Name: Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprenda a identificar padrões de estados cromatínicos em tecidos tumorais usando ChIP-seq de alta produtividade. Este método permite processar múltiplas modificações de histonas simultaneamente para estudar epigenética do câncer.

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Agradecemos a Marcus Coyle, Curtis Gumbs, núcleo do SMF no MDACC para suporte de sequenciamento. O trabalho descrito neste artigo foi apoiado por subsídios do grant NIH (CA016672) ao núcleo do SMF e ICN awards (1K99CA160578 e R00CA160578) para K. R.

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</ol>

Autores declaram sem conflitos.

Este protocolo descreve um módulo de ChIP-seq da elevado-produção completo e abrangente para o mapeamento de todo o genoma de Estados da cromatina em tecidos de tumor humano e linhas celulares. Em qualquer protocolo de ChIP-seq, um dos passos mais importantes é a especificidade do anticorpo. Aqui, esse método ilustra imunoprecipitação condições para as modificações do histone seis descritos, os quais são ChIP-grau e validados anteriormente em nosso e outros laboratórios42,<sup class="xr...

A maioria dos genomas de mamíferos (98-99%) é composta de sequência não-codificadoras e nestas regiões nocoding contêm elementos reguladores conhecidos para participar no controle da expressão gênica e cromatina organização1,2. Em uma célula normal, o assembly específico do DNA genômico na estrutura da cromatina compactada é fundamental para a organização espacial, a regulação e a cronometragem precisa de vários processos de DNA associada3,4,5. Em uma célula de câncer, no entanto, as modificações de cromatina por aberrantes mecanismos epigenéticos podem levar a organização inadequada da estrutura da cromatina, incluindo o acesso aos elementos reguladores, sistemas loop cromossômicos e de padrões de expressão de gene6, 7,8,9,10.
Apesar dos avanços recentes, nós limitamos a compreensão das alterações epigenéticas que estão associados com a progressão do tumor ou resposta terapêutica. A Epigenoma consiste de uma matriz de modificações, incluindo marcas de histona e metilação de DNA, que coletivamente formam um estado dinâmico (designado Estado de cromatina) que colide com redes de expressão de gene e outros processos críticos para a manutenção identidade celular. Recentemente, alterações em potenciadores foram mostradas em várias neoplasias malignas através do estudo de perfis de H3K27Ac11. Embora tais estudos fornecem insights sobre a correlação de marcas epigenéticas isoladas, mais de 100 modificações epigenéticas têm sido identificadas12,13 , sem uma compreensão clara das suas funções biológicas e interdependência. Além disso, há um número ainda maior de possíveis padrões combinatórios destes histona e modificações de DNA, e é desses padrões combinatórios - modificações não individuais - que ditam Estados epigenéticas14. Portanto, há uma enorme necessidade de identificar alterações nestes Estados de cromatina durante a progressão do câncer ou respostas à terapia. Conhecimento abrangente das alterações Epigenoma em cânceres tem sido atrasadas em parte devido à técnica (por exemplo, a geração de dados em larga escala de pequena quantidade de células de material/única clínicas) e analítico (por exemplo, algoritmos para definir desafios de combinatória Estados). Portanto, há uma necessidade crítica de robustas métodos de alta produtividade para criação de perfil de grande número de marcas de modificação do histone de material clínico e fácil de implementar abordagens computacionais para prever padrões combinatórios que facilitará determinação da epigenéticas Estados associados com diferentes estágios de resistência terapêutica e tumorigênese. Dados complementares, disponíveis a partir do recente Epigenoma de perfil estudos15,16,17,18,19,20,21, 22,23 em linhas de células e tecidos normais podem ser integrados com perfis de cromatina de tumores para mais introspecções Epigenoma contribuição à biologia do tumor.
Criação de perfil de cromatina, tornou-se uma poderosa ferramenta para identificar os padrões de ligação global de cromatina várias modificações15,24. Nos últimos anos, ChIP-seq tornou-se o "padrão ouro" para estudar interações DNA-proteína em uma escala global25,26,27. Para qualquer experiência de ChIP-seq, existem passos críticos necessários para seu sucesso, incluindo processamento de tecido e dissociação, determinar condições optimal sonication, determinar a concentração de anticorpo para a precipitação, preparação de biblioteca, pós-sequenciamento de processamento de dados e análise a jusante. Cada um destes passos contêm pontos de verificação de chave de controle de qualidade e quando tomados em conjunto, são crucial para adequadamente, identificando potenciais alvos para validação funcional. Através da inovação nessas etapas, vários estudos prévios desenvolveram metodologias para executar o ChIP ou ChIP-Seq de pequena quantidade de tecidos28,29,30,31,32 . Além disso, alguns estudos têm sugerido que os protocolos para experimentos de ChIP do elevado-throughput seguidos pelo PCR baseado quantificação33,34. Finalmente, algumas plataformas de análise disponível publicamente para ChIP-Seq dados agora estão disponíveis como Easeq35 e galáxia36. No entanto, uma plataforma integrada para a realização de ChIP-Seq em uma moda de alta produtividade em combinação com um encanamento computacional para executar marca única, bem como análises de estado cromatina tem faltado.
Este protocolo descreve um completo e abrangente ChIP-seq de fluxo de trabalho para o mapeamento de todo o genoma de Estados da cromatina em tecidos de tumor e linhas de celular, com fácil de seguir diretrizes englobando todas as etapas necessárias para uma experiência bem sucedida. Através da adopção de um método de alta produtividade anteriormente descrito por Blecher-Gonen et al 37, este protocolo pode ser executado em dezenas de amostras em paralelo e tem sido aplicado com sucesso em linhas de células de câncer e tumores humanos como melanoma, cólon, próstata e glioblastoma multiforme. Vamos demonstrar a metodologia para seis modificações do histone de núcleo que representam os principais componentes da paisagem epigenética regulamentar em linhas de células de melanoma humano e amostras de tumor. Essas modificações incluem H3K27ac (intensificadores), H3K4me1 (potenciadores de ativos e equilibrados), H3K4me3 (promotores), H3K79me2 (transcrito regiões), H3K27me3 (polycomb de repressão) e H3K9me3 (heterocromático repressão). Estas marcas podem ser usadas sozinho ou em combinação para identificar Estados de cromatina funcionalmente distintos que representam domínios repressivos e ativos.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo H3K4me1 de grau ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K27ac de grau ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K4me3 de grau ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K79me2 de grau ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab3594</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K27me3 de grau</td><td>ChIP Abcam</td><td>ab6002</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 de grau ChIP anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris HCl, pH 8,0</td><td>Teknova</td><td>T1080</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma - Vida Sciences</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746460</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1% TWEEN-20</td><td>Fisher Biorreagentes</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA - Sigma sem</td><td>IgG - Vida Sciences</td><td>A2058-5G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C tube</td><td>GentleMACS</td><td>120-008-466</td><td>tubo de dissociação</td></tr><tr><td>16% Formaldeído</td><td>Peierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de miniProtease&nbsp;</td>Comprimidos <td>inibidores de protease</td><td>11836153001</td> <td>Roche Diagnostics</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G&nbsp;</td><td>Tubos Invitrogen</td><td>10009D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor NGS 0,65 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010011</td><td>tubos de sonicação</td></tr><tr><td>DynaMag - 96 Side Skirted</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td>Suporte magnético de 96 poços</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Promega</td><td>V6231</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>100005393</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>grânulos paramagnéticos</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ds DNA Kit de ensaio de alta sensibilidade</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>reagentes de DNA de alta sensibilidade</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit de preparação para biblioteca de DNA</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td>Kit de preparação para biblioteca</td></tr><tr><td>de DNA Água livre</td> <td>de nucleaseAmbion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Fita de Tela D1000 de Alta Sensibilidade</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>reagentes de DNA de alta</td></tr><tr><td>sensibilidade Reagentes D1000 de alta sensibilidade</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td>reagentes de DNA de alta sensibilidade</td></tr><tr><td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7335L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligos Multiplex (Primers de índice- Conjunto 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7500L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>instrumento de eletroferograma de DNA de alta sensibilidade</td></tr><tr><td>Dispositivo de sonicação Bioruptor Pico&nbsp;</td><td>Misturador de divisor de banho-maria</td> <td>Diagenode</td><td>B01060001</td></tr><tr><td></td><td>Nutator</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Touch Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>PCR Termociclador</td></tr><tr><td>Banho de Água</td><td>Fisher Scientific</td><td>2322</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Multicanal</td><td>Denville</td><td>1003123</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Revólver</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td>88881001</tr><tr><td>Placa de Rodapé de 96 Poços</td><td>Eppendorf</td><td>47744-110</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R Centrífuga&nbsp;</td><td>Centrífuga de bancada</td> <td>Beckman Coulter</td><td>A99464</td></tr><tr><td>Centrífuga</td> de mesa <td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td>Tiras</td></tr><tr><td>de tubo óptico (8x Strip)</td> <td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de tira de tubo óptico (8x tira)</td> <td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Dicas de Carregamento, 10 Pk</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice IKA MS3 Vórtice</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de estados da cromatina usando chip de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de tumor

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Modificações do histone constituem um componente importante do Epigenoma e desempenham importantes funções reguladoras na determinação do estatuto transcriptional dos loci associados. Além disso, a presença de alterações específicas tem sido usada para determinar a posição e a identidade não-codificante funcional elementos como potenciadores. Nos últimos anos, a imunoprecipitação da cromatina, seguida de próxima geração sequenciação (ChIP-seq) tornou-se uma poderosa ferramenta para determinar os perfis de todo o genoma de modificações do histone individuais. No entanto, tornou-se cada vez mais claro que os padrões de combinatórios de modificações da cromatina, referidos como Estados de cromatina, determinam a identidade e a natureza do locus genômico associado. Portanto, os fluxos de trabalho consistindo de robustas metodologias de (HT) de alta produtividade para criação de perfil de um número de marcas de modificação de histona, bem como dutos de análises computacionais capazes de lidar com miríades de ChIP-Seq perfis de conjuntos de dados, são necessários para determinação abrangente dos Estados epigenomic em grande número de amostras. O HT-ChIP-Seq de fluxo de trabalho aqui apresentado é composto por dois módulos: 1) um protocolo experimental para o perfilamento várias modificações do histone de pequenas quantidades de amostras de tumor e linhas de células em um formato de 96 poços; e 2) um pipeline de análise de dados computacional que combina as ferramentas existentes para calcular tanto marca individual ocupação e padrões de estado cromatina combinatória. Juntos, esses dois módulos facilitam fácil processamento de centenas de amostras de ChIP-Seq de forma rápida e eficiente. O fluxo de trabalho apresentado aqui é usado para derivar padrões de cromatina estado 6 perfis de marca de histona em tumores de melanoma e linhas celulares. Em geral, apresentamos um fluxo de trabalho de ChIP-seq abrangente que pode ser aplicado a dezenas de amostras de tumor humano e linhas de células de câncer para determinar epigenomic de aberrações em várias malignidades.

Este protocolo permite a imunoprecipitação de tecidos de tumor congelado e linhas celulares que podem ser executadas em dezenas de amostras em paralelo usando um método de alta produtividade (figura 1A). Fragmentos de cromatina devem variar entre ~ 200-1000 bps para a imunoprecipitação ideal. Temos observado que o tempo necessário para atingir o mesmo comprimento de corte é diferente para diferentes tecidos e tipos de células. O sucesso do Ch...

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

O objetivo geral deste protocolo é identificar de forma imparcial os padrões de estado de cromatina combinatória em tecidos tumorais e linhagens de células cancerígenas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética do câncer, como como os estados de modificação de histonas estéreis podem contribuir para a gênese do tumor. A principal vantagem dessa técnica é que várias modificações de histonas, bem como várias amostras, podem ser processadas simultaneamente e com eficiência.Primeiro, dissocie 50 miligramas de tecido de melanoma manualmente e dois mililitros de Hank's Balanced Salt Solution ou HBSS, usando uma lâmina de barbear estéril. Pique o tecido em pedaços de três ou quatro milímetros por aproximadamente cinco minutos em uma placa de cultura de tecidos estéreis. Transfira a solução de tecido para um tubo dissociador e adicione mais oito mililitros de HBSS.Dissocie ainda mais o tecido, usando um dissociador, até homogeneizar. Em seguida, reticule o tecido, adicionando 200 microlitros de formaldeído a 16% por três mililitros de HBSS. Usando um misturador, agite a mistura a 10 rpm por exatamente 10 minutos a 37 graus Celsius.Depois de retirar a amostra da incubadora, adicione 200 microlitros de glicina tumoral por três mililitros de amostra e agite a mistura a 10 rpm por cinco minutos a 37 graus Celsius. Gire a amostra a 934 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius usando uma centrífuga de bancada. Quando terminar, remova o sobrenadante e adicione cinco mililitros de PBS gelado.Em seguida, centrifugue novamente a amostra a 934 vezes g e remova o sobrenadante. Adicione 300 microlitros de tampão de colheita de ChIP com inibidores de protease por 50 miligramas de tecido e lise as amostras por 30 minutos no gelo. Enquanto as células estão lisando, ligue o disruptor de banho-maria e o sistema de resfriamento associado e deixe a temperatura atingir quatro graus Celsius.Coloque o tubo sonicador no disruptor de banho-maria e sonice o tecido melanoma por 60 ciclos a 30 segundos ligado e 30 segundos desligado para obter fragmentos de cromatina de 200 a 600 pares de bases. Para oito miligramas de tecido de melanoma, incubar três microgramas de cada anticorpo histona com 20 microlitros de esferas magnéticas de proteína g e 100 microlitros de tampão bloqueador de ligação por duas horas a quatro graus Celsius com rotação, usando um revólver de tubo. Após a sonicação, dilua a amostra cinco vezes usando tampão de diluição ChIP para reduzir a concentração de SDS para 0,1% Após a conclusão da incubação dos grânulos magnéticos de anticorpos e proteína g, remova o tampão de diluição ChIP e suspenda novamente os grânulos em 240 microlitros do tampão fresco.Em seguida, coloque alíquotas de 20 microlitros das contas em 12 tubos separados, cada um dos quais será usado para uma amostra de tecido separada. Alicote o material sonicado uniformemente para as esferas de proteína g com anticorpo específico e gire os tubos usando um revólver de tubo durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte à reticulação reversa, transfira a solução de proteína de anticorpo para uma placa de 96 poços e coloque-a em um suporte magnético.Depois de permitir que as esferas adiram por pelo menos 30 segundos, remova o sobrenadante. Lave as esferas cinco vezes com 150 microlitros de tampão de lavagem RIPA gelado usando uma pipeta multicanal. Mova o ímã continuamente por 30 segundos por lavagem e, em seguida, remova o sobrenadante.Após as etapas de lavagem, adicione uma mistura mestre de tampão de eluição, contendo 44 microlitros de tampão de eluição direta, um microlitro de Rnase e cinco microlitros de protenase k por chip e insira a amostra para reticulação reversa. Incube as amostras usando um termociclador de PCR por quatro horas a 37 graus Celsius, quatro horas a 50 graus Celsius e oito a 16 horas a 65 graus Celsius. Na manhã seguinte, coloque as amostras de volta no ímã e transfira o sobrenadante para uma nova placa de PCR de 96 poços que contém o DNA amino precipitado.Adicione 2,3 grânulos paramagnéticos à solução e pipete cuidadosamente para cima e para baixo 25 vezes usando uma pipeta multicanal. Em seguida, incube em temperatura ambiente por quatro minutos. Em seguida, coloque as amostras de volta no ímã e incube em temperatura ambiente por mais quatro minutos.Após descartar o sobrenadante, adicione 150 microlitros de etanol a 70% às amostras e incube em temperatura ambiente por 30 segundos sem perturbar as contas. Depois de deixar as esferas secarem, remova as amostras do ímã e adicione 30 microlitros de traçado 10 milimolar. Misture pipetando 25 vezes.Depois de incubar as amostras à temperatura ambiente, coloque-as de volta no ímã e incube em temperatura ambiente por mais quatro minutos. Transfira 20 microlitros de cada amostra para uma nova placa de 96 poços para preparação da biblioteca. Após a amplificação por PCR, remova as amostras e leve o volume total para 100 microlitros usando água livre de núcleo.Realize a seleção do tamanho paramagnético de dupla face adicionando primeiro 55 microlitros de grânulos a cada amostra e misturando 25 vezes com uma pipeta. Em seguida, incube em temperatura ambiente por quatro minutos. Coloque as amostras de volta no ímã e incube em temperatura ambiente por mais quatro minutos para obter grandes fragmentos nas esferas que não são adequados para sequenciamento.Após a incubação, transferir o sobrenadante para uma nova placa de PCR de 96 poços. Adicione mais 25 microlitros de esferas paramagnéticas e misture pipetando 25 vezes e incube em temperatura ambiente fora do ímã por quatro minutos. Depois de incubar à temperatura ambiente, coloque as amostras de volta no ímã e incube em temperatura ambiente por quatro minutos.Em seguida, descarte o sobrenadante. Deixando as amostras no ímã, adicione 150 microlitros de etanol a 70% e incube em temperatura ambiente por 30 segundos sem perturbar as contas. Retire o etanol e repita a lavagem.Depois de deixar as esferas secarem, remova as amostras do ímã e adicione 25 microlitros de pH traceal 10 milimolar 8,0. Misturar pipetando 25 vezes e incubar à temperatura ambiente, fora do íman, durante quatro minutos. Depois de incubar à temperatura ambiente, coloque as amostras de volta no ímã e incube em temperatura ambiente por quatro minutos.Agora, quantifique as bibliotecas usando um instrumento de eletroferograma de DNA de alta sensibilidade antes da multiplexação para garantir que os tamanhos sejam adequados para sequenciamento. Este protocolo permite a imunoprecipitação de tecidos tumorais congelados e linhagens celulares que podem ser realizadas em dezenas de amostras e paralelamente usando um método de alto rendimento. Os fragmentos de cromatina devem variar entre 200 e 1000 pares de bases para uma imunoprecipitação ideal.O DNA ChIP purificado deve ser quantificado antes de prosseguir para a preparação da biblioteca. As bibliotecas concluídas adequadas para multiplexação e sequenciamento de próxima geração devem variar entre 200 e 600 pares de bases e ser desprovidas de quaisquer dímeros de primer. Após o pós-sequenciamento, há muitas métricas de controle de qualidade que devem ser atendidas antes de prosseguir para outras etapas do pipeline, como chamada de pico de macs e análise chromHmm.As amostras de ChIP devem ser enriquecidas com DNA de entrada e cada modificação de histona deve exibir um perfil distinto representando um componente específico da paisagem epigenética. O algoritmo chrome HMM usa um Modelo Multivariado de Markov Oculto para identificar os padrões de cromatina combinatória e espacial recorrentes mais proeminentes com base nas modificações de histonas estudadas. Usando essas seis modificações, o chrome HMM identifica estados de cromatina funcionalmente distintos que representam domínios repressivos e ativos, como repressão polycomb, repressão heterocromática, transcrição ativa e intensificadores ativos.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro dias, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante determinar as condições ideais de sonicação e especificação de anticorpos antes de continuar com a preparação da biblioteca e análise de dados. Para aprender este procedimento, outros métodos, como sequenciamento RRS e captura de confirmação cromossômica, podem ser realizados para determinar a coalizão de partes do estado da cromatina com expressão gênica e maior estrutura da cromatina.Após o experimento, a técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da epigenética do câncer explorarem os padrões de estado da cromatina em amostras de tumores de pacientes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como processar e desassociar tecidos tumorais, realizar imunoprecipitação de cromatina, preparar bibliotecas para sequenciamento de última geração, processar dados pós-sequenciamento e obter informações sobre as etapas iniciais da análise downstream. Não se esqueça de que, ao trabalhar com formaldeído, pode ser extremamente perigoso e precauções

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

O método de Hi-C permite a identificação imparciais, de todo o genoma de interações cromatina (1). Oi-C casais ligadura proximidade e seqüenciamento massivamente paralelo. Os dados resultantes podem ser usados ​​para estudar a arquitetura genômica em múltiplas escalas: resultados iniciais identificadas características como territórios cromossomo, a segregação da cromatina abertas e fechadas, e estrutura da cromatina na escala megabase.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

Cromatina Análise de Interação por Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) é um método...

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

A combinação de cromatina imunoprecipitação e sequenciamento ultra-high-throughput (CHIP-seq) pode identificar e mapear as interações DNA-proteína em uma determinada linha de tecido ou célula. Delineado é como gerar um modelo de alta chip de qualidade para o seqüenciamento posterior, utilizando a experiência com o fator de transcrição TCF7L2 como um exemplo.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

Descrevemos aqui uma plataforma que permite a detecção de teste do cometa de danos no DNA, com taxa de transferência sem precedentes. Os padrões de dispositivos de células de mamíferos para um microarranjo e permite o processamento em paralelo de amostras 96. A abordagem facilita a análise de danos ao DNA nível base, danos ao DNA induzidos por exposição e reparo do DNA cinética.

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Este artigo descreve um protocolo chip-seq semiautomado e microescalado de regiões de DNA associadas a uma modificação de histona específica (H3K27ac) usando uma plataforma de manipulador de líquidos ChIP, seguido de preparação da biblioteca usando tagmentação. O procedimento inclui avaliação de controle para fins de qualidade e quantidade e pode ser adotado para outras modificações de histona ou fatores de transcrição.

Um procedimento de ChIP-Seq semiautônomo para estudos epigenéticos em larga escala

ATAC-seq é um método de sequenciamento de DNA que usa a transposase mutante hiperativa, Tn5, para mapear mudanças na acessibilidade da cromatina mediadas por fatores de transcrição. O ATAC-seq permite a descoberta dos mecanismos moleculares subjacentes às alterações fenotípicas nas células cancerígenas. Este protocolo descreve procedimentos de otimização para ATAC-seq em tipos de células epiteliais, incluindo células cancerígenas.

Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Um protocolo otimizado de Clivagem Sob Alvos e Liberação Usando Nuclease seguida de sequenciamento de próxima geração (CUT&amp;RUN-seq) é descrito para linhas celulares de câncer de pulmão de pequenas células neuroendócrinas. Ele permite o mapeamento genômico de várias modificações de histonas e locais de ligação do fator de transcrição (por exemplo, E2F7) para investigar a desregulação epigenética e transcricional na patobiologia do SCLC.

Mapeamento genômico amplo de modificações histonas e sítios de ligação de fatores de transcrição em linhas celulares neuroendócrinas de câncer de pulmão de pequenas células usando CUT&amp;RUN

Aprenda a identificar padrões de estados cromatínicos em tecidos tumorais usando ChIP-seq de alta produtividade. Este método permite processar múltiplas modificações de histonas simultaneamente para estudar epigenética do câncer.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor (Vídeo) | JoVE Journal

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

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