4.14: Transferência de energia por ressonância Förster (FRET)

A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um fenômeno usado para investigar interações bioquímicas de perto. Na FRET, uma molécula fotoluminescente do doador pode transferir energia não radiativamente para uma molécula aceitadora se seus respectivos espectros de emissão e absorção se sobreporem. A quantidade de energia transferida — e, consequentemente, a emissão global da amostra — depende da proximidade de um par de moléculas fotoluminescentes aceitadoras e doadoras. A análise do FRET é combinada com outras técnicas de bioquímica para obter informações detalhadas de estruturas biomoleculares e interações a partir desta "régua espectroscópica".

Este vídeo abrange os princípios e conceitos da análise fret. O procedimento se concentra na preparação de amostras para fret e formas de apresentar e interpretar dados. Finalmente, as aplicações incluem monitorar processos conformais e celulares rotulando partes de uma célula ou proteína, monitorando reações enzimáticas que alteram estruturas proteicas e usando FRET para monitorar a agregação de monômeros expressos pelas células.

A transferência de energia de ressonância fluorescente, ou FRET, é uma transferência não radiativa de energia entre moléculas emissoras de luz e é frequentemente usada para investigar interações bioquímicas de curto alcance. O FRET ocorre apenas quando as moléculas fluorescentes estão espaçadas dentro de 10 nm uma da outra. A análise FRET pode ser combinada com outras técnicas para obter informações estruturais detalhadas. Este vídeo apresentará os princípios subjacentes do FRET, resumirá um protocolo e uma apresentação de dados e discutirá algumas aplicações bioquímicas.

Uma molécula fotoluminescente, como um fluoróforo, é excitada pela absorção de radiação eletromagnética em um comprimento de onda em seu espectro de absorção. À medida que relaxa, emite luz em um comprimento de onda dentro de seu espectro de emissão. Para obter mais informações sobre fluorescência, consulte o vídeo da JoVE sobre microscopia de fluorescência. Diferentes fluoróforos absorvem e emitem luz em diferentes comprimentos de onda, que frequentemente se sobrepõem. Se o espectro de emissão de um fluoróforo se sobrepõe significativamente ao espectro de absorção de outro fluoróforo, o "doador" liberará um fóton virtual, que é absorvido pelo "aceitador". Quando um doador excitado está a 10 nm de um aceptor, a energia é transferida do doador para o aceptor por interações dipolo-dipolo. A liberação de energia por emissão de luz do doador diminui correspondentemente. Enquanto isso, o aceitador excitado emite luz em seu comprimento de onda de emissão. A resposta FRET é avaliada em termos de eficiência, ou a porcentagem de energia liberada do doador por FRET e não por fluorescência ou outros processos radiativos. A eficiência depende fortemente da distância entre o doador e o receptor, o que permite que o FRET atue como uma régua 'molecular' ou 'espectroscópica'.

Em bioquímica, o FRET é frequentemente usado qualitativamente para observar mudanças conformacionais em moléculas, monitorando os fluoróforos à medida que eles se movem para dentro e para fora do alcance do FRET uns dos outros. Da mesma forma, as funções celulares podem ser estudadas com moléculas contendo um par FRET. Se a molécula marcada for clivada pela atividade enzimática, o FRET pára e o comprimento de onda de fluorescência observado muda.

Agora que você entende os princípios por trás do FRET, vamos dar uma olhada em uma visão geral de um protocolo e algumas maneiras de apresentar e interpretar os dados.

Antes do experimento, as biomoléculas de interesse, normalmente DNA ou proteínas, são projetadas com etiquetas fluorescentes, usando técnicas de biologia molecular. Formas comuns de introduzir o material genético modificado nas células incluem transfecção e eletroporação.

Em seguida, as células são preparadas para visualização de FRET em um microscópio de fluorescência. Por exemplo, as moléculas podem ser imobilizadas em uma lâmina para FRET de molécula única ou as amostras são carregadas em poços para triagem de alto rendimento.

Em seguida, os lasers de excitação, microscópio e equipamentos associados são preparados. (A) Os experimentos FRET geralmente envolvem lasers poderosos; (B) portanto, EPI e procedimentos de segurança apropriados devem ser usados. A amostra é então colocada no instrumento e iluminada com o laser de excitação.

Para experimentos que monitoram o comportamento celular, são usadas imagens coloridas mostrando diferenças ou mudanças na intensidade da emissão. As intensidades de emissão de doadores e aceitadores são plotadas juntas para rastrear a resposta do FRET ao longo do tempo.

Os dados FRET também podem ser ajustados a várias funções para análises mais complexas. Dependendo do experimento, os dados podem ser apresentados de várias maneiras para melhor representar os resultados, tornando o FRET uma ferramenta experimental flexível.

Agora que você está familiarizado com os fundamentos da execução e análise de um experimento FRET, vejamos algumas aplicações do FRET na pesquisa bioquímica.

O FRET pode ser usado para estudar mudanças conformacionais ou processos celulares, rotulando partes da proteína ou célula previstas para se moverem a 10 nm umas das outras com um par de FRET. Por exemplo, os sensores de proteína são preparados marcando receptores com um par de fluoróforos. A resposta FRET é monitorada ao vivo por microscopia confocal. A variação do comprimento de onda e da intensidade da emissão indica mudanças conformacionais.

O FRET também pode ser usado preparando moléculas com um par FRET ativo e observando mudanças na resposta. Quando o substrato é clivado, o FRET é interrompido, causando um aumento na emissão do doador e uma diminuição na emissão do aceptor. As emissões são analisadas para determinar as contribuições por doador, aceitador e FRET. Uma vez calculados os fatores de emissão direta para as proteínas fluorescentes ciano e amarelo, a concentração e os parâmetros cinéticos do substrato podem ser determinados.

As células projetadas para expressar monômeros contendo um par FRET funcionam como 'sensores' para interações entre esses monômeros. Se a agregação desses monômeros for induzida, uma resposta FRET é observada. Isso pode ser usado para investigar a agregação de proteínas desencadeada pela 'semeadura' de proteínas mal dobradas. Aqui, as células foram transduzidas com agregados da proteína de interesse, incubadas e analisadas com citometria de fluxo.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre Transferência de Energia de Ressonância Fluorescente, ou FRET. Este vídeo continha os princípios subjacentes do FRET, preparação e análise de um experimento FRET e algumas aplicações bioquímicas.

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