Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo

O objetivo geral deste procedimento modificado é aumentar a produção quimérica sem incorrer em custos adicionais ou longos períodos de treinamento. Este método pode ajudar os laboratórios a se tornarem mais eficientes na produção de quimeras, especialmente nos casos em que as células ES estão abaixo do ideal. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer nenhum equipamento adicional e nenhum treinamento especializado.

Demonstrando o procedimento hoje estará Thomas Hagler. Ele é um biólogo e estudante de pós-graduação que trabalha no laboratório central. Para colher os embriões, seque o útero em um tecido de laboratório para remover o excesso de sangue e coloque o órgão em um novo prato de 60 milímetros sob um microscópio de dissecação de baixa ampliação.

Usando uma pinça de dissecação para segurar o útero com cuidado e delicadeza perto do oviduto, insira uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de 10 mililitros contendo 10 mililitros de meio coletor de blasto no centro do útero, logo além das pontas da pinça, no plano mais paralelo possível. Aplique pressão na pinça para prender a agulha dentro do útero e lave suavemente aproximadamente um mililitro de meio através do corno uterino. Quando todos os blastocistos tiverem sido expelidos, monte o aparelho de pipeta bucal e use a pipeta bucal para transferir os embriões individuais em gotas únicas de meio de coleta de blasto em um segundo prato de 60 milímetros.

Em seguida, lave cada embrião em uma segunda gota de meio de coleta de brusco e transfira os embriões para um prato de quatro poços até a injeção. Para começar, use um microinjetor para aplicar vácuo na agulha de injeção. Coloque um prato de células ES sob o microscópio de injeção onde a agulha de injeção e a pipeta porta-embriões estão conectadas.

É essencial para o sucesso da injeção reservar um tempo para configurar adequadamente o microscópio. Isso inclui a quantidade adequada de mídia na agulha e o alinhamento correto do eixo z. Use um microinjetor para aplicar vácuo na agulha de injeção.

Mantendo o menor espaço possível entre as células, atraia células embrionárias de pequeno a médio porte de superfície lisa, sem defeitos óbvios, do prato de embriões. Depois de coletar pelo menos 15 células, posicione um embrião próximo à abertura do suporte. Aplique vácuo para prender o embrião ao suporte e mova a pipeta de retenção para cima ou para baixo para ajustar o eixo z até que o embrião esteja apenas tocando a lâmina.

Concentre-se bem na zona da pelúcia e ajuste o eixo z da agulha de injeção até que as células embrionárias próximas à ponta da agulha estejam em foco. Se necessário, utilize a agulha de injeção para rolar suavemente o blastocisto até que a massa celular interna esteja na posição apropriada para a injeção. Usando um empurrão firme, mas controlado, insira a agulha de injeção através da zona de pelúcida na massa celular interna e aplique uma leve pressão no microinjetor da agulha de injeção para ajudar a evitar que a blastocele entre em colapso.

Uma vez que a agulha tenha penetrado na blastocele, aplique pressão no microinjetor para transferir todas as células-tronco embrionárias para o embrião, fazendo uma breve pausa quando o chanfro da agulha começa a sair do embrião para permitir que a pressão no embrião volte ao normal enquanto ainda retém as células. Quando todos os blastocistos tiverem sido injetados, use um dispositivo de transferência de embriões não cirúrgico para entregar os embriões aos camundongos Swiss Webster estágio embrionário 2.5 de acordo com as instruções do fabricante e alojar os camundongos individualmente após cada transferência até o parto e desmame subsequente. Neste experimento representativo, as taxas de prenhez permaneceram inalteradas entre a massa de células trans internas injetadas e os grupos de controle tradicionalmente injetados e um número igual de filhotes sobreviveu ao desmame de cada grupo.

Notavelmente, enquanto o número de camundongos no desmame permaneceu inalterado, um número significativamente maior de filhotes do grupo injetado com massa celular interna trans exibiu quimerismo da cor da pelagem em comparação com o grupo de controle injetado. A melhor parte dessa técnica é que ela requer apenas uma simples mudança na orientação do embrião para facilitar uma maior produção em quimeras. A configuração adequada do microscópio é essencial.

Se o microscópio e os manipuladores não forem configurados corretamente e bem mantidos, o processo de injeção não funcionará. Se você é novo em injeções de embriões, a repetição é a única maneira de aprender. Para iniciantes, o manuseio do embrião tende a ser a parte mais difícil do procedimento.

Ser capaz de mover embriões de forma eficiente de um prato para outro sem perder nenhum é a parte mais crucial do experimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como uma simples mudança em sua técnica de injeção padrão pode ajudá-lo a se tornar mais eficiente na produção de quimeras.