Ligadura do colédoco parcial no Mouse: um modelo controlado da colestase obstrutiva localizada
28 de março de 2018
Aqui, apresentamos a ligadura parcial biliar como modelo cirúrgico de lesão hepática e regeneração em roedores.
O objetivo geral desta intervenção cirúrgica é observar os efeitos da colestase obstrutiva localizada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da hepatologia sobre como identificar mecanismos de regeneração hepática. A principal vantagem dessa técnica é que comparações significativas podem ser feitas entre o lobo experimental ligado e o lobo de controle não ligado dentro do mesmo animal.
Demonstrando o procedimento hoje estará o Dr. Toshimasa Nakao, um pós-doutorado do laboratório de cirurgia de transplante. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um camundongo C57 preto 6 anestesiado de oito a 12 semanas de idade, raspe a região abdominal com uma máquina de cortar cabelo e coloque o animal sob um microscópio cirúrgico. Prenda os membros à mesa e use cotonetes estéreis para desinfetar sequencialmente a área cirúrgica com 0,3 a 0,5 mililitros de iodopovidona e etanol a 70%.
Em seguida, faça uma incisão na linha média do xifóide ao púbis e use um micro afastador para abrir a cavidade abdominal. Use uma pinça de mosquito para retrair o xifóide em direção à cabeça do camundongo e use argila macia para manter a pinça e o xifóide nesta posição. Hidrate a cavidade abdominal com um a dois mililitros de PBS esterilizado a 37 graus Celsius e use cotonetes úmidos para mover suavemente o intestino delgado em direção à cabeça do camundongo.
Corte os ligamentos entre o intestino delgado e o retroperitônio para evitar danificar o tecido e envolva os intestinos delgado e grosso com uma esponja de gaze não tecida úmida. Coloque o tecido intestinal no lado caudal da cavidade abdominal e use uma pequena esponja de gaze não tecida úmida para retrair suavemente todo o fígado em direção ao xifóide para expor o hilo hepático e o ligamento hepatoduodenal. Localize o hilo hepático, o ducto biliar comum no lado ventral da veia porta e os ductos biliares hepáticos esquerdo e direito que drenam para a confluência biliar principal no hilo hepático.
Usando uma sutura de náilon 10-0 e o lado rombudo de uma agulha de sutura, ligue o lobo do ducto biliar hepático esquerdo. Quando a sutura for colocada, retorne os intestinos delgado e grosso à sua localização anatômica e confirme a falta de torção intestinal ou sangramento intra-abdominal. Em seguida, remova a pinça de mosquito, feche separadamente as camadas muscular e cutânea com suturas contínuas de Vicryl 4-0 e coloque o mouse sob uma lâmpada de calor com monitoramento até a recuperação total.
A comparação das bioquímicas hepáticas séricas entre camundongos ligados ao ducto biliar parcial e camundongos ligados ao ducto biliar completo transgênicos para agregação de proteína hepática insolúvel revela lesão hepática mínima ou colestase nos camundongos ligados ao ducto biliar parcial e lesão grave e acúmulo de enzimas nos animais transgênicos ligados ao ducto biliar completo. Como os camundongos submetidos à ligadura parcial do ducto biliar desenvolveram colestase obstrutiva específica do lobo ao longo do tempo, o lobo ligado parece ligeiramente mais pálido 14 dias após a cirurgia em comparação com os lobos não ligados que mantiveram sua cor marrom avermelhada escura normal. O lobo ligado também demonstra um aumento na proliferação e fibrose do ducto biliar em comparação com os lobos não ligados em resposta à colestase localizada induzida pela ligadura.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 10 a 12 minutos se for executada corretamente. Seguindo este procedimento, outros métodos, como rastreamento de linhagem, podem ser usados para responder a perguntas adicionais sobre o homing de células-tronco em locais de lesão hepática e regeneração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer comparações significativas usando a ligadura parcial do ducto biliar para identificar efeitos locais versus sistêmicos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta a ligadura parcial do ducto biliar como um modelo cirúrgico para o estudo de lesão e regeneração hepáticas em roedores. O método permite a observação de colestase obstrutiva localizada e seus efeitos sobre os mecanismos hepáticos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Hepatologia
- Regeneração hepática
- Modelos cirúrgicos
Contexto
- Compreender a lesão hepática e a regeneração é fundamental na hepatologia.
- A colestase obstrutiva localizada pode fornecer informações sobre os mecanismos hepáticos.
- Estudos comparativos dentro do mesmo animal aumentam a confiabilidade dos resultados.
- Este modelo é particularmente útil para estudar a dinâmica da recuperação hepática.
Objetivo do Estudo
- Observar os efeitos da ligadura parcial do ducto biliar sobre a lesão hepática.
- Identificar os mecanismos envolvidos na regeneração hepática.
- Estabelecer um modelo cirúrgico confiável para estudos hepatológicos futuros.
Métodos Utilizados
- Utilização de camundongos C57 black 6 anestesiados para o procedimento.
- Depilação e desinfecção da região abdominal antes da cirurgia.
- Imobilização das patas na mesa cirúrgica para garantir estabilidade.
- Realização da cirurgia sob microscópio cirúrgico para obter precisão.
Resultados Principais
- Demonstrou a viabilidade do modelo cirúrgico.
- Estabeleceu um método para comparar lobos hepáticos ligados e não ligados.
- Forneceram informações sobre os processos regenerativos do fígado.
- Facilitou pesquisas adicionais sobre os mecanismos de lesão hepática.
Conclusões
- A ligadura parcial do ducto biliar é um modelo valioso para o estudo de lesões hepáticas.
- A técnica permite comparações controladas dentro do mesmo organismo.
- Estudos futuros podem se basear neste modelo para explorar ainda mais a regeneração hepática.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A ligadura parcial do ducto biliar (pBDL) fornece um modelo controlado para o estudo da colestase obstrutiva localizada, permitindo a comparação direta entre lobos hepáticos ligados e não ligados no mesmo animal. Esse delineamento com controle interno reduz a variabilidade, diminui o uso de animais e apoia a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos em hepatologia. A abordagem aumenta a confiança preditiva ao isolar respostas específicas do lobo à acumulação biliar e às vias de fibrose.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas a lesões hepáticas localizadas e vias de regeneração.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos ao comparar respostas específicas por lobo à colestase em ambientes genéticos e ambientais idênticos.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao distinguir efeitos sistêmicos dos efeitos localizados de fármacos sobre a proliferação dos ductos biliares e a fibrose.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas validados relevantes para doenças para padronização de ensaios subsequentes, utilizando leituras bioquímicas específicas de lobo.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de controles internos, reduzindo a necessidade de grupos simulados separados e minimizando a variabilidade entre animais.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em modelos pré-clínicos que investigam mecanismos de medicamentos e migração celular em contextos colestáticos.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao modelar colestase obstrutiva humana com proliferação de ductos biliares e fibrose específicas por lobo.
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao permitir estudos de rastreamento de linhagem e de homing de células-tronco após a ligadura.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de prosseguir ou interromper ao quantificar respostas de biomarcadores locais versus sistêmicos aos componentes biliares retidos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
pBDL se insere no continuum de descoberta que vai da validação de alvos até a pesquisa pré-clínica, especialmente para programas voltados à hepatologia que investigam mecanismos de lesão hepática e respostas regenerativas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a comparação entre lobos ligados e não ligados para isolar os efeitos locais da colestase.
- Triagem: Fornece sistemas biológicos prontos para ensaios com resultados quantificáveis, como bioquímica hepática sérica e alterações histológicas na proliferação dos ductos biliares.
- Análises: Oferece medidas quantitativas de variáveis dependentes, incluindo níveis enzimáticos, coloração dos lobos e escores de fibrose, para comparar condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao apoiar análises pós-cirúrgicas, como o rastreamento de linhagem, para estudar o recrutamento de células-tronco para locais de lesão.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma cirúrgica reutilizável para estudar os efeitos de medicamentos e mecanismos celulares em modelos de doenças hepáticas localizadas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir ambiguidades mecanicistas por meio de comparações internas entre lobos.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e reprodutibilidade ao eliminar a variabilidade entre animais por meio de controles intra-animais.
- Valor Estratégico: Aumenta a eficiência do capital ao reduzir perdas e despesas com animais em comparação com modelos de ligadura completa do ducto biliar.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao distinguir toxicidade localizada do fármaco de efeitos hepáticos sistêmicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microcirurgia e acesso a microscópios cirúrgicos para a ligadura precisa do ducto biliar hepático esquerdo.
- Depende de instrumentação, incluindo suturas de náilon 10-0, pinças do tipo mosquito e ferramentas para manutenção de campo estéril.
- Necessita padronização entre equipes nos procedimentos de monitoramento pós-operatório e coleta de amostras de bioquímica sérica.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o modelo para outras linhagens de camundongos ou investigar diferentes lobos.
- Limitado a estudos nos quais a obstrução lobo-específica é suficiente para modelar a condição humana de interesse.
