Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor
5 de abril de 2018
Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.
O objetivo geral deste protocolo é identificar de forma imparcial os padrões de estado de cromatina combinatória em tecidos tumorais e linhagens de células cancerígenas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética do câncer, como como os estados de modificação de histonas estéreis podem contribuir para a gênese do tumor. A principal vantagem dessa técnica é que várias modificações de histonas, bem como várias amostras, podem ser processadas simultaneamente e com eficiência.
Primeiro, dissocie 50 miligramas de tecido de melanoma manualmente e dois mililitros de Hank's Balanced Salt Solution ou HBSS, usando uma lâmina de barbear estéril. Pique o tecido em pedaços de três ou quatro milímetros por aproximadamente cinco minutos em uma placa de cultura de tecidos estéreis. Transfira a solução de tecido para um tubo dissociador e adicione mais oito mililitros de HBSS.
Dissocie ainda mais o tecido, usando um dissociador, até homogeneizar. Em seguida, reticule o tecido, adicionando 200 microlitros de formaldeído a 16% por três mililitros de HBSS. Usando um misturador, agite a mistura a 10 rpm por exatamente 10 minutos a 37 graus Celsius.
Depois de retirar a amostra da incubadora, adicione 200 microlitros de glicina tumoral por três mililitros de amostra e agite a mistura a 10 rpm por cinco minutos a 37 graus Celsius. Gire a amostra a 934 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius usando uma centrífuga de bancada. Quando terminar, remova o sobrenadante e adicione cinco mililitros de PBS gelado.
Em seguida, centrifugue novamente a amostra a 934 vezes g e remova o sobrenadante. Adicione 300 microlitros de tampão de colheita de ChIP com inibidores de protease por 50 miligramas de tecido e lise as amostras por 30 minutos no gelo. Enquanto as células estão lisando, ligue o disruptor de banho-maria e o sistema de resfriamento associado e deixe a temperatura atingir quatro graus Celsius.
Coloque o tubo sonicador no disruptor de banho-maria e sonice o tecido melanoma por 60 ciclos a 30 segundos ligado e 30 segundos desligado para obter fragmentos de cromatina de 200 a 600 pares de bases. Para oito miligramas de tecido de melanoma, incubar três microgramas de cada anticorpo histona com 20 microlitros de esferas magnéticas de proteína g e 100 microlitros de tampão bloqueador de ligação por duas horas a quatro graus Celsius com rotação, usando um revólver de tubo. Após a sonicação, dilua a amostra cinco vezes usando tampão de diluição ChIP para reduzir a concentração de SDS para 0,1% Após a conclusão da incubação dos grânulos magnéticos de anticorpos e proteína g, remova o tampão de diluição ChIP e suspenda novamente os grânulos em 240 microlitros do tampão fresco.
Em seguida, coloque alíquotas de 20 microlitros das contas em 12 tubos separados, cada um dos quais será usado para uma amostra de tecido separada. Alicote o material sonicado uniformemente para as esferas de proteína g com anticorpo específico e gire os tubos usando um revólver de tubo durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte à reticulação reversa, transfira a solução de proteína de anticorpo para uma placa de 96 poços e coloque-a em um suporte magnético.
Depois de permitir que as esferas adiram por pelo menos 30 segundos, remova o sobrenadante. Lave as esferas cinco vezes com 150 microlitros de tampão de lavagem RIPA gelado usando uma pipeta multicanal. Mova o ímã continuamente por 30 segundos por lavagem e, em seguida, remova o sobrenadante.
Após as etapas de lavagem, adicione uma mistura mestre de tampão de eluição, contendo 44 microlitros de tampão de eluição direta, um microlitro de Rnase e cinco microlitros de protenase k por chip e insira a amostra para reticulação reversa. Incube as amostras usando um termociclador de PCR por quatro horas a 37 graus Celsius, quatro horas a 50 graus Celsius e oito a 16 horas a 65 graus Celsius. Na manhã seguinte, coloque as amostras de volta no ímã e transfira o sobrenadante para uma nova placa de PCR de 96 poços que contém o DNA amino precipitado.
Adicione 2,3 grânulos paramagnéticos à solução e pipete cuidadosamente para cima e para baixo 25 vezes usando uma pipeta multicanal. Em seguida, incube em temperatura ambiente por quatro minutos. Em seguida, coloque as amostras de volta no ímã e incube em temperatura ambiente por mais quatro minutos.
Após descartar o sobrenadante, adicione 150 microlitros de etanol a 70% às amostras e incube em temperatura ambiente por 30 segundos sem perturbar as contas. Depois de deixar as esferas secarem, remova as amostras do ímã e adicione 30 microlitros de traçado 10 milimolar. Misture pipetando 25 vezes.
Depois de incubar as amostras à temperatura ambiente, coloque-as de volta no ímã e incube em temperatura ambiente por mais quatro minutos. Transfira 20 microlitros de cada amostra para uma nova placa de 96 poços para preparação da biblioteca. Após a amplificação por PCR, remova as amostras e leve o volume total para 100 microlitros usando água livre de núcleo.
Realize a seleção do tamanho paramagnético de dupla face adicionando primeiro 55 microlitros de grânulos a cada amostra e misturando 25 vezes com uma pipeta. Em seguida, incube em temperatura ambiente por quatro minutos. Coloque as amostras de volta no ímã e incube em temperatura ambiente por mais quatro minutos para obter grandes fragmentos nas esferas que não são adequados para sequenciamento.
Após a incubação, transferir o sobrenadante para uma nova placa de PCR de 96 poços. Adicione mais 25 microlitros de esferas paramagnéticas e misture pipetando 25 vezes e incube em temperatura ambiente fora do ímã por quatro minutos. Depois de incubar à temperatura ambiente, coloque as amostras de volta no ímã e incube em temperatura ambiente por quatro minutos.
Em seguida, descarte o sobrenadante. Deixando as amostras no ímã, adicione 150 microlitros de etanol a 70% e incube em temperatura ambiente por 30 segundos sem perturbar as contas. Retire o etanol e repita a lavagem.
Depois de deixar as esferas secarem, remova as amostras do ímã e adicione 25 microlitros de pH traceal 10 milimolar 8,0. Misturar pipetando 25 vezes e incubar à temperatura ambiente, fora do íman, durante quatro minutos. Depois de incubar à temperatura ambiente, coloque as amostras de volta no ímã e incube em temperatura ambiente por quatro minutos.
Agora, quantifique as bibliotecas usando um instrumento de eletroferograma de DNA de alta sensibilidade antes da multiplexação para garantir que os tamanhos sejam adequados para sequenciamento. Este protocolo permite a imunoprecipitação de tecidos tumorais congelados e linhagens celulares que podem ser realizadas em dezenas de amostras e paralelamente usando um método de alto rendimento. Os fragmentos de cromatina devem variar entre 200 e 1000 pares de bases para uma imunoprecipitação ideal.
O DNA ChIP purificado deve ser quantificado antes de prosseguir para a preparação da biblioteca. As bibliotecas concluídas adequadas para multiplexação e sequenciamento de próxima geração devem variar entre 200 e 600 pares de bases e ser desprovidas de quaisquer dímeros de primer. Após o pós-sequenciamento, há muitas métricas de controle de qualidade que devem ser atendidas antes de prosseguir para outras etapas do pipeline, como chamada de pico de macs e análise chromHmm.
As amostras de ChIP devem ser enriquecidas com DNA de entrada e cada modificação de histona deve exibir um perfil distinto representando um componente específico da paisagem epigenética. O algoritmo chrome HMM usa um Modelo Multivariado de Markov Oculto para identificar os padrões de cromatina combinatória e espacial recorrentes mais proeminentes com base nas modificações de histonas estudadas. Usando essas seis modificações, o chrome HMM identifica estados de cromatina funcionalmente distintos que representam domínios repressivos e ativos, como repressão polycomb, repressão heterocromática, transcrição ativa e intensificadores ativos.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro dias, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante determinar as condições ideais de sonicação e especificação de anticorpos antes de continuar com a preparação da biblioteca e análise de dados. Para aprender este procedimento, outros métodos, como sequenciamento RRS e captura de confirmação cromossômica, podem ser realizados para determinar a coalizão de partes do estado da cromatina com expressão gênica e maior estrutura da cromatina.
Após o experimento, a técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da epigenética do câncer explorarem os padrões de estado da cromatina em amostras de tumores de pacientes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como processar e desassociar tecidos tumorais, realizar imunoprecipitação de cromatina, preparar bibliotecas para sequenciamento de última geração, processar dados pós-sequenciamento e obter informações sobre as etapas iniciais da análise downstream. Não se esqueça de que, ao trabalhar com formaldeído, pode ser extremamente perigoso e precauções
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo otimizado de sequenciamento de ChIP de alto rendimento projetado para analisar padrões de estado da cromatina em tecidos tumorais congelados e linhagens celulares de câncer. O método tem como objetivo fornecer insights sobre o papel dos estados de modificação da histona na gênese tumoral.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Epigenética
- Biologia do Câncer
- Dinâmica da Cromatina
Antecedentes
- Compreender os estados da cromatina é fundamental para a pesquisa sobre câncer.
- As modificações das histonas desempenham um papel significativo na regulação gênica.
- Os métodos atuais podem apresentar baixa eficiência no processamento de múltiplas amostras.
- Técnicas de alto rendimento podem aprimorar a coleta e análise de dados.
Objetivo do Estudo
- Identificar padrões combinatórios de estados da cromatina em tecidos tumorais.
- Explorar o impacto das modificações de histonas no desenvolvimento tumoral.
- Melhorar a eficiência do processamento de amostras em estudos epigenéticos.
Métodos Utilizados
- Dissociação manual do tecido de melanoma.
- Uso da Solução Salina Balanceada de Hank para o processamento do tecido.
- Sequenciamento ChIP de alto rendimento para análise da cromatina.
- Pipeline computacional de análises para interpretação dos dados.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de padrões de estados da cromatina.
- Comprovada eficiência no processamento de múltiplas modificações de histonas.
- Fornecimento de insights sobre a paisagem epigenética de tumores.
- Facilitação de pesquisas futuras em epigenética do câncer.
Conclusões
- O protocolo otimizado aprimora a compreensão da dinâmica da cromatina no câncer.
- Oferece uma ferramenta valiosa para pesquisadores na área de epigenética.
- Estudos futuros podem se basear nestes achados para explorar alvos terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A mapeamento em todo o genoma dos estados da cromatina utilizando sequenciamento de ChIP de alto rendimento permite a investigação sistemática de alterações epigenômicas em tecidos tumorais e linhagens celulares de câncer. Este fluxo de trabalho integrado aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas na fase de descoberta, apoiando decisões de portfólio ajustadas ao risco na pesquisa e desenvolvimento em oncologia. A escalabilidade da plataforma e suas saídas quantitativas a posicionam como uma capacidade reutilizável para perfis epigenéticos em larga escala em diversas malignidades.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite o mapeamento abrangente de estados cromatínicos combinatórios para esclarecer as vias regulatórias na tumorigênese.
- Apoia a validação funcional de alvos ao associar padrões de modificações de histonas a elementos regulatórios de genes.
- Facilita a desvinculação mecanicista ao distinguir domínios ativos, repressores e potenciadores nos genomas de câncer.
- Fornece dados quantitativos para priorizar alvos epigenéticos em pipelines oncológicos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece perfis validados de estados de cromatina para triagem posterior de moduladores epigenéticos.
- Padroniza fluxos de trabalho de ChIP-seq de alto rendimento para processamento de amostras multiplexado e reproduzível.
- Gera dados quantitativos de ocupação e de estados combinatórios para viabilizar o desenvolvimento robusto de ensaios.
- Prepara sistemas biológicos para avaliação escalonável de compostos na descoberta de fármacos epigenéticos.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha o mapeamento do estado da cromatina com modelos tumorais relevantes para doenças, visando a descoberta translacional de biomarcadores.
- Garante a continuidade do processo de descoberta até a validação pré-clínica, permitindo comparações epigenômicas entre amostras.
- Apoia o avanço ajustado ao risco mediante a identificação de aberrações epigenômicas associadas à malignidade.
- Fornece insights mecanicistas para orientar a seleção de modelos pré-clínicos e estratégias de biomarcadores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esta plataforma de ChIP-seq de alto rendimento integra desde a descoberta inicial até a identificação de compostos líderes e a pesquisa pré-clínica, permitindo um perfil epigenômico contínuo ao longo do desenvolvimento oncológico.
- Biologia da Descoberta: Facilita testes de hipóteses e a elucidação de vias ao mapear estados de cromatina em todo o genoma.
- Triagem: Fornece dados quantitativos e reprodutíveis de ocupação da cromatina para prontidão de ensaios e triagem de compostos.
- Análises: Fornece saídas computacionais, como identificação de picos e segmentação de estados de cromatina, para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta padrões de estados de cromatina a modelos de doenças e ao desenvolvimento de biomarcadores na pesquisa do câncer.
- Reutilização Empresarial: Fluxo de trabalho escalável que apoia estudos em larga escala e padronização entre projetos em epigenética.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Permite o processamento padronizado, de alto rendimento e reprodutível de amostras de tumores e linhagens celulares.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não avançar e a eficiência do capital ao fornecer dados epigenômicos robustos no início do processo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de alvos epigenéticos nos portfólios de oncologia.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em biologia da cromatina, protocolos de ChIP-seq e pipelines de análise computacional.
- Exige acesso a instrumentação de sequenciamento de alto rendimento e infraestrutura de bioinformática.
- Necessita padronização entre equipes nos procedimentos de processamento de amostras e métricas de controle de qualidade dos dados.
- Adaptável a diversos tipos de tumores e linhagens celulares mediante otimização das condições de sonicação e de anticorpos.
- Depende de controle rigoroso de qualidade e validação dos resultados da segmentação de estados da cromatina.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:31
Tissue/Cell Line Processing and Cross-linking
1:57
Tissue Lysis, Sonication, and Antibody Preparation
2:52
Chromatin Immunoprecipitation
3:40
Washing and Reverse Cross-linking of Immunoprecipitated DNA-protein Complexes
4:43
Purification and Quantification of Precipitated DNA
6:00
Library Generation Using the NEBNext Ultra II DNA Library Preparation Kit
7:53
Results: Immunoprecipitation of Tumor Tissues and Cells Using High-throughput ChIP-sequencing
9:23
Conclusion
