Name: Modelos de mouse da infecção por Helicobacter e patologias gástricas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprenda a estabelecer infecção por Helicobacter em camundongos e analisar alterações histopatológicas gástricas. Este método permite estudar a patogênese bacteriana e desenvolver terapias para infecções gastrointestinais.

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Os autores gostaria de agradecer a Sra. r. De Paoli e MS. Georgie Wray-McCann para assistência técnica. Os autores reconhecem a utilização das instalações e assistência técnica da plataforma de histologia de Monash, departamento de anatomia e biologia do desenvolvimento, Universidade de Monash. O laboratório é suportado pelo financiamento da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) para RLF (APP1079930, APP1107930). RLF é apoiado por uma bolsa de pesquisa sênior do NHMRC (APP1079904). KD e MC são suportados por bolsas de pós-graduação de Monash. KD também é apoiado pelo centro de imunidade inata e infecciosa doenças, Hudson Instituto de pesquisa médica, enquanto MC tem uma bolsa de pós-graduação internacional desde a faculdade de medicina, enfermagem e Ciências da saúde, Universidade de Monash. Pesquisa no Instituto de investigação médica Hudson é suportada pelo programa de apoio de infra-estrutura operacional do governo vitoriano.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve a utilização de um modelo de rato in vivo de Helicobacter infecção. Os passos críticos do processo são a: 1) preparação de inóculos de Helicobacter contendo bactérias motile e viáveis; 2) a entrega dos números adequados de bactérias para o mouse através de gavagem intragástrico; 3) a detecção da infecção bacteriana por contagem de colônia e/ou PCR; e 4) processamento de tecidos gástricos para permitir a avaliação da histopatologia em infectados estômagos. Mais sugestões ...

Helicobacter pylori é um patógeno gástrico em forma de espiral, Gram-negativo, humano presente em todas as populações em todo o mundo, com taxas de infecção nos países em desenvolvimento, estima-se que na ordem de 80%1. Embora a maioria dos H. pylori-indivíduos infectados são assintomáticos, alguns desenvolvem doenças mais graves, variando de ulceração péptica a câncer gástrico2. H. pylori-cancros associados amplamente são caracterizadas por alterações malignas nas células epiteliais (GECs) ou pela formação de tecidos linfoides extra nodais no estômago, resultando em adenocarcinoma gástrico ou mucosa associada linfoide linfoma do tecido (MALT), respectivamente. H. pylori é altamente adaptado para sobreviver no nicho ecológico duro do estômago devido à presença de vários fatores de virulência e mecanismos para facilitar a sua aderência, o crescimento e o metabolismo nesse nicho. Em particular, cepas virulentas de H. pylori possuem a 40KB cag ilha de patogenicidade (cagPascoal) que codifica aproximadamente 30 genes necessários para a produção de um tipo 4 secreção system (T4SS)3,4 . CAG Pascoal-positivo cepas de H. pylori são associadas com a indução de níveis mais elevados de inflamação crônica no acolhimento, que tem sido implicado como um precursor essencial do adenocarcinoma gástrico5.
Na vivo modelos animais, particularmente os ratos, tem sido altamente informativos, permitindo que os pesquisadores a investigar as contribuições relativas de anfitrião, bacterianas e condições ambientais na infecção pelo H. pylori e doença resultado6. Estudos têm demonstrado anteriormente que prolongou o H. pylori infecção de ratos sobre os resultados do fundo genético de C57BL/6 no desenvolvimento da gastrite crônica e glândula atrofia, as duas principais características do H. pylori infecção7. Além disso, a infecção com as espécies bacterianas relacionadas canino/felino, a H. felis, foi mostrada para induzir a formação de malte em camundongos com patologia semelhante e progressão da doença, visto na humana malte linfoma8,9. O mais comumente usado o H. pylori isolada em estudos de colonização do rato é o "Sydney tensão 1" (SS1) tensão10, que é o cagPascoal+ , mas tem um T4SS não-funcional (T4SS−)11. Outras cepas amplamente utilizadas incluem H. pylori B128 7.13 (cagPascoal+/T4SS+)12 e X47-2AL (cagPascoal–/T4SS−)13. Para H. felis infecções, a estirpe CS1 ("gato espiral 1", cagPascoal–/T4SS−) é usado geralmente14.
Neste documento, nós fornecemos um protocolo descrevendo a preparação de inóculos de Helicobacter infecção na vivo , o procedimento para gavage intragástrico de ratos, bem como métodos para o processamento dos tecidos para o estudo das alterações histopatológicas no estômago. Em particular, este artigo focalizará os métodos histológicos usado para visualizar a colonização bacteriana e avaliar as mudanças histopatológicas, incluindo formação de malte, na mucosa gástrica de ratos infectados. Alguns dos métodos descritos aqui podem ser adaptados para o estudo de outros patógenos de intestino como S. Typhimurium ou c. rodentium.

<table><tbody><tr><td>Reagentes bacteriológicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxoid Blood Agar Base No.2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CM0271B</td><td>Dissolver em água deinonizada antes da esterilização</td></tr><tr><td>Sangue de cavalo desfibrinado premium</td><td>Australian Ethical Biologicals</td><td>PDHB100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion Broth</td><td>BD Bioscience</td><td>237500</td><td>Dissolva em água desinonizada antes da esterilização</td></tr><tr><td>Pacotes de gás CampyGen</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CN0035A/CN0025A</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes histológicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalina, tamponado neutro, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Álcool absoluto, 100% desnaturado</td><td>ChemSupply</td><td>AL048-20L-P</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (2-propanol)</td><td>Merck</td><td>100995</td><td></td></tr><tr><td>Xileno (sem enxofre)</td><td>ChemSupply</td><td>XT003-20L</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's Haematoxylin</td><td>Amber Scientific</td><td>MH-1L</td><td>Filtro antes do uso</td></tr><tr><td>Eosina, Coloração Aquosa</td><td>Amber Scientific</td><td>EOCA-1L</td><td>Filtro antes do uso</td></tr><tr><td>Coloração Wright-Giemsa, modificado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WG80-2.5L</td><td>Diluir antes de usar (20% Giemsa, 80% água deionizada)</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Grale Scientific</td><td>11031/5</td><td></td></tr><tr><td>DPX meio de montagem</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td><forte>Reagentes de biologia molecular</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Kit de ensaio</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>A temperatura de recozimento dos primers ureB usados neste estudo é de 61 &graus; C</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA Polimerase</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>O kit inclui 10x tampão PCR e dNTPs de cloreto de magnésio</td></tr><tr><td></td><td>Bioline</td><td>BIO-39028</td><td>Diluir a 10 mM em água livre de nuclease estéril antes de usar</td></tr><tr><td>Grau molecular</td><td>Agarose Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydrogen Carbonate</td><td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td><td>A475-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnésio Sulfato Heptahidratado</td><td>Chem-Supply</td><td>MA048-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2002-1G</td><td>Dissolver em água deionizada</td></tr><tr><td>Polimixina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4932-5MU</td><td>Dissolver em água deionizada</td></tr><tr><td>Trimetoprim (&ge; 98% HPLC)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>T7883</td><td>Dissolver em 100% (absoluto) Etanol</td></tr><tr><td>Anfotericina</td><td>Amresco (Astral Scientific)</td> <td>E437-100MG</td><td>Dissolver em água deionizada</td></tr><tr><td>Bacitracina de Bacillus licheniformis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0125</td><td>Dissolver em água deionizada</td></tr><tr><td>Ácido naladícico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878</td><td>Dissolver em água deionizada</td></tr><tr><td><forte>Outros reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metoxiflurano (Pentrhox)</td><td>Medical Developments International</td><td>Não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Cera</td> de <td>parafina Paraplast Plus, Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td><forte>Equipamento e material plástico</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Frascos anaeróbicos de oxóide</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>HP0011/HP0031</td><td></td></tr><tr><td>COPAN Pasteur Pipetas</td><td>Interpath Services</td><td>200CS01</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R centrífuga</td><td></td><td></td><td>Colete pellets bacterianos por centrifugação a 2.200 rpm por 10 minutos a 4 &graus; </td></tr><tr><td>Agulha de deslizamento de precisão C 23 g</td><td>BD Bioscience</td><td>301805</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis, VWR</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de furo fino Portex</td><td>Smiths Medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Cateteres de alimentação de plástico</td><td>Instech&nbsp; Laboratórios</td><td>FTP20-30</td><td></td></tr><tr><td>Seringas descartáveis de 1 mL tuberculina luer slip</td><td>BD Bioscience</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>Micropilão Eppendorf para tubos de 1,2 - 2 mL</td><td></td><td>Pilões de polipropileno autoclaváveis Sigma Aldrich Z317314 usados para homogeneização do estômago</td><td></td></tr><tr><td>Dissociador GentleMACs</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Use um gentleMACS predefinido Programas para tecido estomacal de camundongo</td></tr><tr><td>Tubos M (tampa laranja)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Loop de plástico estéril</td><td>LabServ</td><td>LBSLP7202</td><td></td></tr><tr><td>Cold Plate, Leica EG1160 Sistema de Incorporação</td><td>Leica Biosystems</td><td>Não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4124</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek III Sistema Uni-</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>Microtome, Leica RM2235</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Charged SuperFrost Plus lâminas de vidro</td><td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

modelos de mouse da infecção por helicobacter e patologias gástricas

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori é um patógeno gástrico que está presente em metade da população mundial e é uma importante causa de morbidade e mortalidade em seres humanos. Vários modelos de rato da infecção gástrica por Helicobacter foram desenvolvidos para estudar os mecanismos moleculares e celulares, segundo o qual a bactéria H. pylori coloniza o estômago de hospedeiros humanos e causar doença. Aqui, descrevemos os protocolos: 1) preparar suspensões bacterianas para a infecção na vivo de ratos através de gavagem intragástrico; 2) determinar os níveis de colonização bacteriana nos tecidos gástricos de rato, por reação em cadeia da polimerase (PCR) e a contagem viável; e 3) avaliar as alterações patológicas, pela histologia. Para estabelecer Helicobacter infecção em ratos, os animais (SPF) isentos de agentes patogénicos específicos primeiro são inoculados com suspensões (contendo ≥ 105 unidades formadoras de colônia, CFUs) de cepas de rato-colonização de qualquer Helicobacter pylori ou outros gástrica spp. Helicobacter de animais, tais como felis Helicobacter. A pós-infecção pontos de tempo apropriado, estômagos são extirpados e dissecados essas em dois fragmentos de tecido igual, cada um compreendendo as regiões de antro e corpo. Dentre estes fragmentos é usado para contagem viável ou extração de DNA, enquanto o outro é submetido a processamento histológico. Colonização bacteriana e alterações histopatológicas no estômago poderão ser avaliadas rotineiramente em seções do tecido gástrico manchadas de Warthin-Starry, Giemsa ou hematoxilina e eosina (H & E) manchas, conforme apropriado. Análises imunológicas adicionais também podem ser efectuadas por imuno-histoquímica ou imunofluorescência em secções de tecido gástrico de rato. Os protocolos descritos abaixo são projetados especificamente para permitir a avaliação em ratos de patologias gástricas, parecidos com os de humanos relacionados com H. pylori doenças, incluindo inflamação, atrofia da glândula e formação de folículos linfoides. A preparação do inóculo e protocolos de gavage intragástrico também podem ser adaptados para estudar a patogênese de outros patógenos humanos entéricos que colonizam a ratos, tais como Salmonella Typhimurium ou Citrobacter rodentium.

Este protocolo descreve uma técnica de gavagem oral para alcançar intragástrico infecção com H. pylori ou H. felis em modelos do rato murino (Figura 1). Após eutanásia, estômagos são removidos, pesados e divididos em 2 metades iguais, compreendendo os antro, corpo e regiões não-glandular dos tecidos gástricos (Figura 2). A região não-glandular é removida antes de realizar qualquer análise.
Colonização bem sucedida do...

Os ratos representam um modelo inestimável na vivo para estudar a infecção e doenças causadas por microorganismos gastrointestinais. Aqui, descrevemos os métodos utilizados para estudar a colonização bacteriana e alterações histopatológicas em modelos do rato do Helicobacter pylori-doenças relacionadas.

Modelos de mouse da infecção por Helicobacter e patologias gástricas

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da gastroenterologia sobre o impacto dos membros da microbiota, especificamente os do gênero Helicobacter, sobre inflamação e câncer. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o estudo da infecção por Helicobacter e seu impacto no estômago em condições fisiológicas. As implicações dessa técnica se estendem para o desenvolvimento de terapias para a prevenção ou eliminação da infecção por Helicobacter ou suas consequências, incluindo antibióticos, medicamentos ou vacinas.Esses métodos fornecem insights específicos para a patogênese da infecção por Helicobacter. No entanto, várias das técnicas podem ser adaptadas ao estudo de outros patógenos gastrointestinais. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão com a preparação de um inóculo bacteriano capaz de estabelecer uma infecção em camundongos.É imperativo que os isolados helicobacter sejam cepas colonizadoras de camundongos que não sofreram subcultura extensiva in vitro. Além disso, deve ser registrado o número de subculturas in vitro para essas cepas. Adicione suspensões bacterianas a tubos de poliestireno de 15 mililitros e use um laço plástico para tra

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o estabelecimento da infecção por Helicobacter pylori por meio da técnica de gavagem intragástrica em um modelo de camundongo. A suspensão bacteriana é administrada através de um cateter inserido pela boca no estômago. As bactérias inoculadas colonizam e estabelecem uma infecção no estômago, que pode ser usada para estudar a interação patógeno-hospedeiro.

Uma técnica de gavagem intragástrica para infecção controlada por Helicobacter em camundongos

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para quantificar a carga de Helicobacter pylori em tecidos estomacais de camundongos pós-infecção para confirmar sua colonização.

Quantificação da carga de Helicobacter pylori no estômago de um camundongo infectado

Este vídeo demonstra um método para estabelecer um modelo de infecção de organoides gástricos por microinjeção do patógeno gástrico Helicobacter pylori no lúmen dos organoides. Este modelo ajuda no estudo das alterações induzidas por infecções nas células gástricas.

Estabelecendo um Modelo de Infecção por Microinjeção de Organoides Gástricos com Bactérias Patogênicas

Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de infecções bacterianas entéricas, bem como resposta imune do hospedeiro e colite em ratos. Este protocolo descreve a medição da integridade da barreira, a carga de patógenos e danos histológicos permitindo a caracterização completa de agentes patogénicos e de acolhimento contribuições para colite infecciosa murino.

O<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Modelo de Rato: Contribuições Estudar patógeno e hospedeiro para Colite Infecciosa

Aqui descrevemos um método para visualizar a organela bacteriana oncogênica conhecida como Sistema de Secreção Cag Tipo IV (Cag-T4SS).  Descobrimos que o Cag-T4SS é produzido diferencialmente na superfície de H. pylori em resposta a condições variáveis de disponibilidade de ferro.

Alta resolução de Microscopia Eletrônica da Helicobacter pylori Cag Tipo IV Secreção Sistema Pili Produzido em diferentes condições de Ferro Disponibilidade

Este artigo demonstra procedimentos cirúrgicos de refluxo gastroesofágico com camundongos. Esses modelos são ferramentas úteis para pesquisa sobre mecanismos e tratamento da doença do refluxo gastroesofágico e potencialmente esôfago de Barrett e adenocarcinoma esofágico.

Modelos cirúrgicos de refluxo gastroesofágico com Ratos

As culturas derivadas de células-tronco abrigam um tremendo potencial para modelar doenças infecciosas. Aqui, a cultura de organoides gástricos de camundongos e humanos derivados de células-tronco adultas é descrita. Os organoides são microinjetados com o patógeno gástrico Helicobacter pylori.

Organóides como modelo para Doenças Infecciosas: Cultura dos Direitos Humanos e Organóides e estômago murino Microinjection do Helicobacter pylori

Um protocolo detalhado de um modelo de mouse para enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) colonização usando bactérias bioluminescência-etiquetado é apresentado. A detecção destas bactérias bioluminescentes por um não-invasivo na vivo sistema de animais vivos de imagem pode avançar nossa compreensão atual da colonização de EHEC.

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Realizamos uma avaliação sistemática dos pacientes com diagnóstico de neoplasia intraepitelial gástrica de baixo grau por biópsia endoscópica prévia e obtivemos o diagnóstico anatomopatológico pela ressecção completa da lesão por dissecção endoscópica da submucosa (DES), analisando fatores que potencialmente aumentam o risco de escalonamento patológico.

Estabelecimento e Avaliação de um Modelo de Predição de Risco para Escalonamento Patológico de Neoplasia Intraepitelial Gástrica de Baixo Grau

Esse protocolo descreve um método de imunocoloração do estômago inteiro modificado a partir da técnica "Swiss roll" originalmente desenvolvida para o intestino murino.

Mapeamento Espacial Aprimorado das Camadas de Músculo Gástrico de Camundongos usando uma técnica modificada do Swiss Roll

Aprenda a estabelecer infecção por Helicobacter em camundongos e analisar alterações histopatológicas gástricas. Este método permite estudar a patogênese bacteriana e desenvolver terapias para infecções gastrointestinais.

Modelos de mouse da infecção por Helicobacter e patologias gástricas

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