Name: Ligadura do colédoco parcial no Mouse: um modelo controlado da colestase obstrutiva localizada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: Aprenda a técnica de ligadura parcial do colédoco em camundongos C57BL/6 para estudar colestase obstrutiva localizada e regeneração hepática. Este modelo cirúrgico permite comparar lobos ligados e não ligados no mesmo animal.

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Dr. Khan reconhece apoio de concessão da K12HD052892 NIH/FORMULADORES, a Alpha-1 Foundation, Fundação Hillman e centro de pesquisa do fígado de Pittsburgh. Dr. Michalopoulos reconhece apoio de concessão do NIH/NIDDK P01DK096990. Agradecemos a assistência técnica excelente e generosa de Anne Orr. Nós também estamos gratos ao Dr. David A. Geller para fornecer acesso ao laboratório de microcirurgia do transplante/roedor.

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes éticas do Comité de uso da Universidade de Pittsburgh e institucional Cuidado Animal.
1. básicas técnicas e procedimentos comuns
<ol><li>Autoclave todo equipamento microcirúrgico antes do uso.</li>
	<li>Para evitar matar o rato pela anestesia, verificar cuidadosamente seu padrão de respiração.</li>
	<li>Órgãos de toque e intestinos o mínimo possível para evitar danificar os órgãos e causando sangramento. Pressione pontos de sangramento com cotonetes de algodão molhado ou esponjas de gaze.</li>
	<li>Use cotonetes de algodão molhado para manipulação suave dos órgãos. Esponjas de gaze molhada, não-tecidos são utilizadas em dois tamanhos, 3.5 × 3,5 cm e 6,0 × 6,0 cm. usam o menorzinho para retrair o fígado inteiro. Use o maior para embrulhar os intestinos pequenos e grandes.</li>
</ol>2. pré-operatória preparação
<ol><li>Use Camundongos c57/b6 do sexo masculino, 8-12 semanas de idade (quando o peso do corpo é aproximadamente 20-35 g) para ligadura parcial de ducto biliar.</li>
	<li>Permitir que os ratos livre acesso à água e comida até a indução da anestesia.</li>
</ol>3. parcial biliar ligadura operação
<ol><li>Anestesia o mouse, colocando o animal em uma câmara de indução com uma mistura de 1,5-2,0% de isoflurano e 1 L/min de oxigênio. Monitore o animal cuidadosamente observando-se a taxa de respiração. Quando a taxa de respiração do animal é uma respiração por segundo, o rato é bem anestesiado. Desde que o reflexo de retirada do membro dianteiro desaparece mais rapidamente, aperte o pé do membro posterior também para confirmar a ausência completa do reflexo de retirada. Os olhos devem ser lubrificados com um agente lubrificante oftálmico para evitar úlceras da córnea. Nota a primeira dose de analgésico pode ser dado pré-operatório para prevenir a estimulação dos receptores de dor.</li>
	<li>Raspar a parede abdominal com máquina de cortar cabelo e coloque o mouse em cima da mesa cirúrgica sob o microscópio cirúrgico. Corrigi todos os membros para a mesa com a fita. Use a inalação de isoflurano para manter o rato sob anestesia geral.<ol>
<li>Ajustar o vaporizador de isoflurano e usar isoflurano 2.0-3.0% para indução.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando cotonetes estéreis, desinfectar a parede abdominal primeiro com 0,3-0,5 mL de iodo-povidona aplicado topicamente, seguido por 70% de etanol. Animal deve ser coberto com um pano estéril.</li>
	<li>Fazer uma longa abdominal incisão do xifoide até o púbis, usando a tesoura e pinça Adson. Depois de fazer a incisão abdominal, reduzir isoflurano 0.8-1.0% para manutenção.</li>
	<li>Expor na cavidade abdominal por meio de um Microafastador. Segure o xifoide com pinça mosquito e retrair-se em direção a cabeça do rato. Fixar a pinça mosquito com argila macia.</li>
	<li>Instilar 1 a 2 mL de aquecida (37 ° C) esterilizado fosfato salino (PBS) na cavidade abdominal para evitar ferir os órgãos abdominais. Segure o intestino delgado com compressas de algodão molhado e retrair-os suavemente em direção a cabeça do rato. Corte os ligamentos entre o intestino delgado e o retroperitônio para evitar ferir o intestino delgado (figura 1A).</li>
	<li>Enrole os intestinos pequenos e grandes com uma gaze molhada, não-tecidos. Coloque-os no lado caudal da cavidade abdominal. Intestinos, envolvidos em gaze estéril podem ser colocados no Campo drapeado estéril para evitar contaminação.</li>
	<li>Gentilmente retrai o fígado inteiro em direção a xifoide usando um pequeno molhado não-tecido de gaze para expor o Hilo hepático e ligamento hepato-duodenal (figura 1B).</li>
	<li>Verificação para confirmar a anatomia do hilo hepático. O ducto biliar comum está localizado no lado ventral da veia portal. Confirme os locais do direito e o ducto biliar hepático esquerdo, que drenam para a confluência biliar principal no hilo hepático.</li>
	<li>Identificar o ducto biliar hepático esquerdo que drena o lobo esquerdo e cercá-lo com uma sutura de nylon 10-0 usando o lado sem corte de uma agulha de sutura (Figura 2A). Evite ferir a superfície hepática, artéria hepática e veia porta.</li>
	<li>Ligate do ducto biliar esquerdo com nylon 10-0. (Figura 2B).</li>
	<li>Coloque os intestinos pequenos e grandes na mesma posição que antes da operação, usando cotonetes de algodão molhado.</li>
	<li>Confirmar que não há nenhuma torção intestinal e hemorragia abdominal e, em seguida, feche o músculo e a pele em duas camadas com vicryl 4-0. Sutura trançada (Vicryl) foi usada para fechamento da pele, mas é preferível monofilamento para reduzir a probabilidade de infecção. Nota: Feche a fáscia por sutura contínua do xifoide ao púbis e fechar a pele por sutura contínua do púbis ao xifoide.</li>
	<li>Pare de anestesia depois de fechar a incisão.</li>
</ol>4. acompanhamento e tratamento pós-operatório
<ol><li>Só após a cirurgia, beliscar a pele dorsal do mouse e injetar Buprenex (0,1 mg/kg) e cefazolina (100 mg/kg) por via subcutânea, seguido por Buprenex injeção cada 12 h por 3 dias e cefazolina cada 24 h por 3 dias respectivamente11,12 ,13. Nota a primeira dose de analgésico pode ser dado pré-operatório para prevenir a estimulação dos receptores de dor. Cefazolina e outros antibióticos de peri-operatório são necessários apenas para animais imunitário suprimido, como aqueles usados em estudos de transplante. Nota: Se a cirurgia é realizada com êxito, o mouse geralmente se recupera dentro de 30 min. actividade dos ratos será quase o mesmo que a condição pré-operatória.</li>
	<li>Verifique os ratos diariamente por sinais de aflição.<ol>
<li>Sacrifica os ratos pelo deslocamento cervical sob anestesia geral para adquirir fígados e outras amostras de tecido em pontos de tempo definido (isto é, 7, 14, 21 dias) depois de pBDL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Higgins, G. M., Anderson, R. <a target="_blank" href="https://www.scienceopen.com/document?vid=57858414-5eff-4c8d-a028-ccb3fc1c44a6">Experimental pathology of the liver - Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal.</a> Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).</li>
<li>Cameron, G. R., Oakley, C. L. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/path.1700350512/abstract">Ligation of the common bile duct.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 35 (5), 769-798 (1932).</li>
<li>Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+bile+duct+obstruction%3A+a+new+experimental+model+for+cirrhosis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat.</a> Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).</li>
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<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propitious+role+of+bone+marrow-derived+mononuclear+cells+in+an+experimental+bile+duct+ligation+model%3A+potential+clinical+implications+in+obstructive+cholangiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Surg+Int%22%5BJournal%5D)">Propitious role of bone marrow-derived mononuclear cells in an experimental bile duct ligation model: potential clinical implications in obstructive cholangiopathy.</a> Pediatr Surg Int. 29 (6), 623-632 (2013).</li>
</ol>

Os autores têm sem divulgações.

Embora cBDL é a mais comum técnica experimental para colestase obstrutiva, pode apresentar vários desafios em roedores. Dependendo do número de dias pós-operatórios necessários para alcançar um ponto de extremidade, os animais podem experimentar significativa morbidade e mortalidade que o tempo avança. O grau de lesão tecidual e necrose biliar é ainda agravado quando se trabalha com alguns modelos de rato transgénico de doença hepática, que demonstram o parênquima hepática anormal e função na linha de base. Comparado a c...

Modelos cirúrgicos da lesão hepática aguda e reparação, tais como hepatectomy parcial ou ligadura do ducto biliar comum (cBDL), têm sido utilizados há décadas em roedores para estudar a regeneração hepática e Patobiológico1,2. Em cBDL, é ligado o ducto biliar comum (que drena todas bile produzida no fígado), resultando em colestase obstrutiva, inflamação e fibrose nas primeiras 2-3 semanas após a cirurgia, com eventual progressão para cirrose3. Proliferação do ducto biliar, transdiferenciação celular e indução de células progenitoras de fígado residente são também características da cBDL4,5. Embora cBDL elucida mecanismos específicos de cholangiopathy obstrutiva, que são bem caracterizados com resultados reprodutíveis em ratos do selvagem-tipo e nessas cepas com fígados normal6,7,8, o procedimento pode ser tecnicamente exigente em alguns modelos de rato transgénico, doenças do fígado, que exigem mais animais do que o previsto devido à maior morbidade e mortalidade de obstrução biliar, ao longo do tempo. Esta técnica é também benéfica para estudar doença de ratos transgénicos com subjacentes fígado, que não pode tolerar senão o stress das experiências de curso prolongado após cBDL.
pBDL pode fornecer uma alternativa razoável para ajudar a superar alguns desses desafios. Estudos de pBDL inicial em ratos do selvagem-tipo visa distinguir localmente atuante e sistêmicos de mediadores da inflamação9. De pBDL, confluência biliar principal de direita e esquerdas hepáticas biliares acima o ducto biliar comum com cuidado é visualizada no hilo, e apenas esquerdo hepático ducto biliar é ligado para gerar uma colestase obstrutiva localizada. pBDL oferece várias vantagens para cBDL. De pBDL, unligated lóbulo direito serve como um controle interno forma idêntica correspondente para o lobo esquerdo ligado, sujeitado para os mesmos efeitos sistêmicos, tais como o estado nutricional ou fatores de circulação. Embora mediadores pró-inflamatórios sistêmicos estavam presentes, Osawa et al observou menos fibrose e necrose dos lóbulos unligated, mas aumento de células inflamatórias e expressão de crescimento fator-β transformador do lóbulo ligados9.
Mais recentemente, foi redefinido para estudar efeitos parenquimatosos hepáticas da bile retida10pBDL. Usando o mesmo animal para controle interno (unligated "sham") e grupos experimentais, pBDL metades efetivamente o número de animais necessários por experiência, que por sua vez, é mais rentável. Os ratos toleram os efeitos de pBDL muito melhor, para que o tempo ideal de curso experimentar (≥2 semanas) podem ser alcançadas no lóbulo ligado. Mais importante ainda, pBDL pode distinguir efeitos directos de colestase da colestase obstrutiva e retidos componentes da bile no lóbulo ligado, em comparação com o lobo de unligated controle. Em geral, pBDL é um método atrativo para estudar efeitos específicos do lóbulo da colestase localizada no fígado.

<table><tbody><tr><td>Microscópio-Leica Wild M650, 6&ndash; 40 vezes; ampliação</td><td>Leica Microsystems</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador de enchimento de funil de isoflurano Tec 3</td><td>Serviços de Anestésico Geral</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Stevens Tenotomia Tesouras</td><td>Cirúrgicas Precisas & Scientific Instruments Corporation</td><td>ASSI.9193</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forceps</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinça hemostática delicada clássica Mosquito</td><td>Codman</td><td>30-4472</td><td></td></tr><tr><td>Micro-retrator</td><td>Murdock; Roboz Instrumento Cirúrgico</td><td>RS-6550</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gaze não tecida</td><td>Fisherband</td><td>870-PC-DBL</td><td></td></tr><tr><td>Puritan 6" Pequeno Cotonete de Algodão com Cabo de Madeira</td><td>Puritan Medical Products Company</td><td>868-WCS</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS Fórceps - Pontas Padrão/Reto/Inox/13.5cm</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11203-23</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS Fórceps - Pontas Padrão/Angular 45&deg;/Inox/13.5cm</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas - 3mm Cutting Edge</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Porta-microagulhas</td><td>Aesculap Surgical Instruments</td><td>FD231R</td><td></td></tr><tr><td>Micro AROSuture, sutura de nylon estéril 10-0, 70 &micro; m, pontos TAP</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>T4A10N07</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J662H</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 5 ml</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos Falcon, 60 & 15 mm</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) líquido para inalação, 250 ml</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex injetável (cloridrato de buprenorfina)</td><td>Reckitt Benckiser Pharmaceuticals</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolina para injeção, USP</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-238-61</td><td></td></tr><tr><td>PVP scrub solution (povidona&ndash; iodo 7,5%)</td><td>Medline</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato sem cálcio ou magnésio</td><td>LONZA</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Sirius Red</td><td>Sigma</td><td>365548</td><td></td></tr><tr><td>Hematolxilina</td><td>Fisher (Richard-Allan Scientific)</td><td>22-050-111 (7211)</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Anatech (Fisher)</td><td>832 (NC9686037)</td><td></td></tr> <tr><td>Formalina</td><td>Fisher</td><td>SF100-20</td><td></td></tr></tbody></table>

ligadura do colédoco parcial no mouse: um modelo controlado da colestase obstrutiva localizada

Partial Bile Duct Ligation in the Mouse: A Controlled Model of Localized Obstructive Cholestasis

Em roedores, ligadura do colédoco completa (cBDL) do ducto biliar comum é uma técnica cirúrgica estabelecida para estudar a proliferação de colestase e ducto biliar obstrutiva. No entanto, as experiências a longo prazo podem levar a aumento da morbidade e mortalidade. Em cepas do mouse selecione com doença hepática subjacente, uma comparação significativa pode ser feita mesmo com ligadura de um único lóbulo do fígado, que pode reduzir as despesas e perdas de animais. Aqui, descrevemos a ligadura parcial de ducto biliar (pBDL) no rato, no qual é ligado somente à esquerda hepático ducto biliar, causando obstrução biliar no lobo esquerdo, mas não os lóbulos remanescentes. Com cuidado técnica microcirúrgica, experimentos de pBDL podem ser rentáveis, desde que o lobo unligated serve como um controle interno para os lóbulos ligados, quando submetidos às mesmas condições no mesmo animal. Ao contrário da cBDL, um grupo de controle de operação separado não é necessário. pBDL é altamente útil diretamente comparar localizada contra efeitos sistêmicos de colestase e outros componentes da bile retida. pBDL também pode ser reaproveitado como um novo método para investigar os mecanismos relacionados a medicamentos e a migração celular.

Para este experimento típico, pBDL foi realizado em ratos transgénicos triplicados PiZ, que recapitular a doença do fígado humana encontrada na deficiência de alfa-1 antitripsina (A1AT). O rato de PiZ overexpresses um transgene consiste em múltiplos fragmentos genomic do DNA que contêm as regiões codificação do gene humano mutante de A1AT e promotor, em conjunto com os intrões e ~ 2 kilobases de upstream e downstream flanqueiam regiões14, <sup class="xr...

Aqui, apresentamos a ligadura parcial biliar como modelo cirúrgico de lesão hepática e regeneração em roedores.

Ligadura do colédoco parcial no Mouse: um modelo controlado da colestase obstrutiva localizada

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile ...

O objetivo geral desta intervenção cirúrgica é observar os efeitos da colestase obstrutiva localizada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da hepatologia sobre como identificar mecanismos de regeneração hepática. A principal vantagem dessa técnica é que comparações significativas podem ser feitas entre o lobo experimental ligado e o lobo de controle não ligado dentro do mesmo animal.Demonstrando o procedimento hoje estará o Dr. Toshimasa Nakao, um pós-doutorado do laboratório de cirurgia de transplante. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um camundongo C57 preto 6 anestesiado de oito a 12 semanas de idade, raspe a região abdominal com uma máquina de cortar cabelo e coloque o animal sob um microscópio cirúrgico. Prenda os membros à mesa e use cotonetes estéreis para desinfetar sequencialmente a área cirúrgica com 0,3 a 0,5 mililitros de iodopovidona e etanol a 70%.Em seguida, faça uma incisão na linha média do xifóide ao púbis e use um micro afastador para abrir a cavidade abdominal. Use uma pinça de mosquito para retrair o xifóide em direção à cabeça do camundongo e use argila macia para manter a pinça e o xifóide nesta posição. Hidrate a cavidade abdominal com um a dois mililitros de PBS esterilizado a 37 graus Celsius e use cotonetes úmidos para mover suavemente o intestino delgado em direção à cabeça do camundongo.Corte os ligamentos entre o intestino delgado e o retroperitônio para evitar danificar o tecido e envolva os intestinos delgado e grosso com uma esponja de gaze não tecida úmida. Coloque o tecido intestinal no lado caudal da cavidade abdominal e use uma pequena esponja de gaze não tecida úmida para retrair suavemente todo o fígado em direção ao xifóide para expor o hilo hepático e o ligamento hepatoduodenal. Localize o hilo hepático, o ducto biliar comum no lado ventral da veia porta e os ductos biliares hepáticos esquerdo e direito que drenam para a confluência biliar principal no hilo hepático.Usando uma sutura de náilon 10-0 e o lado rombudo de uma agulha de sutura, ligue o lobo do ducto biliar hepático esquerdo. Quando a sutura for colocada, retorne os intestinos delgado e grosso à sua localização anatômica e confirme a falta de torção intestinal ou sangramento intra-abdominal. Em seguida, remova a pinça de mosquito, feche separadamente as camadas muscular e cutânea com suturas contínuas de Vicryl 4-0 e coloque o mouse sob uma lâmpada de calor com monitoramento até a recuperação total.A comparação das bioquímicas hepáticas séricas entre camundongos ligados ao ducto biliar parcial e camundongos ligados ao ducto biliar completo transgênicos para agregação de proteína hepática insolúvel revela lesão hepática mínima ou colestase nos camundongos ligados ao ducto biliar parcial e lesão grave e acúmulo de enzimas nos animais transgênicos ligados ao ducto biliar completo. Como os camundongos submetidos à ligadura parcial do ducto biliar desenvolveram colestase obstrutiva específica do lobo ao longo do tempo, o lobo ligado parece ligeiramente mais pálido 14 dias após a cirurgia em comparação com os lobos não ligados que mantiveram sua cor marrom avermelhada escura normal. O lobo ligado também demonstra um aumento na proliferação e fibrose do ducto biliar em comparação com os lobos não ligados em resposta à colestase localizada induzida pela ligadura.Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 10 a 12 minutos se for executada corretamente. Seguindo este procedimento, outros métodos, como rastreamento de linhagem, podem ser usados para responder a perguntas adicionais sobre o homing de células-tronco em locais de lesão hepática e regeneração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer comparações significativas usando a ligadura parcial do ducto biliar para identificar efeitos locais versus sistêmicos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Aprenda a técnica de ligadura parcial do colédoco em camundongos C57BL/6 para estudar colestase obstrutiva localizada e regeneração hepática. Este modelo cirúrgico permite comparar lobos ligados e não ligados no mesmo animal.

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