purgado das seringas, coloque a bomba de seringa na horizontal e, progressivamente, toque ou folhear as linhas de polímero de seringas de aparato interruptor para desalojar e remover bolhas de ar. Repita este processo para o segundo banco de seringas (se a mídia de comutação).</li>
	<li>Depois que as bolhas de ar são limpos, defina a bomba de seringa de fase-2 (ou seja, com o meio que será usado segundo, após o interruptor) de 1,5 µ l/min, então pausar o fluxo. Coloque clips de fichário pequeno para os segmentos de tubulação flexível no ramo das junções de Y correspondente à segunda fase média. Continuar a funcionar a bomba de seringa de fase-1 a uma taxa de fluxo modesto (por exemplo, 10 µ l/min) durante pelo menos 30 min limpar o meio segundo da tubagem de entrada a jusante da junção Y.</li>
</ol>4. preparação de cultura de células
<ol><li>Cresce um preculture da estirpe de interesse a médio desejado durante a noite, a fase estacionária. A estirpe bacteriana deve conter uma mutação que processa as células imóveis, para que as células não nadar fora dos canais do dispositivo. Nota: No presente protocolo, a estirpe bacteriana é b. subtilis 3610 contendo uma bruxaA233V substituição (esta mutação faz com que o flagelo ser em linha reta ao invés de motilidade celular helicoidal, impedindo), um PrsbV- mNeonGreen repórter para estresse celular e constitutiva repórter Phyperspank- mNeptune (vermelho) para destacar células. Meio de Lennox LB é usado no protocolo de exemplo. Estirpes típicas para experimentos de microfluídica contêm um ou mais repórteres transcriptional fluorescentes e uma proteína fluorescente citoplasmática, constitutivamente produzida para facilitar a detecção automatizada de células. Defeitos de crescimento não foram observados quando rico meio LB Lennox foi usado, mas crescimento de b. subtilis em media mínimos pode ser inibido sob condições microfluidic porque secretado sideróforos são lavados pelo fluxo médio. Sob tais circunstâncias, crescimento pode ser restaurado pela adição de citrato de sódio e cloreto férrico ao meio, conforme relatado por S750 médio11.</li>
	<li>A manhã do experimento, dilua as células de b. subtilis 01:50 para um perplexo balão de 250 mL contendo 25 mL do meio de crescimento. Crescem as células para 5-6 h em sacudir a cultura a 37 ° C, com uma densidade óptica de maior que 1. Nota: Uma cultura de células densas é preferível porque estacionária-fase b. subtilis células são menores e menos célula muitas vezes encontrada em cadeias, facilitando o carregamento do dispositivo. Diferentes espécies bacterianas podem exigir outras condições médio ou crescimento de carregamento ideal.</li>
	<li>Usando uma seringa, equipada com um filtro de tamanho dos poros de 5 µm, filtre cerca de 15 mL de cultura de células para um tubo cônico de 15 mL para remover cadeias de célula b. subtilis (é desnecessário para Escherichia coli e pode não ser necessário com outras espécies). Nota: Relativamente poucas células devem ser removidas; o filtrado deve ser turvo.</li>
	<li>Centrifugar a cultura filtrada por 10 min a 4.000 x g, à temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células no fluido sobrenadante residual remanescente no tubo, adicionando aproximadamente 500 µ l de meio fresco, se necessário, para facilitar a pipetagem a suspensão de eritrócitos.</li>
</ol>5. dispositivo carregamento
<ol><li>Coloque delicadamente vazia fina gel-carregamento micropipeta dicas (ver Tabela de materiais) para os orifícios de saída do dispositivo microfluidic.</li>
	<li>Usando pontas finas de gel de carregamento com uma micropipeta P200, passivate o dispositivo através da injeção de meio contendo 1 mg/mL BSA dentro dos orifícios de entrada, observando as dicas os orifícios de saída para monitorar o enchimento dos canais microfluídicos (Figura 2A). Incube o dispositivo à temperatura ambiente por cerca de 5 min. Nota: BSA é comumente usado como um bloqueio ou passivação agente que associará a superfície hidrofóbica do polímero PDMS, aumentando sua Hidrofilia e reduzindo a vinculação de outras proteínas ou células (através de moléculas de superfície celular).</li>
	<li>Usando pontas finas de gel de carregamento, carrega cada canal com as ressuspensa células (secção 4), usando as dicas no canal de saída para monitorar o progresso das células através do dispositivo (Figura 2B). Nota: O carregamento é facilitado definindo a P200 micropipeta para seu volume máximo 200 µ l e depois aspirar um coxim de ar antes de aspirar um pequeno volume (aproximadamente metade do volume da seção fina da ponta da pipeta) de células. O volume de ressuspensão células não precisa ser preciso, como o volume do dispositivo PDMS é pequeno em comparação com o da micropipeta. Sabemos de nenhum limite superior para a densidade das células ressuspensa, enquanto a suspensão de eritrócitos pode ser pipetada dentro do aparelho. Aglomerados de células podem obstruir o dispositivo e devem ser evitados por pipetagem completa e/ou mistura de vórtice.</li>
	<li>Remova suavemente as gel de carregamento dicas dos orifícios de saída, trabalhando um de cada vez para evitar danos ao dispositivo.</li>
	<li>Centrifugue o dispositivo numa bancada microcentrifuga em um adaptador apropriado do rotor a aproximadamente 6.000 x g durante 10 minutos (Figura 2). Nota: Utilizou-se um adaptador de rotor de alumínio usinadas personalizado que foi projetado para caber em um rotor de microcentrifuga (Figura 2); centrífuga de diferentes modelos pode ser usadas com adaptadores apropriados do rotor. A característica importante do adaptador é que ele fornece força lateral na direção das extremidades fechadas de trincheiras a célula, forçando as células nos canais de lado.</li>
	<li>Verificar carregamento bem sucedido sob o microscópio (Figura 3), mas sem a aposição do dispositivo para o slide titular/estágio inserir. Nota: No presente protocolo, um 60 X, 1.4 at Ph3 objectivo de imersão de óleo é usado para ambos verificação nesta fase e para a imagem latente subsequente.</li>
</ol>6. dispositivo montagem, equilibrio e montagem
<ol><li>Cuidadosamente, montar o dispositivo carregado para uma inserção de palco gravando o vidro de cobertura em ambos os lados do PDMS para a parte inferior da inserção da fase (ou seja, inverter a fase de inserção antes de fixar o dispositivo). Inverter o assembly de inserção-dispositivo de palco para que o PDMS é voltada para cima e coloque sobre uma superfície macia, como uma limpeza livre de poeira (Figura 2D).</li>
	<li>Ajustar a vazão da bomba de seringa de fase-1 a 35 µ l/min. trabalhando com uma faixa de cada vez, inserir a agulha de entrada e, em seguida, a agulha de tomada (i.e., a correr para o recipiente de resíduos; Figura 2E).</li>
	<li>Limpe qualquer excesso de meio com uma toalhita de limpeza livre de poeira e inspecione visualmente o dispositivo para detectar possíveis vazamentos. Examine a tubulação de saída para o aparecimento de células em excesso (geralmente aparece como uma listra turva) e o menisco médio, que lentamente se moverá para o recipiente de resíduos.</li>
	<li>Permita que o dispositivo para executar em 35 µ l/min por aproximadamente 15-30 min, até que todas as pistas conectadas estão drenando para o copo de resíduos.</li>
	<li>Conjunto da bomba de seringa de fase-1 a 1,5 µ l/min e pausar o fluxo. Traga todo o aparelho bomba e dispositivo para o microscópio (este processo é auxiliado por colocá-lo todo em um carrinho de rolamento) e reiniciar o fluxo médio de 1,5 µ l/min. montar cuidadosamente a inserção do palco com o dispositivo em um microscópio de fluorescência invertido, fase-1 usando fita conforme necessário para rotear os tubos de saída e de entrada.</li>
	<li>Localizar posições desejadas no dispositivo para tratamento de imagens e começar a imagem conforme desejado. Observe que células tipicamente requerem algumas horas (aproximadamente 10 gerações) para atingir o estado estacionário fase exponencial de crescimento, e o início da aquisição de imagens pode ser retardado como desejado para que a imagem começa após o período de equilíbrio. Nota: O crescimento de estado estacionário de células em fase exponencial deve ser verificado durante a análise de imagem posterior acompanhamento de tempos de divisão celular e assegurando que eles chegaram a um valor mínimo constante.</li>
</ol>7. médias de comutação
<ol><li>Entre as sucessivas rodadas de imagiologia, pause o fluxo da bomba de seringa de fase-1. Com cuidado, solte os grampos da pasta de silicone fase 2 tubulação, movendo-se a cada um para o tubo do silicone na fase-1 filial da junção Y. Un-pausa o fluxo da fase-2 seringa da bomba (que foi definida como 1,5 µ l/min na etapa 3.8) e continuar a imagem latente. Nota: A 1,5 µm/min com um comprimento de 10 cm de polímero tubulação a jusante dos cruzamentos do Y, o meio da segunda fase atinge o dispositivo em aproximadamente 50 min. O tempo para o dispositivo pode ser empiricamente testado usando meios que contêm partículas de marcador fluorescente.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo de microfluídica é flexível, em que muitos dos passos podem ser modificados para otimizar o seu uso com uma determinada espécie ou cepa ou para uma finalidade específica. Com efeito, neste protocolo, fizemos modificações para o original de "máquina de mãe" conceito4 para otimizar seu uso com b. subtilis. Muitas vezes, as trincheiras em que as células estão confinadas constituem um recurso de camada única, Considerando que neste protocolo usamos trincheiras da dois-camada ce...

Uma das características mais marcantes da vida na terra é sua grande resiliência e variedade. Um objetivo central da biologia molecular é entender a lógica pela qual células usam genes e proteínas para maximizar seu crescimento e aptidão sob uma ampla variedade de condições ambientais. Para atingir este objetivo, os cientistas devem ser capazes de observar com confiança como células individuais crescem, dividem e expressam seus genes sob um determinado conjunto de condições, observando como as células respondem às alterações subsequentes no seu ambiente. No entanto, os métodos analíticos tradicionais em microbiologia têm limitações técnicas que afetam os tipos de perguntas que podem ser abordados. Por exemplo, em massa baseada em cultura análises foram muito úteis ao longo dos anos, ainda oferecem somente os dados de nível populacional que podem mascarar variações significativas de célula para célula ou os comportamentos de menores sub-populações de células na população total. Análises de célula única de bactérias de vida baseadas em microscopia de luz revelam o comportamento de célula única, mas também são tecnicamente limitadas. Bactérias normalmente são imobilizadas em almofadas de agarose contendo meio de crescimento, mas multidões de crescimento e divisão de pilha a visão microscópica e esgota os nutrientes disponíveis após poucos ciclos de célula, limitando substancialmente o tempo de observação1, 2. Além disso, a local depleção de nutrientes e o concomitante acúmulo de subprodutos metabólicos devido ao crescimento celular estão mudando constantemente o ambiente de crescimento celular local de maneiras que são difíceis de medir ou prever. Tais mudanças ambientais usando almofadas de agarose representam um desafio para estudos de comportamentos de estado estacionário ou de respostas celulares para alterações específicas nas condições de crescimento3.
Microfluidic tecnologia, no qual um meio líquido é continuamente fluiu através de dispositivos microfabricated, oferece uma solução para limitações experimentais clássicas. Um dispositivo microfluidic pode manter células individuais em posição para microscopia de viver-pilha quando o fluxo do meio de crescimento constantemente fornece as células com nutrientes frescos e lava subprodutos metabólicos e células em excesso, criando assim um crescimento altamente uniforme meio ambiente. Sob condições de constante crescimento, observam-se comportamentos de célula isolada da influência de fatores ambientais, permitindo uma vista desimpedida da lógica interna das células. Como o fluxo de fluido impede que o dispositivo microfluidic tornando-se repleto de células, observação de linhagens de célula única para dezenas ou centenas de gerações torna-se possível4,5. Estes tempos de longa observação permitam a detecção de comportamentos de célula a longo prazo ou raro caso contrário indetectável. Finalmente, a composição do meio que flui através do dispositivo pode ser alterados no Irão, permitindo que as células a serem observados como eles respondem ao aparecimento de um estresse ou para a introdução ou remoção de um determinado composto.
Microfluídica já tem desfrutado de um número de aplicações importantes. Por exemplo, ela tem sido usada em tecido, órgão ou dispositivos de corpo-em-um-microplaqueta, em que vários tipos de células humanas são co cultivados para simular na vivo condição6; para o estudo do movimento de nematoides em ambientes microstructured7; para examinar as interações entre biofilmes bacterianos (e.g., 8); e para o encapsulamento e a manipulação de pequenos volumes de células ou de produtos químicos (por exemplo, 9). Dispositivos microfluídicos também tornaram-se cada vez mais populares no campo da microbiologia (para excelentes críticas, ver 10 e 11), especialmente como seu físico e propriedades de fluxo são bem-acompanhado para nichos microbianos naturais12. Por exemplo, microfluídica foi recentemente empregada por microbiologistas para tais fins como medir precisamente celular crescimento e divisão13,14,15, analisando o patógeno movimento16, monitoramento de sensoriamento de quórum17 e transições fisiológica18e para proteína contando com19, entre muitos outros exemplos. O método apresentado aqui é projetado especificamente para a análise de linhagens única célula bacteriana, ao invés de combinações de cepas ou espécies. O dispositivo microfluidic demonstrado aqui utiliza uma variação do "máquina de mãe" projeto4, em que as células são cultivadas arquivo único dentro de uma trincheira microfluidic com uma extremidade fechada e uma aberta; divisão e crescimento celular empurra as células descendentes cima e para fora a extremidade aberta para o fluxo de fluido. Nossas análises geralmente se concentram apenas na célula "mãe" que está confinada na extremidade fechada da trincheira. Consideramos este método como um avanço sobre anteriores leves baseado em microscopia célula única técnicas analíticas, tais como imobilização de células em almofadas de agarose. Enquanto b. subtilis é usado como um modelo aqui, o método também é aplicável a outras espécies de bactérias (Escherichia coli é um outro modelo comum; algumas espécies com tamanhos diferentes de célula ou morfologias podem exigir a fabricação de novos dispositivos com dimensões diferentes). O uso de repórteres fluorescentes para marcar células e visualizar as alterações na expressão gênica requer o uso de espécies geneticamente tractable; no entanto, análises de crescimento celular e morfologia são possíveis mesmo sem marcadores fluorescentes.
O presente protocolo exclui o processo de fabricar o mestre de silício usando photolithography, que tem sido amplamente descrito em outra parte5; mestres também podem ser facilmente terceirizados de microfabrication instalações. Ele inclui o molde de um dispositivo PDMS de um mestre de silicone reforçado; ligação do dispositivo com um pedaço de vidro de tampa; montando o microfluidic entrada e saída encanamento, incluindo pitada válvulas para permitir a comutação médio; passivação do dispositivo, preparando as células bacterianas e carregar o aparelho com as células bacterianas; anexar o encanamento para o dispositivo e desenroscada as células; e carregar o dispositivo em um microscópio de fluorescência para a imagem latente. Porque muitos imagem diferente de aquisição e processamento de software ferramentas podem ser usadas para visualizar e analisar dados diferentes de interesse4,5, imagens de exemplo são mostradas, mas os métodos de captura de imagem não estão incluídos neste protocolo.

<table><tbody><tr><td>Kit de elastômero de silicone Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>Isso é chamado de PDMS no protocolo. Existem 2 componentes que são misturados na proporção de 10:1</td></tr><tr><td>punção de biópsia de 0,75 mm</td> World <td>Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm Vidro de cobertura nº 1,5</td><td>VWR</td><td>48393 172</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Etch PE-50</td><td>Plasma Etch Inc.</td><td>Instrumento PE-50</td><td>usado para ligar PDMS ao vidro usando tratamento de plasma de oxigênio</td></tr><tr><td>Tubulação flexível Tygon ID 0,02", OD 0,06"</td> <td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>AAD04103</td><td>Para a parte principal da tubulação, por exemplo, presa às agulhas</td></tr><tr><td>Tubulação de silicone, 0,04" ID, 0,085" OD</td><td>Tubulação de silicone padrão HelixMark</td><td>60-795-05</td><td>Para válvulas de aperto e conexão de junção em Y</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>Usado como agente de passivação</td></tr><tr><td>ART Gel Pipet Tips (P200)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>2155</td><td>Para carregar o dispositivo com meio e células</td></tr><tr><td>Filtro de seringa Acrodisc de 32 mm com 5-&mu; m Supor membrana</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4560</td><td>Para filtrar culturas antes do carregamento do dispositivo</td></tr><tr><td>Agulhas rombas de 21 ga,</td> conector Y <td>McMaster-Carr</td><td>75165A681</td><td></td>de 1</tr>" <tr><td>com farpas da série 200, tubulação de identificação de 1/16", polipropileno</td><td>Nordson Medical</td><td>Y210-6005</td><td>A empresa é AKA Value Plastics</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td></td><td>Esta unidade foi descontinuada pelo fabricante e é substituída pela Ti 2 E.</td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis cepa NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td><td>cepa parental de tipo selvagem modificada para uso nos experimentos mostrados neste protocolo</td></tr><tr><td>Forno de convecção por gravidade</td><td>VWR</td><td>414005-106</td><td>para cura PDMS e cozimento montado dispositivos</td></tr><tr><td>Scotch-Weld Epoxy Kit</td><td>3M</td><td>2216 B/A</td><td>pode ser usado para unir um wafer de silício a uma placa de apoio de alumínio</td></tr><tr><td>Fita adesiva Scotch, 3/4" de largura</td><td>3M</td><td></td><td>para limpar a poeira dos dispositivos PDMS e para colocar sobre recursos para aumentar a visibilidade (denotado "fita de escritório" ou "fita adesiva" no protocolo)</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>listado aqui como um exemplo; quase qualquer estereomicroscópio fará</td></tr><tr><td>álcool isopropílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td>Para limpar a tampa de vidro</td></tr><tr><td>Bomba de serra, 6 canais</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>uma marca de lenços umedecidos sem poeira</td></tr></tbody></table>

célula única microfluidic análise de bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic tecnologia supera muitas das limitações que os métodos analíticos tradicionais em microbiologia. Ao contrário de métodos de cultura de massa, oferece resolução de célula única e longa observação vezes abrangendo centenas de gerações; ao contrário de agarose baseada em almofada microscopia, tem condições de crescimento uniforme que podem ser rigidamente controladas. Porque o fluxo contínuo de meio de cultura isola as células em um dispositivo microfluidic de variações imprevisíveis no ambiente químico local causada pelo crescimento celular e metabolismo, autênticas alterações na expressão gênica e crescimento celular em resposta a estímulos específicos podem ser observados com mais confiança. Bacillus subtilis é usado aqui como uma espécie de bactéria modelo para demonstrar uma máquina de"mãe"-digite o método para análise de celular. Mostramos como construir e interpretar um dispositivo microfluidic, carregá-lo com células, iniciar a geração de imagens microscópica e expor as células a um estímulo, passando de um meio para outro. Um repórter de stress-responsivo é usado como um exemplo para revelar o tipo de dados que podem ser obtidos por esse método. Nós também brevemente discutir aplicações desse método para outros tipos de experimentos, tais como análise de esporulação bacteriana.

Bem sucedida célula inicial de carregamento, avaliada por microscopia de contraste de fase, antes de fixar o encanamento microfluidic o dispositivo, seria considerada como tendo todos ou quase todos os canais do lado microfluidic contendo uma ou mais células bacterianas ( Figura 3A). Carga ideal mostraria várias células em cada canal, mas canais, no entanto, vão encher de células devido a crescimento celular durante o período de equilíbrio (<strong class="xfi...

Apresentamos um método de análise microfluidic de linhagens de células bacterianas individuais usando Bacillus subtilis como exemplo. O método supera deficiências dos métodos tradicionais de análise em microbiologia, permitindo a observação de centenas de gerações de células sob condições de crescimento firmemente controlável e uniforme.

Célula única Microfluidic análise de Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

O objetivo geral desta configuração experimental microfluídica é permitir a observação de longo prazo de células bacterianas individuais sob condições ambientais constantes e altamente controladas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia bacteriana, como quais são os padrões de resposta de longo prazo de células individuais ao estresse ou como um fenótipo heterogêneo em uma população varia com o tempo. A principal vantagem dessa técnica é que podemos observar linhagens celulares individuais por dezenas ou mesmo centenas de gerações, sob condições ambientais constantes, uniformes e altamente controladas.Depois de preparar o polímero PDMS de acordo com o protocolo de texto, coloque um mestre de silicone em um pedaço de folha de alumínio intacta em uma placa de Petri de poliestireno. Despeje a mistura PDMS desgaseificada sobre o mestre a uma profundidade de aproximadamente cinco milímetros. Em seguida, desgaseifique o prato por pelo menos 10 minutos.Cure o PDMS em um forno a 60 graus Celsius por pelo menos uma hora e resfrie-o à temperatura ambiente. Em seguida, remova a folha de alumínio contendo o PDMS mestre e curado da placa. Marque-o com cuidad

single-cell-microfluidic-analysis-of-bacillus-subtilis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve um modelo de co-cultura microfluídicos para a cultura simultânea e localizada de células epiteliais e bactérias. Este modelo pode ser usado para investigar o papel dos diferentes sinais moleculares solúveis na patogênese, bem como tela a eficácia do suposto probiótico cepas bacterianas.

Microfluídicos Co-cultura de células epiteliais e bactérias para a Investigação Solúvel sinal mediada por interações

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para monitorar o comportamento de células individuais de diferentes bactérias no tempo usando automatizado de microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Além disso, fornecem diretrizes como analisar as imagens de microscopia.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

Biofilmes microbianos são geralmente constituídos por subpopulações distintas de células especializadas. De célula única análise destas subpopulações requer a utilização de repórteres fluorescentes. Aqui nós descrevemos um protocolo para visualizar e monitorar vários...

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Célula única Microfluidic análise de Bacillus subtilis

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