Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

O objetivo geral deste protocolo é produzir baculovírus em cultura de células de insetos, purificar com cromatografia de afinidade de heparina e concentrar-se com ultracentrifugação. O produto final pode ser usado para transferência de genes in vivo ou como vacina. Este método pode ajudar os pesquisadores que desejam usar baculovírus purificado e concentrado para aplicação em terapia gênica.

As partículas de baculovírus podem conter detritos celulares e proteínas da cultura Sf9 que podem induzir inflamação ou resposta imune quando usadas em pessoas. Para evitar toxicidade, o baculovírus é purificado e separado das partículas contaminantes. Algumas partes do procedimento serão demonstradas por Marilou Narciso, assistente de pesquisa do meu laboratório.

Para configurar a cultura em suspensão, semeie 50 mililitros de células Sf9 em meio de cultura de insetos em um frasco Erlenmeyer de policarbonato de 250 mililitros. E coloque o frasco em uma incubadora agitadora orbital. Adicione dois mililitros de caldo de baculovírus P2 às células e agite a 135 rpm, mantendo uma temperatura constante de 28 graus Celsius.

Quatro dias após a infecção, toda a população de células Sf9 apresentará efeito citopático, o que é uma indicação de alta produção de baculovírus de título. Amplificar sequencialmente o baculovírus até que o volume desejado seja obtido, aumentando o volume de cultura de células em cada infecção subsequente de 10 a 50 vezes. Depois de centrifugar o sobrenadante final do baculovírus por 30 minutos a 1000g e quatro graus Celsius para separar os detritos celulares do curso, transfira o sobrenadante para um recipiente limpo e trate com nuclease a 50 unidades por mililitro por duas horas a 37 graus Celsius para digerir o DNA genômico e o RNA.

Finalmente, filtre o sobrenadante viral através de uma unidade de filtração de 0,45 mícron. Configure o sistema de cromatografia colocando a linha de tampão de lavagem da porta de entrada A1 em um frasco contendo pelo menos 500 mililitros de tampão de lavagem. Use a porta de entrada do buffer A2 para carregar o buffer de eluição.

Insira vários tubos cônicos de 50 mililitros no coletor de frações para coletar o sobrenadante do baculovírus de passagem da coluna, o tampão de lavagem e o baculovírus iludido. Equilibre a coluna de heparina com cinco volumes de coluna de 7,9 mililitros de tampão de lavagem a uma taxa de fluxo linear de sete mililitros por minuto. Carregue 250 mililitros de sobrenadante de baculovírus na coluna de heparina usando a bomba de amostra da porta de amostra de entrada a uma taxa de fluxo linear de dois mililitros por minuto.

Em seguida, execute 10 volumes de coluna de tampão de lavagem através da coluna de heparina a uma taxa de fluxo linear de dois mililitros por minuto até que a curva de absorbância ultravioleta retorne à linha de base e se torne estável. Evite as partículas de baculovírus da coluna de heparina com cinco volumes de coluna de tampão de eluição a uma taxa de fluxo linear de quatro mililitros por minuto. Observe um pico acentuado de eluição de proteína no cromatograma quando as partículas de baculovírus se dissociam da coluna de heparina.

Após a eluição, diluir imediatamente o sobrenadante de baculovírus iludido 10 vezes usando tampão fosfato de sódio de 20 milímetros para evitar a ativação de partículas de baculovírus por choque osmótico durante a centrifugação subsequente. Inicie o procedimento de concentração adicionando um volume igual do sobrenadante do baculovírus à autoclave aos tubos de ultracentrífuga. Meça o peso do tubo por meio de uma balança e ajuste o peso do conteúdo dos tubos de ultracentrífuga com PBS estéril.

Coloque cada um dos tubos da ultracentrífuga em um balde oposto do rotor SW 32 Ti e opere a ultracentrífuga a 80.000g por 90 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, abra os tubos de ultracentrífuga em uma capa de cultura de tecidos e aspire assepticamente o líquido sem remover o pellet de baculovírus. Adicione 200 microlitros de PBS contendo 0,5% BSA e ressuspenda cada pellet pipetando vigorosamente para cima e para baixo.

Finalmente, transfira alíquotas de 50 a 100 microlitros do baculovírus concentrado para criogenials e armazene a 80 graus Celsius negativos. Os títulos de baculovírus foram estimados pela infecção de células HT1080. A linha conectada por diamantes mostra o total de unidades infecciosas de baculovírus em cada fração.

As partículas de baculovírus ligam-se fortemente à coluna de heparina, portanto, nenhuma quantidade significativa de vírus é detectada no tampão de lavagem da coluna. Um pico acentuado de proteína é observado durante a eluição, que corresponde à fração de baculovírus. Os parâmetros utilizados neste protocolo maximizam o rendimento e minimizam a inativação de partículas infecciosas de baculovírus.

Este protocolo pode ser usado para purificação de outros vírus e proteínas que têm afinidade com a heparina.