Engenharia 'Dourada' fluorescência por pressão seletiva de incorporação de aminoácidos não-canônicos e análise de proteínas por espectrometria de massa e fluorescência

O objetivo deste experimento é substituir um aminoácido canônico por um aminoácido não canônico para produção de proteína recombinante por incorporação de pressão seletiva para produzir a nova proteína fluorescente de ouro. O método de incorporação seletiva por pressão destina-se a produzir proteínas com novas características químicas. Isso é especialmente útil ao tentar entender ou projetar a função da proteína.

A principal vantagem dessa técnica é que ela é relativamente simples de conduzir, pois é semelhante à produção de proteínas recombinantes comuns. A fluorescência correlacionada ao tempo e ao comprimento de onda é útil para investigar a dinâmica do estado excitado da proteína modificada, o que, por sua vez, facilita a compreensão da influência do aminoácido não canônico introduzido no cromóforo nas propriedades ópticas. O SPI pode, em princípio, ser aplicado a qualquer ambiente de produção de proteínas para o qual cepas auxotróficas e meios quimicamente definidos estejam disponíveis.

Isso inclui outras cepas bacterianas e também cultura de células de mamíferos. O tempo e a configuração das condições de expressão são críticos, pois é obrigatório suprimir a produção da proteína selvagem não modificada. É por isso que certos parâmetros, como a temperatura, o tempo de indução ou a composição do meio de cultivo, precisam ser otimizados.

Tivemos a ideia para este método pela primeira vez após estudos iniciais de extrato de proteína com aminoácidos contendo metil, como a selenometionina. Demonstrando o procedimento estará Almut Pelzer, um aluno do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, transforme as células de E.coli auxotróficas de triptofano com o plasmídeo de expressão para ECFP.

Use uma única colônia para inocular uma pré-cultura de cinco mililitros de meio LB suplementado com ampicilina em um tubo de cultura. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 200 rpm. No dia seguinte, inocular 100 mililitros de meio NMM19 suplementado usando um mililitro da cultura noturna em um frasco Erlenmeyer de um litro.

Em seguida, incube a cultura durante a noite em um agitador orbital a 200 rpm e 30 graus Celsius. No dia seguinte, meça a densidade óptica em 600 nanômetros a cada 30 minutos até que o valor mude em menos de 0,05 em 30 minutos. Em seguida, centrifugue a cultura a 5.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos para colher as células bacterianas.

Rejeitar o sobrenadante por decantação. Ressuspenda as células em meio NMM19 suplementado com ampicilina até um volume total de 100 mililitros. Transferir esta suspensão de volta para o mesmo balão do Erlenmeyer.

Adicionar 4-amino-indol a uma concentração final de um milimolar. Incubar em um agitador orbital por 30 minutos a 30 graus Celsius e 200 rpm. Após 30 minutos, adicione IPTG à cultura até uma concentração final de 0,5 milimolar para induzir a expressão do gene alvo.

Incubar durante a noite em um agitador orbital a 30 graus Celsius e 200 rpm. No dia seguinte, colha as células bacterianas centrifugando a 5.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Rejeitar o sobrenadante por decantação.

Congele o pellet celular a menos 20 graus Celsius ou menos 80 graus Celsius até que esteja pronto para realizar a purificação da proteína alvo. Primeiro, prepare o lisado de células bacterianas conforme descrito no protocolo de texto. Depois de preparar a coluna de cromatografia de acordo com as instruções do fabricante, use um tampão de ligação para equilibrar a coluna de cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados.

Carregue o lisado na coluna até a conclusão. Observe a proteína dourada ligada à resina de cromatografia. Lave a coluna com tampão de encadernação.

Em seguida, elui a proteína alvo usando tampão de eluição. Colete e agrupe todas as frações eluídas que contenham proteína fluorescente dourada, que pode ser identificada pela cor dourada visível. Depois disso, prepare uma membrana de diálise com um corte de peso molecular entre 5.000 e 10.000 de acordo com as instruções do fabricante.

Dialise uma amostra de um mililitro contra pelo menos 100 mililitros de tampão por um mínimo de duas horas. Para começar, use tampão MS para diluir a amostra de proteína para 0,1 miligramas por mililitro, de modo que o volume final seja de 80 microlitros. Pipete cuidadosamente para misturar.

Transfira a solução para um frasco para injetáveis de amostrador automático MS com inserção de vidro e feche-o com uma tampa. Agite o frasco para remover as bolhas de ar. Em seguida, prepare um branco contendo tampão MS em um segundo frasco.

Coloque os dois frascos no amostrador automático de HPLC. Depois disso, prepare e calibre o instrumento MS de acordo com as instruções do fabricante. Defina o volume de injeção do amostrador automático para cinco microlitros para a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao método de espectrometria de massa por tempo de voo de ionização por eletrospray.

Crie uma lista de trabalho para a execução em branco, seguida pela execução de exemplo do GdFP. Atribua o volume de injeção, as posições correspondentes do frasco do amostrador automático e execute a lista de trabalho. Para começar, prepare uma solução de proteína fluorescente de ouro e o detector para contagem de fótons únicos correlacionados ao tempo e comprimento de onda, conforme descrito no protocolo de texto.

Usando um software de contagem de fótons únicos, adquira a emissão de fluorescência a uma taxa de contagem de cerca de 200.000 fótons por segundo até que aproximadamente 10.000 contagens sejam acumuladas no máximo de aquisição das curvas de decaimento de fluorescência. Depois disso, substitua a cubeta de amostra por uma cubeta de quartzo de um centímetro preenchida com sílica coloidal em tampão PBS. Retire o filtro de laser e ajuste a grade para a aquisição de fótons de 470 nanômetros no canal central do detector.

Em seguida, adquira a função de resposta instrumental até que aproximadamente 10.000 contagens sejam acumuladas no máximo de emissão. Converta, ajuste e plote os dados resultantes conforme descrito no protocolo de texto para obter os espectros associados ao decaimento, que representam a dependência dos tempos de decaimento da fluorescência no comprimento de onda de emissão. Neste estudo, a espectrometria de massa é usada para confirmar que a variante de fluoróforo do tipo proteína fluorescente verde espectralmente deslocada para o vermelho, denominada proteína fluorescente dourada, é produzida com sucesso.

Enquanto o ECFP do tipo selvagem tem uma massa de proteína calculada de 28.283,9 daltons após a maturação do cromóforo, a massa correspondente de proteína fluorescente de ouro é de 28.313,9 daltons. O espectro ESI-MS descomplicado da proteína fluorescente de ouro exibe um pico de massa principal em aproximadamente 28.314,1 daltons, desviando-se do valor teórico em menos de 10 partes por milhão. Isso confirma a incorporação do aminoácido não canônico por incorporação de pressão seletiva.

O espectro de absorção do ECFP tem dois máximos característicos em 434 nanômetros e 452 nanômetros. Em contraste, a proteína fluorescente de ouro é caracterizada por uma ampla banda de absorção com desvio para o vermelho com o máximo de 466 nanômetros. Enquanto o máximo de absorção do EGFP é ainda mais desviado para o vermelho para 488 nanômetros, o espectro de emissão de fluorescência da proteína fluorescente dourada e o correspondente deslocamento de Stokes do GdFP significa que é o mais desviado para o vermelho de todos os derivados da proteína fluorescente verde Aequorea victoria.

A emissão de fluorescência resolvida no tempo monitorada pela contagem de fótons únicos é mostrada aqui. As curvas de decaimento exibem um decaimento de fluorescência ligeiramente mais rápido a 600 nanômetros do que a 550 nanômetros. A emissão de fluorescência da proteína fluorescente dourada depende fortemente do pH, como é típico de muitas variantes de proteínas fluorescentes verdes.

Como visto aqui, há uma clara diminuição na fluorescência em pH mais baixo, embora as características espectrais permaneçam constantes. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três dias a partir de colônias de células bacterianas transformadas ou de estoques de glicerol congelados. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que o aminoácido alvo esteja esgotado.

O ncAA deve ser absorvido pela célula, biocompatível e incorporado às proteínas pela cepa auxotrófica escolhida. Seguindo este procedimento, uma grande variedade de proteínas pode ser gerada para fins de engenharia. Dependendo dos métodos de proteína-alvo, como analisadores de estabilidade de proteínas, ensaios de atividade enzimática, espectroscopia de fluorescência ou cristalização de proteínas, podem ser usados para descrever a influência do aminoácido não canônico nas propriedades funcionais e estruturais.

Após seu desenvolvimento, essa técnica provou ser muito útil no campo da biologia sintética, fornecendo-lhe proteínas e proteomas novos para a natureza. Isso expande as capacidades químicas para a engenharia de proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como incorporar aminoácidos não canônicos em proteínas recombinantes por incorporação de pressão seletiva, como verificar a introdução de um aminoácido artificial por espectrometria de massa e como analisar uma proteína fluorescente por fluorescência resolvida no tempo.