Ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA)

EMSA, o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética, também conhecido como ensaio de deslocamento de gel, é um procedimento bioquímico versátil e sensível. A EMSA elucida a ligação entre proteínas e ácidos nucléicos detectando uma mudança nas bandas na eletroforese em gel.

Este vídeo descreve os princípios da EMSA, fornece um procedimento geral e discute algumas aplicações.

A replicação, transcrição e reparo do DNA, bem como o processamento de RNA, são processos bioquímicos críticos. Todos eles envolvem a ligação entre proteínas e ácidos nucléicos. Muitas doenças e distúrbios graves estão associados a modificações nessa ligação. EMSA é uma técnica para determinar qualitativamente se uma proteína específica se liga a um ácido nucléico específico. Primeiro, o ácido nucléico é marcado, geralmente com fósforo-32 radioativo, para criar uma sonda. Em seguida, a proteína de teste e a sonda de ácido nucleico são misturadas. Quando uma proteína se liga a uma sonda de ácido nucléico, o complexo resultante tem maior massa e uma conformação diferente do ácido nucléico sozinho.

Uma vez ligados, os complexos são analisados com eletroforese em gel. Nesta técnica, um campo elétrico força as macromoléculas a migrar através de uma matriz de gel. Os componentes se separam com base na massa, carga e conformação. A eletroforese pode separar complexos proteína-DNA de sondas não ligadas. Como eles têm massas e conformações diferentes, eles migrarão através do gel em taxas diferentes e se separarão. A separação é facilmente detectada, graças à presença do fósforo radioativo, e prova que a proteína se liga com sucesso ao ácido nucléico fornecido. Para verificar a identificação da proteína, um "ensaio supershift" usa um anticorpo com uma afinidade conhecida com a proteína. Isso tem o benefício adicional de mudar ainda mais a resolução complexa e crescente.

Agora que vimos os princípios, vamos vê-los no laboratório.

Para iniciar o procedimento, a proteína deve ser isolada. Para fazer isso, técnicas de biologia molecular são usadas para expressar a proteína nas células e depois purificar.

O ácido nucléico é amplificado e marcado para criar uma sonda. A marcação é feita por meio de incubação por 10 min com dCTP contendo fósforo-32 radioativo. São necessários uma bancada de trabalho à prova de radiação e equipamento de proteção.

O gel é então preparado. O gel precisa ser não desnaturante, para evitar que a proteína altere a conformação e potencialmente se desligue da sonda durante a eletroforese. Os géis de poliacrilamida têm tamanhos de poros de 5 a 20 nm e são úteis para sondas curtas de até 100 pares de bases de comprimento. Os géis de agarose têm tamanhos de poros de 70-700 nm e são úteis para sondas maiores.

Com a sonda de proteína e ácido nucleico agora preparada, procedemos à ligação. Uma solução tampão TRIS é preparada e a proteína e a sonda são adicionadas. O pH deve ser semelhante às condições fisiológicas e a concentração de sal suficiente para evitar que a proteína forme ligações fracas com ácidos nucléicos não-alvo. A reação prossegue por 20-30 min a 4 ?C.

O próximo passo é a eletroforese. Um tampão de baixa força iônica e um pH semelhante ao usado na reação de ligação é utilizado. Ele produz um "efeito de enjaulamento" que estabiliza os complexos, aumenta a mobilidade e reduz a geração de calor. Após a eletroforese, os componentes do gel são transferidos para o papel de filtro. Em uma sala escura, o papel de filtro é então exposto ao filme. Se a proteína se ligar à sonda, duas regiões marcadas distintas serão visíveis na transferência. Um representando o complexo e um separado representando a sonda não ligada. A separação demonstra que a proteína se ligou com sucesso ao ácido nucléico.

Agora que vimos o procedimento básico, vamos dar uma olhada em alguns aplicativos.

A cromatina é o complexo compactado de DNA e proteínas encontradas nas células eucarióticas. As enzimas de remodelação da cromatina modificam a estrutura para abrir o DNA à transcrição. Como isso altera a mobilidade do complexo, a EMSA pode ser usada para explorar a atividade de ligação da enzima.

Uma abordagem alternativa para a rotulagem aproveita a interação entre o DNA e a enzima metiltransferase. Um cofator pode ser modificado para se ligar permanentemente ao DNA via metiltransferase. Em vez de marcar com fósforo-32, o cofator é conjugado à biotina, o que é vantajoso porque não é radioativo. Como o cofator é específico do local em sua ligação, ele é relevante para a genotipagem, detecção de metilação e entrega de genes. Os ácidos nucléicos biotinilados são detectados por fluorescência ultravioleta.

Quando estímulos ambientais ativam histidina quinases, um "regulador de resposta" é fosforilada. Isso, por sua vez, se liga ao DNA, afetando a transcrição, que pode ser estudada pela EMSA. Por exemplo, um regulador de resposta em? Desulfovibrio vulgaris demonstrou se ligar ao gene de interesse. A EMSA foi usada para verificar se a ligação ocorreu.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética. Agora você deve entender seus princípios de operação, as etapas de seu procedimento e seus principais parâmetros operacionais.

Obrigado por assistir!