Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma perfusão hepática de camundongo bem-sucedida para facilitar a purificação de populações específicas de células hepáticas de interesse. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da hepatologia sobre como auxiliar as funções de populações específicas de células hepáticas em ensaios in vitro ou in vivo. A principal vantagem desta técnica é a alta quantidade de hepatócitos nas células endoteliais sinusoidais que podem ser obtidas de cada fígado.

A demonstração visual deste método é crítica, pois é essencial ver a cor e a forma de um fígado digerido de maneira ideal para preservar a viabilidade celular. Para colocar o cateter da veia porta, primeiro use a parte de trás de uma pinça para mover os intestinos para o lado direito da cavidade abdominal do camundongo, expondo a veia porta, e use uma pinça curva para deslizar um pedaço de linha de costura de poliéster de 20 centímetros sob a veia porta entre o fígado e a veia duodenal do pâncreas superior. Use a pinça para puxar cuidadosamente o fio para o outro lado do animal, de modo que fique centralizado sob a veia porta.

E dê um nó solto ao redor da veia porta. Coloque a pinça curva sob a veia e puxe suavemente todo o material do tecido em direção à cauda para endireitar a veia. Em seguida, coloque o chanfro de uma agulha de cateter voltado para cima e paralelo à parte inferior da veia porta perto da pinça e puncione suavemente a veia com a agulha.

Quando o chanfro estiver no lúmen da veia, retraia a agulha com mola e continue a empurrar o cateter palmer através da veia, até que o chanfro esteja próximo à área ramificada da vênus. Depois de prender o nó ao redor do cateter, ajuste imediatamente a bomba peristáltica a quatro milímetros por minuto e conecte a extremidade macho do tubo à extremidade fêmea do cateter, momento em que você deve começar a ver o ramo hepático. Corte a aorta abdominal para drenagem.

Use fita adesiva para imobilizar o tubo na almofada inferior. Use a tesoura para cortar a pele abdominal verticalmente, para permitir a drenagem do sangue e do líquido de perfusão. Em seguida, aperte o vaso sanguíneo efluente algumas vezes com a pinça reta para inflar o fígado, garantindo que todo o sangue tenha sido drenado, e perfunda o fígado com PBS até que o tecido hepático empalideça.

Para colher os hepatócitos, primeiro troque a tubulação de saída do frasco de um litro de PBS para um frasco de 125 mililitros, contendo tampão dois, suplementado com colagenase-4. Quando a colagenase atingir o fígado, aperte brevemente, mas com força, o vaso sanguíneo efluente para aumentar a pressão e permitir que o tampão de digestão preencha todos os lobos do fígado. Libere o vaso antes que o tampão rompa o tecido conjuntivo ao redor do fígado.

E permita que o tampão se perfunda no fígado até que todo o volume tenha fluído pelo tecido. Em seguida, coloque um prato cristalizador contendo 10 mililitros de tampão ao lado do mouse e use uma pinça reta e uma tesoura para transferir o fígado para o prato. Transfira o prato para uma capa de cultura de tecidos estéril e, usando a técnica estéril, pegue o fígado para retirar a cápsula.

Agite suavemente as células do tecido hepático e despeje a solução celular resultante através de um filtro de 100 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, enxágue os restos de fígado do filtro com mais tampão um. Quando o fígado parecer desprovido de células, coe o filtrado puxado através de um filtro de 40 mícrons em um segundo tubo de 50 mililitros e colete as células por centrifugação.

Despeje a célula não parenquimatosa e o hepatócito morto contendo sobrenadante em um novo tubo de 50 mililitros no gelo em um movimento, para preservar o pellet e ressuspender o pellet em 40 mililitros de tampão fresco um para a próxima centrifugação. Para isolar as células endoteliais sinusoidais, centrifugue os sobrenadantes contendo células não parenquimatosas. Puxe as suspensões de células em um único tubo cônico novo de 50 mililitros e aumente o volume total para 35 mililitros.

Colete as células puxadas por centrifugação e use uma pipeta de 25 mililitros para transferir cuidadosamente os 25 mililitros superiores da célula não parenquimatosa contendo sobrenadante para um novo tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Adicione 25 mililitros de meio fresco ao tubo e ressuspenda o pellet para uma segunda centrifugação e remoção do sobrenadante. Em seguida, centrifugue o sobrenadante e adicione 15 mililitros de uma solução de 50% Percoll a um novo tubo de 50 mililitros.

Usando um pipetador ajustado para a velocidade de ejeção mais baixa, sobreponha 20 mililitros de 25% de Percoll na solução de 50% de Percoll e ressuspenda as células não parenquimatosas em 10 mililitros de meio de quatro graus Celsius. Coloque cuidadosamente as células em camadas na solução de Percoll. E separe as células por centrifugação de gradiente de densidade.

Em seguida, aspire os primeiros 30 mililitros de solução e use uma pipeta de transferência plástica de cinco mililitros para coletar as células endoteliais sinusoidais e de Kupffer localizadas na interfase da solução de gradiente de densidade de 25 a 50% em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Lave as células com 50 mililitros de meio e ressuspenda o pellet enquanto enxágue as laterais do fundo do tubo em 12 mililitros de meio quente. Para separar as células endoteliais sinusoidais das células de Kupffer, transfira a suspensão celular para uma placa de Petri de poliestireno em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada por oito minutos.

No final da incubação, use uma pipeta de 25 mililitros para aspirar o sobrenadante e use o sobrenadante para enxaguar o prato com a pipeta ajustada na velocidade mais baixa para coletar as células endoteliais sinusoidais restantes. Em seguida, transfira as células endoteliais sinusoidais para um novo tubo de 50 mililitros. Em seguida, colete as células por centrifugação para sua ressuspensão e plaqueamento em placas de cultura de células revestidas com colágeno.

A microscopia eletrônica de varredura do fígado de um camundongo após a perfusão infixitiva da PBS de maneira semelhante à demonstrada revela uma visão clara da microanatomia hepática e das microvilosidades entre os hepatócitos. Os hepatócitos colhidos durante os giros de baixa velocidade no início do procedimento, demonstram uma alta pureza após quatro lavagens em albumina de soro bovino contendo tampões. A separação das células endoteliais sinusoidais por adesão seletiva em uma placa de Petri de poliestireno revestida com colágeno resulta em uma pureza de 83 a 90% que depende em grande parte da eficácia geral da digestão da colagenase.

Medições quantitativas usando microscopia de luz de um procedimento de separação representativo, como acabamos de demonstrar, revelam resultados típicos de isolamento de uma população de hepatócitos quase 100% puros. E uma população de células endoteliais sinusoidais de pouco mais de 89% puras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como catetetizar uma veia porta de camundongo e de como purificar hepatócitos e células endoteliais sinusoidais do fígado de camundongo.

Este procedimento também pode ser usado para purificar células satélites da fração não parenquimatosa após o isolamento de hepatócitos usando diferentes gradientes de densidade e velocidades de centrifugação.