Name: Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprenda a identificar padrões de estados cromatínicos em tecidos tumorais usando ChIP-seq de alta produtividade. Este método permite processar múltiplas modificações de histonas simultaneamente para estudar epigenética do câncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Marcus Coyle, Curtis Gumbs, núcleo do SMF no MDACC para suporte de sequenciamento. O trabalho descrito neste artigo foi apoiado por subsídios do grant NIH (CA016672) ao núcleo do SMF e ICN awards (1K99CA160578 e R00CA160578) para K. R.

<ol><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulated+Neighborhoods%3A+Structural+and+Functional+Units+of+Mammalian+Gene+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control.</a> Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMARCB1-mediated+SWI%2FSNF+complex+function+is+essential+for+enhancer+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation.</a> Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li>
<li>Jäger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+Hi-C+identifies+the+chromatin+interactome+of+colorectal+cancer+risk+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci.</a> Nat Commun. 6, 6178(2015).</li>
<li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).</li>
<li>Mansour, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+regulation.+An+oncogenic+super-enhancer+formed+through+somatic+mutation+of+a+noncoding+intergenic+element%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element.</a> Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).</li>
<li>Weischenfeldt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+somatic+copy-number+alterations+implicates+IRS4+and+IGF2+in+enhancer+hijacking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking.</a> Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).</li>
<li>Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(14)00205-6">Enhancer malfunction in cancer.</a> Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17320507">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+67+histone+marks+and+histone+lysine+crotonylation+as+a+new+type+of+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification.</a> Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Consortium, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Rivera, C. M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(13)01148-3">Mapping human epigenomes.</a> Cell. 155 (1), 39-55 (2013).</li>
<li>Stergachis, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154 (4), 888-903 (2013).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+analysis+of+multilineage+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells.</a> Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+diversity+during+lineage+commitment+of+human+blood+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors.</a> Science. 345 (6204), 1251033(2014).</li>
<li>Saeed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+programming+of+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+trained+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity.</a> Science. 345 (6204), 1251086(2014).</li>
<li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).</li>
<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChromHMM%3A+automating+chromatin-state+discovery+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization.</a> Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).</li>
<li>Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+ChIP-seq+enrichment+using+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identifying ChIP-seq enrichment using MACS.</a> Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18798982">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q2ChIP%2C+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay%2C+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+epigenomic+landscape+derived+from+ChIP-Seq+of+1%2C000+mouse+early+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells.</a> Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).</li>
<li>Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate-based+chromatin+immunoprecipitation+method%2C+Matrix+ChIP%3A+a+platform+to+study+signaling+of+complex+genomic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events.</a> Nucleic Acids Res. 36 (3), e17(2008).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16397291">Fast chromatin immunoprecipitation assay.</a> Nucleic Acids Res. 34 (1), e2(2006).</li>
<li>Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+environment+for+agile+analysis+and+visualization+of+ChIP-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li>
<li>Tang, M. <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/819971#.WilfHUtrxZ0">pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline.</a> Zenodo. , (2017).</li>
<li>Koster, J., Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).</li>
<li>Bailey, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+the+comprehensive+analysis+of+ChIP-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data.</a> PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326(2013).</li>
<li>Fiziev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Epigenomic+Analysis+Reveals+Chromatin+States+Associated+with+Melanoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression.</a> Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+chromosomal+domains+of+histone+modification+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans.</a> Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Roles+of+RNF2+in+Melanoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression.</a> Cancer Discov. , (2015).</li>
<li>Cotney, J. L., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+fixed+animal+tissues+and+preparation+for+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).</li>
<li>Cejas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+from+fixed+clinical+tissues+reveals+tumor-specific+enhancer+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles.</a> Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).</li>
</ol>

Autores declaram sem conflitos.

Este protocolo descreve um módulo de ChIP-seq da elevado-produção completo e abrangente para o mapeamento de todo o genoma de Estados da cromatina em tecidos de tumor humano e linhas celulares. Em qualquer protocolo de ChIP-seq, um dos passos mais importantes é a especificidade do anticorpo. Aqui, esse método ilustra imunoprecipitação condições para as modificações do histone seis descritos, os quais são ChIP-grau e validados anteriormente em nosso e outros laboratórios42,<sup class="xr...

A maioria dos genomas de mamíferos (98-99%) é composta de sequência não-codificadoras e nestas regiões nocoding contêm elementos reguladores conhecidos para participar no controle da expressão gênica e cromatina organização1,2. Em uma célula normal, o assembly específico do DNA genômico na estrutura da cromatina compactada é fundamental para a organização espacial, a regulação e a cronometragem precisa de vários processos de DNA associada3,4,5. Em uma célula de câncer, no entanto, as modificações de cromatina por aberrantes mecanismos epigenéticos podem levar a organização inadequada da estrutura da cromatina, incluindo o acesso aos elementos reguladores, sistemas loop cromossômicos e de padrões de expressão de gene6, 7,8,9,10.
Apesar dos avanços recentes, nós limitamos a compreensão das alterações epigenéticas que estão associados com a progressão do tumor ou resposta terapêutica. A Epigenoma consiste de uma matriz de modificações, incluindo marcas de histona e metilação de DNA, que coletivamente formam um estado dinâmico (designado Estado de cromatina) que colide com redes de expressão de gene e outros processos críticos para a manutenção identidade celular. Recentemente, alterações em potenciadores foram mostradas em várias neoplasias malignas através do estudo de perfis de H3K27Ac11. Embora tais estudos fornecem insights sobre a correlação de marcas epigenéticas isoladas, mais de 100 modificações epigenéticas têm sido identificadas12,13 , sem uma compreensão clara das suas funções biológicas e interdependência. Além disso, há um número ainda maior de possíveis padrões combinatórios destes histona e modificações de DNA, e é desses padrões combinatórios - modificações não individuais - que ditam Estados epigenéticas14. Portanto, há uma enorme necessidade de identificar alterações nestes Estados de cromatina durante a progressão do câncer ou respostas à terapia. Conhecimento abrangente das alterações Epigenoma em cânceres tem sido atrasadas em parte devido à técnica (por exemplo, a geração de dados em larga escala de pequena quantidade de células de material/única clínicas) e analítico (por exemplo, algoritmos para definir desafios de combinatória Estados). Portanto, há uma necessidade crítica de robustas métodos de alta produtividade para criação de perfil de grande número de marcas de modificação do histone de material clínico e fácil de implementar abordagens computacionais para prever padrões combinatórios que facilitará determinação da epigenéticas Estados associados com diferentes estágios de resistência terapêutica e tumorigênese. Dados complementares, disponíveis a partir do recente Epigenoma de perfil estudos15,16,17,18,19,20,21, 22,23 em linhas de células e tecidos normais podem ser integrados com perfis de cromatina de tumores para mais introspecções Epigenoma contribuição à biologia do tumor.
Criação de perfil de cromatina, tornou-se uma poderosa ferramenta para identificar os padrões de ligação global de cromatina várias modificações15,24. Nos últimos anos, ChIP-seq tornou-se o "padrão ouro" para estudar interações DNA-proteína em uma escala global25,26,27. Para qualquer experiência de ChIP-seq, existem passos críticos necessários para seu sucesso, incluindo processamento de tecido e dissociação, determinar condições optimal sonication, determinar a concentração de anticorpo para a precipitação, preparação de biblioteca, pós-sequenciamento de processamento de dados e análise a jusante. Cada um destes passos contêm pontos de verificação de chave de controle de qualidade e quando tomados em conjunto, são crucial para adequadamente, identificando potenciais alvos para validação funcional. Através da inovação nessas etapas, vários estudos prévios desenvolveram metodologias para executar o ChIP ou ChIP-Seq de pequena quantidade de tecidos28,29,30,31,32 . Além disso, alguns estudos têm sugerido que os protocolos para experimentos de ChIP do elevado-throughput seguidos pelo PCR baseado quantificação33,34. Finalmente, algumas plataformas de análise disponível publicamente para ChIP-Seq dados agora estão disponíveis como Easeq35 e galáxia36. No entanto, uma plataforma integrada para a realização de ChIP-Seq em uma moda de alta produtividade em combinação com um encanamento computacional para executar marca única, bem como análises de estado cromatina tem faltado.
Este protocolo descreve um completo e abrangente ChIP-seq de fluxo de trabalho para o mapeamento de todo o genoma de Estados da cromatina em tecidos de tumor e linhas de celular, com fácil de seguir diretrizes englobando todas as etapas necessárias para uma experiência bem sucedida. Através da adopção de um método de alta produtividade anteriormente descrito por Blecher-Gonen et al 37, este protocolo pode ser executado em dezenas de amostras em paralelo e tem sido aplicado com sucesso em linhas de células de câncer e tumores humanos como melanoma, cólon, próstata e glioblastoma multiforme. Vamos demonstrar a metodologia para seis modificações do histone de núcleo que representam os principais componentes da paisagem epigenética regulamentar em linhas de células de melanoma humano e amostras de tumor. Essas modificações incluem H3K27ac (intensificadores), H3K4me1 (potenciadores de ativos e equilibrados), H3K4me3 (promotores), H3K79me2 (transcrito regiões), H3K27me3 (polycomb de repressão) e H3K9me3 (heterocromático repressão). Estas marcas podem ser usadas sozinho ou em combinação para identificar Estados de cromatina funcionalmente distintos que representam domínios repressivos e ativos.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo H3K4me1 de grau ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K27ac de grau ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K4me3 de grau ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K79me2 de grau ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab3594</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K27me3 de grau</td><td>ChIP Abcam</td><td>ab6002</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 de grau ChIP anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris HCl, pH 8,0</td><td>Teknova</td><td>T1080</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma - Vida Sciences</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746460</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1% TWEEN-20</td><td>Fisher Biorreagentes</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA - Sigma sem</td><td>IgG - Vida Sciences</td><td>A2058-5G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C tube</td><td>GentleMACS</td><td>120-008-466</td><td>tubo de dissociação</td></tr><tr><td>16% Formaldeído</td><td>Peierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de miniProtease&nbsp;</td>Comprimidos <td>inibidores de protease</td><td>11836153001</td> <td>Roche Diagnostics</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G&nbsp;</td><td>Tubos Invitrogen</td><td>10009D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor NGS 0,65 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010011</td><td>tubos de sonicação</td></tr><tr><td>DynaMag - 96 Side Skirted</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td>Suporte magnético de 96 poços</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Promega</td><td>V6231</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>100005393</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>grânulos paramagnéticos</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ds DNA Kit de ensaio de alta sensibilidade</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>reagentes de DNA de alta sensibilidade</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit de preparação para biblioteca de DNA</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td>Kit de preparação para biblioteca</td></tr><tr><td>de DNA Água livre</td> <td>de nucleaseAmbion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Fita de Tela D1000 de Alta Sensibilidade</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>reagentes de DNA de alta</td></tr><tr><td>sensibilidade Reagentes D1000 de alta sensibilidade</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td>reagentes de DNA de alta sensibilidade</td></tr><tr><td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7335L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligos Multiplex (Primers de índice- Conjunto 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7500L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>instrumento de eletroferograma de DNA de alta sensibilidade</td></tr><tr><td>Dispositivo de sonicação Bioruptor Pico&nbsp;</td><td>Misturador de divisor de banho-maria</td> <td>Diagenode</td><td>B01060001</td></tr><tr><td></td><td>Nutator</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Touch Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>PCR Termociclador</td></tr><tr><td>Banho de Água</td><td>Fisher Scientific</td><td>2322</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Multicanal</td><td>Denville</td><td>1003123</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Revólver</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td>88881001</tr><tr><td>Placa de Rodapé de 96 Poços</td><td>Eppendorf</td><td>47744-110</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R Centrífuga&nbsp;</td><td>Centrífuga de bancada</td> <td>Beckman Coulter</td><td>A99464</td></tr><tr><td>Centrífuga</td> de mesa <td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td>Tiras</td></tr><tr><td>de tubo óptico (8x Strip)</td> <td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de tira de tubo óptico (8x tira)</td> <td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Dicas de Carregamento, 10 Pk</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice IKA MS3 Vórtice</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de estados da cromatina usando chip de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de tumor

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Modificações do histone constituem um componente importante do Epigenoma e desempenham importantes funções reguladoras na determinação do estatuto transcriptional dos loci associados. Além disso, a presença de alterações específicas tem sido usada para determinar a posição e a identidade não-codificante funcional elementos como potenciadores. Nos últimos anos, a imunoprecipitação da cromatina, seguida de próxima geração sequenciação (ChIP-seq) tornou-se uma poderosa ferramenta para determinar os perfis de todo o genoma de modificações do histone individuais. No entanto, tornou-se cada vez mais claro que os padrões de combinatórios de modificações da cromatina, referidos como Estados de cromatina, determinam a identidade e a natureza do locus genômico associado. Portanto, os fluxos de trabalho consistindo de robustas metodologias de (HT) de alta produtividade para criação de perfil de um número de marcas de modificação de histona, bem como dutos de análises computacionais capazes de lidar com miríades de ChIP-Seq perfis de conjuntos de dados, são necessários para determinação abrangente dos Estados epigenomic em grande número de amostras. O HT-ChIP-Seq de fluxo de trabalho aqui apresentado é composto por dois módulos: 1) um protocolo experimental para o perfilamento várias modificações do histone de pequenas quantidades de amostras de tumor e linhas de células em um formato de 96 poços; e 2) um pipeline de análise de dados computacional que combina as ferramentas existentes para calcular tanto marca individual ocupação e padrões de estado cromatina combinatória. Juntos, esses dois módulos facilitam fácil processamento de centenas de amostras de ChIP-Seq de forma rápida e eficiente. O fluxo de trabalho apresentado aqui é usado para derivar padrões de cromatina estado 6 perfis de marca de histona em tumores de melanoma e linhas celulares. Em geral, apresentamos um fluxo de trabalho de ChIP-seq abrangente que pode ser aplicado a dezenas de amostras de tumor humano e linhas de células de câncer para determinar epigenomic de aberrações em várias malignidades.

Este protocolo permite a imunoprecipitação de tecidos de tumor congelado e linhas celulares que podem ser executadas em dezenas de amostras em paralelo usando um método de alta produtividade (figura 1A). Fragmentos de cromatina devem variar entre ~ 200-1000 bps para a imunoprecipitação ideal. Temos observado que o tempo necessário para atingir o mesmo comprimento de corte é diferente para diferentes tecidos e tipos de células. O sucesso do Ch...

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

O objetivo geral deste protocolo é identificar de forma imparcial os padrões de estado de cromatina combinatória em tecidos tumorais e linhagens de células cancerígenas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética do câncer, como como os estados de modificação de histonas estéreis podem contribuir para a gênese do tumor. A principal vantagem dessa técnica é que várias modificações de histonas, bem como várias amostras, podem ser processadas simultaneamente e com eficiência.Primeiro, dissocie 50 miligramas de tecido de melanoma manualmente e dois mililitros de Hank's Balanced Salt Solution ou HBSS, usando uma lâmina de barbear estéril. Pique o tecido em pedaços de três ou quatro milímetros por aproximadamente cinco minutos em uma placa de cultura de tecidos estéreis. Transfira a solução de tecido para um tubo dissociador e adicione mais oito mililitros de HBSS.Dissocie ainda mais o tecido, usando um dissociador, até homogeneizar. Em seguida, reticule o tecido, adicionando 200 microlitros de formaldeído a 16% por três mililitros de HBSS. Usando um misturador, agite a mistura a 10 rpm por exatamente 10 minutos a 37 graus Celsius.Depois de retirar a amo

an-integrated-platform-for-genome-wide-mapping-chromatin-states-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

O método de Hi-C permite a identificação imparciais, de todo o genoma de interações cromatina (1). Oi-C casais ligadura proximidade e seqüenciamento massivamente paralelo. Os dados resultantes podem ser usados ​​para estudar a arquitetura genômica em múltiplas escalas: resultados iniciais identificadas características como territórios cromossomo, a segregação da cromatina abertas e fechadas, e estrutura da cromatina na escala megabase.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

Cromatina Análise de Interação por Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) é um método...

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

A combinação de cromatina imunoprecipitação e sequenciamento ultra-high-throughput (CHIP-seq) pode identificar e mapear as interações DNA-proteína em uma determinada linha de tecido ou célula. Delineado é como gerar um modelo de alta chip de qualidade para o seqüenciamento posterior, utilizando a experiência com o fator de transcrição TCF7L2 como um exemplo.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

Descrevemos aqui uma plataforma que permite a detecção de teste do cometa de danos no DNA, com taxa de transferência sem precedentes. Os padrões de dispositivos de células de mamíferos para um microarranjo e permite o processamento em paralelo de amostras 96. A abordagem facilita a análise de danos ao DNA nível base, danos ao DNA induzidos por exposição e reparo do DNA cinética.

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Este artigo descreve um protocolo chip-seq semiautomado e microescalado de regiões de DNA associadas a uma modificação de histona específica (H3K27ac) usando uma plataforma de manipulador de líquidos ChIP, seguido de preparação da biblioteca usando tagmentação. O procedimento inclui avaliação de controle para fins de qualidade e quantidade e pode ser adotado para outras modificações de histona ou fatores de transcrição.

Um procedimento de ChIP-Seq semiautônomo para estudos epigenéticos em larga escala

ATAC-seq é um método de sequenciamento de DNA que usa a transposase mutante hiperativa, Tn5, para mapear mudanças na acessibilidade da cromatina mediadas por fatores de transcrição. O ATAC-seq permite a descoberta dos mecanismos moleculares subjacentes às alterações fenotípicas nas células cancerígenas. Este protocolo descreve procedimentos de otimização para ATAC-seq em tipos de células epiteliais, incluindo células cancerígenas.

Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Um protocolo otimizado de Clivagem Sob Alvos e Liberação Usando Nuclease seguida de sequenciamento de próxima geração (CUT&amp;RUN-seq) é descrito para linhas celulares de câncer de pulmão de pequenas células neuroendócrinas. Ele permite o mapeamento genômico de várias modificações de histonas e locais de ligação do fator de transcrição (por exemplo, E2F7) para investigar a desregulação epigenética e transcricional na patobiologia do SCLC.

Mapeamento genômico amplo de modificações histonas e sítios de ligação de fatores de transcrição em linhas celulares neuroendócrinas de câncer de pulmão de pequenas células usando CUT&amp;RUN

Aprenda a identificar padrões de estados cromatínicos em tecidos tumorais usando ChIP-seq de alta produtividade. Este método permite processar múltiplas modificações de histonas simultaneamente para estudar epigenética do câncer.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor (Vídeo) | JoVE Journal

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Explorar mais vídeos