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As enzimas são catalisadores bioquímicos essenciais para a vida. Ensaios enzimáticos são usados para estudar as propriedades cinéticas de reações enzimáticas, elucidando os efeitos catalíticos das enzimas. Este vídeo abordará a cinética e os ensaios enzimáticos, abordará um procedimento geral e mostrará algumas aplicações.
As enzimas são proteínas, ou menos frequentemente RNAs, que atuam em um reagente específico, conhecido como substrato. Uma enzima reduz a energia de ativação necessária para iniciar uma reação bioquímica, fazendo com que a reação ocorra em um ritmo mais rápido.
As reações enzimáticas podem ser divididas em três componentes elementares. A primeira é a formação do complexo enzima-substrato, formado pela ligação do substrato ao sítio ativo da enzima. O complexo pode se decompor em seus constituintes originais. Esta é a segunda reação elementar. Alternativamente, o complexo pode formar o produto e recuperar a enzima, a terceira reação elementar.
A cinética de uma reação elementar é dada pela equação da lei de taxa elementar. As equações da lei de taxa fornecem a taxa em termos da concentração dos reagentes e uma constante de taxa. Cada uma das reações elementares tem uma equação de lei de taxa individual, com sua própria constante de taxa. Essas equações podem ser destiladas em um modelo cinético conhecido como equação de Michaelis-Menten. Isso dá a taxa de reação em termos de concentração do substrato; que pode ser determinado experimentalmente. Algumas tendências gerais para reações enzimáticas podem ser identificadas usando a equação de Michaelis-Menten. Em alta concentração de substrato, um ponto de saturação é atingido, chamado Vmax. Aqui, a taxa é limitada pela concentração total da enzima e pelo número de moléculas de substrato que uma enzima converte em produto por determinado tempo, também conhecido como kcat. Na cinética de Michaelis-Menten, kcat é uma das duas constantes que governam a taxa de reação. A outra constante, KM, é conhecida como constante de afinidade. KM também é equivalente à concentração em que a taxa de reação é equivalente a meio Vmax . Uma enzima com maior afinidade terá um KM mais baixo e atingirá Vmax mais rapidamente, enquanto uma enzima com menor afinidade terá um KM mais alto e levará mais tempo para atingir Vmax. Conhecer kcat e KM permite que as enzimas sejam comparadas. Para fazer isso, usamos uma proporção chamada eficiência enzimática. Maior kcat e menor KM resultam em maior eficiência, enquanto menor kcat e maior KM resultam em menor.
Os fatores usados para elucidar a cinética enzimática devem ser determinados experimentalmente. Esses ensaios são normalmente realizados misturando uma solução enzimática e substrato em um ambiente controlado. As observações são feitas medindo as mudanças na concentração do substrato, produto ou subprodutos em relação ao tempo.
A mudança na concentração ao longo do tempo é usada para determinar a taxa de reação. Para determinar a cinética, os dados da taxa devem ser obtidos em várias concentrações. Se um gráfico da taxa inicial inversa versus concentração inicial inversa, conhecido como gráfico de Lineweaver-Burk, for linear, a reação segue a cinética de Michaelis-Menten. A inclinação e a interceptação da linha permitem a determinação dos parâmetros cinéticos KM e Vmax, que podem então ser usados para calcular o kcat e a eficiência da enzima.
Agora que os princípios da cinética enzimática foram discutidos, vejamos como um ensaio enzimático típico é realizado.
Neste procedimento, um ensaio colorimétrico é demonstrado. ? O primeiro passo é gerar uma curva padrão, que correlacionará a absorbância com a concentração do substrato. Preparam-se soluções de concentração conhecida juntamente com uma amostra de controlo. Uma solução de revelação que reage com o substrato é adicionada para produzir um composto colorido. A absorbância é medida e plotada em relação à concentração para gerar a curva padrão.
Para realizar o ensaio, uma concentração conhecida de substrato é preparada junto com a quantidade apropriada de enzima. A enzima e o substrato são misturados e deixados incubar por um intervalo de tempo definido. O pH e a temperatura são controlados com soluções tampão e blocos de aquecimento. Um agente de têmpera é adicionado para interromper a reação. A solução do desenvolvedor é então adicionada às reações e misturada. As soluções são então colocadas em cubetas e a absorbância é medida. A quantidade de substrato consumida é determinada comparando a absorbância medida com a curva padrão. Usando os dados coletados, as taxas de reação iniciais são determinadas plotando a concentração ao longo do tempo. Finalmente, com os dados de taxa e concentração, o gráfico de Michaelis-Menten é feito. Isso permite a determinação das propriedades cinéticas da enzima, como número de rotatividade e eficiência enzimática.
Agora que revisamos um procedimento de ensaio, vamos ver outras maneiras pelas quais os ensaios são realizados e suas aplicações.
Neste procedimento, a análise FRET é usada para estudar a cinética de uma protease hidrolisando uma ligação peptídica de uma proteína. Essas emissões podem ser medidas, permitindo uma análise contínua e quantitativa do consumo e produção de substrato, auxiliando na determinação da cinética da reação.
Os ensaios enzimáticos podem ser usados na ciência ambiental para determinar os níveis de atividade enzimática extracelular no ambiente. Águas, solos e sedimentos podem ser coletados do meio ambiente e processados em laboratório. A atividade enzimática extracelular desses materiais pode então ser caracterizada usando ensaios enzimáticos. Esta é uma ferramenta útil para entender como o ambiente processa o material orgânico.
O mecanismo de reparo do DNA de uma célula pode ser avaliado estudando a cinética das enzimas encontradas no núcleo. A taxa na qual uma enzima remove lesões ou danos ao DNA pode ser medida usando balizas moleculares fluorescentes, que só fluorescem quando ligadas a sequências de DNA únicas. O nível de reparo do DNA pode ser medido em tempo real, detectando os produtos de clivagem marcados com fluorescência.
Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre cinética e ensaios enzimáticos. Este vídeo explicou a cinética enzimática, abordou conceitos de ensaio, abordou um procedimento geral e descreveu algumas aplicações.
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