Name: Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprenda uma técnica modificada de injeção de células-tronco embrionárias que aumenta a produção de quimeras sem equipamentos adicionais. Este método simples melhora a eficiência laboratorial e reduz o tempo para transmissão germinativa em estudos de biologia do desenvolvimento.

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Esta pesquisa foi apoiada [em parte] pelo programa de pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional de Ciências de saúde ambiental. Agradecimento especial a Shyamal Peddada para análise estatística. Gostaríamos também de agradecer Humphrey Yao, Gary Bird e Yuki Arao para revisão deste manuscrito, e Franco DeMayo por seu contínuo apoio e conselhos.

Todas as operações foram feitas como parte da operação normal da instalação NIEHS Knock Out Mouse Core. Todos os ratos foram mantidos em um 12:12 ciclo h luz: escuro e foram alimentar uma dieta de NIH-31 e água ad libitum. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com o Comité de utilização do nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental e cuidado Animal.
1. preparação animal
<ol><li>Raça de ratos do doador, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J ratos fêmeas em 8-10 semanas de idade naturalmente a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J camundongos machos entre 8 e 26 semanas de idade. Verificar visualmente se conecta na manhã seguinte (E0.5).</li>
	<li>Raça de ratos destinatários, Swiss Webster ratos fêmeas entre 6 e 9 semanas de idade são naturalmente criados para camundongos machos de Swiss Webster vasectomizados. Verificar visualmente se conecta na manhã seguinte (E0.5).</li>
</ol>2. preparação da pilha ES
<ol><li>Para as células de AB2.2 ES 129-derieved, cultura de células em DMEM suplementado com 15% FBS, 1% glutamina, 1% Penn/estreptococos e 0,1% β-Mercaptoetanol. Cultura de todas as outras células ES segundo as instruções do fornecedor de celular ES, usando seus protocolos recomendados.</li>
</ol>3. embrião coleção
<ol><li>
Dissecação de animais
	<ol>
<li>Preparar vários pratos de 60 mm, aproximadamente 1 por 5 ratos mais 3 extra, com mídia de coleção de explosão de 10 mL (BCM) (10% FBS em DMEM), e um 4 bom prato com 0,5 mL BCM por bem. Equilibrar a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Eutanásia em B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J camundongos fêmeas no E3.5 usando asfixia de CO2 , com um caudal de 10%.</li>
		<li>Após a eutanásia, coloque os ratos na posição supina e molhar o abdômen completamente com etanol a 70%.</li>
		<li>Façam a primeira incisão através da pele somente, no ponto médio do abdômen, fazendo a abertura tão ampla quanto possível. Em seguida abra através da parede abdominal, fazendo a incisão tão ampla quanto possível. Nota: A fazer isto em dois passos ajuda a reduzir ou eliminar a contaminação da pele.</li>
		<li>Começando com um ovário e segurando do tecido do ovário com fórceps rombudo, remover cuidadosamente o ovário, oviduto e útero, tomar cuidado extra para manter o tecido adiposo a um mínimo. Remova o útero como uma única unidade, ou como chifres individuais, com nenhuma mudança no procedimento a seguir.</li>
		<li>Após a remoção, coloque o útero em um prato de 60 mm que contém a mídia de coleção de explosão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Remoção do embrião
	<ol>
<li>Preparar uma seringa de 10ml cheia de BCM e se encaixam com uma agulha de 25 G.</li>
		<li>Um útero de cada vez, removê-los do prato de exploração do BCM, exterminá-los em um lenço de papel para remover o excesso de sangue e coloque em um prato de 60 mm em um pequeno aumento, microscópio de dissecção.</li>
		<li>Mantendo cuidadosamente e suavemente o útero, logo abaixo da extremidade distal (perto do oviduto) com pinça de dissecação, introduza a agulha para o centro do útero em como paralelo um avião quanto possível. Insira a agulha passando as pontas da pinça.</li>
		<li>Aplicar alguma pressão a pinça para segurar o útero para a agulha e expulsar aproximadamente 1 mL de BCM através do corno do útero. Nota: Tenha cuidado neste passo, como muita pressão na seringa causará um fluxo incontrolável de mídia, muitas vezes deixando o prato.</li>
		<li>Após a lavagem do útero, útero todo até 5 por prato de 60 mm, coloque o prato de volta na incubadora até coleção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colheita de embriões
	<ol>
<li>Usando uma pipeta de vidro estirado de mão e um aparelho de pipeta de boca, recolha blastocistos sob um escopo de dissecação, situado entre 25 X e 35 X. (Figura 1). Nota: Aparelho de pipeta boca consiste em 30-40 cm de tubo flexível, abaixo dos 5 mm identificação inserir um 1, 000 ponta da pipeta µ l, aponte primeiro em para uma extremidade e apor a pipeta de vidro nele. Adicione um filtro de seringa para a outra extremidade, com um anexo 1 cc seringa barril, sem atuador, para atuar como um pedaço da boca.</li>
		<li>Retirar pratos da incubadora e usando um padrão de grade, examinam cada parte do prato para embriões. Os embriões são escolhidos acima individualmente e coloque sobre a gota de BCM em um prato secundário.</li>
		<li>Após a coleta de todos os pratos, lavar os embriões mais uma vez em uma gota de BCM fresco e coloque no prato bem 4 para aguardar a injeção.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. o embrião injeção
<ol><li>Pegar as células ES individualmente com a agulha de injeção com base na confirmação.<ol>
<li>Preparar um prato de injeção pela adição de 5-7 mL de mídia de injeção (DMEM, 10% FBS e 20 mM HEPES) para um prato de injeção de fundo de vidro. As injeções são feitas à temperatura ambiente.</li>
		<li>Usando microinjector um ar ou óleo, aplica vácuo para a agulha de injeção para desenhar células ES no. Tome cuidado para manter-se como pouco espaço quanto possível entre as células. Conte as células ES aqui, ou na etapa de injeção.</li>
		<li>Selecione as células ES que são de médio a pequeno no tamanho em comparação com a população em geral de células, com uma superfície lisa e sem defeitos óbvios, tais como vacúolos. Nota: As populações de células ES variam grandemente em qualidade morfológica, e os padrões usados precisará ajustar com eles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injete embriões com aproximadamente 15 células ES (Figura 1).<ol>
<li>Anexar uma pipeta de exploração dica para uma segunda microinjector de ar e posicionar um embrião perto da abertura do titular. Aplica vácuo para fixar o embrião para o titular.</li>
		<li>Ajuste para o eixo z movendo a pipeta de exploração cima ou para baixo para que o embrião é apenas tocar o slide, seguido por bem, focando a zona. Em seguida, ajuste o eixo Z da agulha de injeção para que as células ES perto da ponta estão em foco.</li>
		<li>Ajuste o embrião agora empurrando suavemente desde a agulha de injeção na parte superior ou inferior, girando-o para colocar o ICM na posição desejada.</li>
		<li>Insira a agulha de injeção através da zona e o ICM ou o trofoblasto, usando uma pressão firme, mas controlada. Exercendo uma ligeira pressão para o microinjector da agulha de injeção para ajudar a manter o blastocoel de entrar em colapso.</li>
		<li>Uma vez que a agulha penetrou o blastocoel, aplica pressão do microinjector para transferir células ES para o blastocoel do embrião. Pausar brevemente como o bisel da agulha começa a sair o embrião para permitir que a pressão no embrião para voltar ao normal, mantendo ainda as células. Nota: Referência a células ES grupo foram injetada normalmente, seguindo um tradicional ES celular injeção protocolo9, tomando cuidado para não tocar o ICM. Pilhas do ES também foram injetadas através do ICM, empurrando a agulha diretamente através do ICM (TICM) (Figura 2filme suplementar).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. transferência de eEmbryos
<ol><li>Transferência de embriões de camundongos Swiss Webster em E2.5, usando um dispositivo de transferência de embriões não-cirúrgico, por procedimentos de fabricação. Este procedimento não-cirúrgico requer sem anestesia ou cuidado especial no pós-operatório. Ratos de casa individualmente após a transferência de embriões e pela entrega e desmame subsequentes.</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li>
<li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li>
<li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+knockout+mouse+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li>
<li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells%3A+A+Case+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li>
<li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+embryo%22">Manipulating the Mouse embryo</a>. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22Advanced+Protocols+for+Animal+Transgenesis%22">Advanced Protocols for Animal Transgenesis</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).</li>
<li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).</li>
</ol>

Os autores têm sem interesses concorrentes para divulgar.

Isso tem sido pensado que qualquer perturbação do ICM pode levar à mortalidade, na verdade, protocolos atuais de microinjeção de blastocisto ainda alertam para este12,13. O que mostramos aqui é que microinjeção através do ICM não é prejudicial para o embrião e aumenta o rendimento de quimeras.
O mecanismo exato para este efeito não foi identificado. No entanto, a ruptura mecânica do ICM, e o hipoblasto que acompanha, deve aumentar a in...

Por quase 25 anos, a criação de camundongos geneticamente alvo tem sido um processo lento, muitas vezes prejudicado por um gargalo na fase de microinjeção de blastocistos ES celular para a geração de germline transmitindo quimeras. Recentes avanços, incluindo CRISPR/Cas91,2 direcionamento em pilhas do ES e elevado-throughput ES celulares consórcios de geração como KOMP, melhoraram a geração/disponibilidade de células ES geneticamente modificadas. No entanto, a geração de quimeras germline continua a ser um gargalo na criação de ratos geneticamente modificados destas células de ES3,4. Projetos de geração de célula do elevado-throughput ES tem sido atormentados por alta variabilidade na qualidade de célula ES, que é fundamental para a criação bem sucedida do germline quimeras. Além disso, algumas das linhas celulares ES comumente utilizadas são conhecidas por aneuploidia alta e difícil produção do germline quimeras competente5.
Muitos métodos têm sido desenvolvidos para a criação de ratos com uma quimera ou superior, ou completamente ES células derivadas ratos6,7,8,9,10. Enquanto cada um desses sistemas tem seus próprios méritos, eles também têm suas falhas. A geração de quimeras tetraploide, enquanto gerar células de ES 100% derivado de ratos, é ineficiente e geralmente limitado a linhas outbred 5,6. Novos métodos de injeção de mórula podem gerar alta porcentagem de quimeras, quase 100%, mas geralmente requerem equipamento adicional significativo (lasers ou piezos) e formação de10,11. Nos laboratórios onde estas técnicas já estão em vigor, esta nova metodologia pode não ser necessária.
O objetivo do presente estudo foi encontrar um método que usa técnicas comuns e equipamentos disponíveis para aumentar a taxa de geração de Quimera, aumentando a chance de transmissão do germline do alelo mutante para estabelecer a colônia de rato subsequentes.

<table><tbody><tr><td>Agulha de injeção de células ES</td><td>Humagen</td><td>MSC-20-0</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo NSET</td><td>Paratechs</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (tecnologias de vida)</td> <td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (tecnologias de vida)</td> <td>10439-024</td><td>os lotes devem ser testados individualmente quanto à compatibilidade de células ES.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Micro manipulador</td><td>Leica</td><td>Micro manipulador</td><td></td></tr><tr><td>micro injetor</td><td>Eppendorf AG</td><td>Cell Tram Air 5176</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>4 prato de poço</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 60 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td></td></tr><tr><td>B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J</td><td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, EUA</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos Swiss Webster</td><td>Taconic, EUA</td><td>Tac:SW</td><td></td></tr><tr><td>Prato de Injeção</td><td>MatTek Corp.</td><td>P50G-0-30-F</td><td></td></tr></tbody></table>

trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Em um esforço para aumentar a eficiência na criação de ratos geneticamente modificados através de metodologias de célula ES, apresentamos uma adaptação para o atual protocolo de injeção de blastocisto. Aqui nós relatamos que uma simples rotação do embrião e injeção através de massa celular de Trans-interior (TICM) aumentou a porcentagem de ratos quiméricoes de 31% para 50%, sem nenhum equipamento adicional ou formação mais especializada. e mais uns 26 diferentes clones, e 35 totais clones foram injetados ao longo de um período de 9 meses. Não houve nenhuma diferença significativa entre as técnicas tradicionais de injeção e TICM na taxa de gravidez ou taxa de recuperação de embriões. Portanto, sem qualquer alteração importante no processo de injeção e um simples posicionamento do blastocisto e injetando através do ICM, liberando as células ES na cavidade blastocoel pode potencialmente aumentar a quantidade de produção quimérico e subsequente transmissão da linha germinal.

Tratamento de linha celular como o efeito aleatório, um modelo linear de efeitos mistos foi usado para analisar os dados no software (por exemplo, SAS (versão 9.2)). Cada análise controlada para o número de embriões transferidos e a linha celular. A segunda análise também controlada para o número de filhotes que sobreviveram.
Para este estudo, cada linha celular do ES e o clone foi injetado em ambos com tradicionais e técnicas T...

Aqui nós apresentamos um protocolo para aumentar a produção da Quimera sem o uso de novos equipamentos. Uma mudança de orientação simples do embrião para injeção pode aumentar o número de embriões produzidos e potencialmente reduzir a linha do tempo de transmissão da linha germinal.

Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

O objetivo geral deste procedimento modificado é aumentar a produção quimérica sem incorrer em custos adicionais ou longos períodos de treinamento. Este método pode ajudar os laboratórios a se tornarem mais eficientes na produção de quimeras, especialmente nos casos em que as células ES estão abaixo do ideal. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer nenhum equipamento adicional e nenhum treinamento especializado.Demonstrando o procedimento hoje estará Thomas Hagler. Ele é um biólogo e estudante de pós-graduação que trabalha no laboratório central. Para colher os embriões, seque o útero em um tecido de laboratório para remover o excesso de sangue e coloque o órgão em um novo prato de 60 milímetros sob um microscópio de dissecação de baixa ampliação.Usando uma pinça de dissecação para segurar o útero com cuidado e delicadeza perto do oviduto, insira uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de 10 mililitros contendo 10 mililitros de meio coletor de blasto no centro do útero, logo além das pontas da pinça, no plano mais paralelo possível. Aplique pressão na pinça para prender a agulha dentro do útero e lave suavemente aproximadamente um mililitro de meio através do c

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Devido ao córion duro e macio embriões, manipulação de embriões medaka está mais envolvido do que em zebrafish. Este vídeo mostra passo-a-passo os procedimentos de como manipular embriões medaka, incluindo dechorionation, montagem em agarose para a imagem latente e transplante de células para a produção de quimeras. Estes procedimentos são essenciais para a utilização medaka zebrafish e em um laboratório para tirar o máximo proveito de seus recursos complementares para a análise genética de...

Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

Usando ponta fina micropipetas injetamos DNA plasmídeo em subdomínios de somitos frango ou tubos neural. A concentração do plasmídeo é ajustada para gerar única células transfectadas. Em seguida, permitir que as células de se transformar em populações clonais.

Transfecção única célula em embriões de galinha

Demonstramos aqui que a reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) pode ser usado como uma ferramenta para gerar modelos de ratos com pré-definidos receptor de células T (TCR) especificidades. Estes ratos transnuclear expressar a TCR correspondente do seu lócus endógeno sob o controle do promotor endógeno.

Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Demonstramos um método para enxertar células cultivadas em locais definidos de embriões de camundongos iniciais para determinar seu potencial in vivo. Também introduzimos um método de eletroporação otimizado que usa capilares de vidro de diâmetro conhecido, permitindo a entrega precisa de DNA exógeno em algumas células dos embriões.

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Aqui apresentamos um protocolo para a conversão direta de fibroblastos embrionários murinos em células-tronco trofoblásticas totalmente funcionais e estáveis por meio da superexpressão de dez dias de Tfap2c, Gata3, Eomes e Ets2.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Descreveremos um protocolo para a realização de um transplante no utero (IUT) através de vias intravenosa e intra-amniótica de injeção no modelo murino. Este protocolo pode ser usado para introduzir células, vetores virais e outras substâncias em único ambiente fetal imune-tolerantes.

Intravenosa e Intra-amniótica no Utero transplante no modelo murino

Neste método, tecidos embrionários cardíacos são cirurgicamente microdissected, dissociado, fluorescente etiquetado e implantou em tecidos embrionários de anfitrião. Isto fornece uma plataforma para estudar a organização do desenvolvimento nível individual ou tecido sob condições hemodinâmicas gravidez ectópica, e/ou alterados parácrina/justácrina ambientes.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

O objetivo geral deste artigo é descrever como se apresentar na injeção intracelular ovo de materiais exógenos em embriões de frango. Essa abordagem é muito útil para estudar a biologia do desenvolvimento de embriões de frango.

Em Ovo Injeção intravascular em embriões de frango

Aqui apresentamos um protocolo para o desenvolvimento de modelos de camundongos geneticamente modificados usando células-tronco embrionárias, especialmente para grandes knock-in de DNA (KI). Este protocolo é ajustado usando a edição do genoma CRISPR / Cas9, resultando em eficiência de KI significativamente melhorada em comparação com o método convencional de direcionamento de DNA linearizado mediado por recombinação homóloga.

Direcionamento de genes altamente eficientes mediados por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias para o desenvolvimento de modelos de camundongos manipulados por genes

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