Name: Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda a rastrear crescimento e metástase tumoral em roedores usando imagem por PET com repórter radionuclídeo-fluorescência. Este método não invasivo reduz o uso de animais em pesquisas oncológicas.

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A pesquisa foi apoiada pelo faculdade Londres do rei e UCL abrangente câncer Imaging centro, financiado pelo Cancer Research UK e EPSRC em associação com a MRC e DoH (Inglaterra); o Instituto Nacional de saúde pesquisa (NIHR) centro de investigação biomédica com base no tipo e St Thomas' NHS Foundation Trust e College London do rei; o centro de excelência em engenharia médica de financiado pela Wellcome Trust e EPSRC sob concessão número WT 088641/Z/09/Z; um câncer Research UK multidisciplinar projeto prêmio GOF e PJB e concessão de saúde parceiros do rei a GOF. Os scanners nanoPET/CT e nanoSPECT/CT foram comprados e mantidos por uma doação de equipamentos da Wellcome Trust. As opiniões expressadas são as dos autores e não necessariamente aqueles de NHS, o NIHR ou o DoH.

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<li>Fruhwirth, G. O., Diocou, S., Blower, P. J., Ng, T., Mullen, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-body+dual-modality+radionuclide+optical+strategy+for+preclinical+imaging+of+metastasis+and+heterogeneous+treatment+response+in+different+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">A whole-body dual-modality radionuclide optical strategy for preclinical imaging of metastasis and heterogeneous treatment response in different microenvironments.</a> J Nucl Med. 55 (4), 686-694 (2014).</li>
<li>Terrovitis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+the+sodium-iodide+symporter+enables+imaging+of+transplanted+cardiac+stem+cells+in+vivo+by+single-photon+emission+computed+tomography+or+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography.</a> J Am Coll Cardiol. 52 (20), 1652-1660 (2008).</li>
<li>Seo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+Macrophage+Migration+Using+Reporter+Gene+Imaging+with+Human+Sodium+Iodide+Symporter+in+Animal+Models+of+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Trafficking Macrophage Migration Using Reporter Gene Imaging with Human Sodium Iodide Symporter in Animal Models of Inflammation.</a> J Nucl Med. 51 (10), 1637-1643 (2010).</li>
<li>Diocou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B18F%5Dtetrafluoroborate-PET%2FCT+enables+sensitive+tumor+and+metastasis+in+vivo+imaging+in+a+sodium+iodide+symporter-expressing+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">[18F]tetrafluoroborate-PET/CT enables sensitive tumor and metastasis in vivo imaging in a sodium iodide symporter-expressing tumor model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 946(2017).</li>
<li>Lajtos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+wall+effect+eliminating+method+to+determine+the+contrast+recovery+coefficient+for+small+animal+PET+scanners+using+the+NEMA+NU-4+image+quality+phantom%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Cold wall effect eliminating method to determine the contrast recovery coefficient for small animal PET scanners using the NEMA NU-4 image quality phantom.</a> Phys Med Biol. 59 (11), 2727-2746 (2014).</li>
<li>Nagy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+evaluation+of+the+small-animal+nanoScan+PET%2FMRI+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Performance evaluation of the small-animal nanoScan PET/MRI system.</a> J Nucl Med. 54 (10), 1825-1832 (2013).</li>
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<li>Jauregui-Osoro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+%5BF-18%5Dtetrafluoroborate%3A+a+PET+imaging+agent+for+thyroid+disease+and+reporter+gene+imaging+of+the+sodium%2Fiodide+symporter%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of [F-18]tetrafluoroborate: a PET imaging agent for thyroid disease and reporter gene imaging of the sodium/iodide symporter.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37 (11), 2108-2116 (2010).</li>
<li>Weeks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+%5B18F%5D-tetrafluoroborate+as+a+potential+PET+imaging+agent+for+the+human+sodium%2Fiodide+symporter+in+a+new+colon+carcinoma+cell+line%2C+HCT116%2C+expressing+hNIS%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Med+Commun%22%5BJournal%5D)">Evaluation of [18F]-tetrafluoroborate as a potential PET imaging agent for the human sodium/iodide symporter in a new colon carcinoma cell line, HCT116, expressing hNIS.</a> Nucl Med Commun. 32 (2), 98-105 (2011).</li>
<li>Khoshnevisan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B%2818%29F%5Dtetrafluoroborate+as+a+PET+tracer+for+the+sodium%2Fiodide+symporter%3A+the+importance+of+specific+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Res%22%5BJournal%5D)">[(18)F]tetrafluoroborate as a PET tracer for the sodium/iodide symporter: the importance of specific activity.</a> EJNMMI Res. 6 (1), 34(2016).</li>
<li>Groot-Wassink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+the+transcriptional+activities+of+human+telomerase+promoter+fragments+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of the transcriptional activities of human telomerase promoter fragments in mice.</a> Cancer Res. 64 (14), 4906-4911 (2004).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioiodine+therapy+of+hepatoma+using+targeted+transfer+of+the+human+sodium%2Fiodide+symporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Radioiodine therapy of hepatoma using targeted transfer of the human sodium/iodide symporter gene.</a> J Nucl Med. 47 (5), 854-862 (2006).</li>
<li>Sieger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-specific+activation+of+the+sodium%2Fiodide+symporter+gene+under+control+of+the+glucose+transporter+gene+1+promoter+%28GTI-1.3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Tumour-specific activation of the sodium/iodide symporter gene under control of the glucose transporter gene 1 promoter (GTI-1.3).</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 30 (5), 748-756 (2003).</li>
<li>Chisholm, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-specific+transgene+expression+mediated+by+systemic+injection+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer-specific transgene expression mediated by systemic injection of nanoparticles.</a> Cancer Res. 69 (6), 2655-2662 (2009).</li>
<li>Klutz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+radioiodine+therapy+of+neuroblastoma+tumors+following+systemic+nonviral+delivery+of+the+sodium+iodide+symporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted radioiodine therapy of neuroblastoma tumors following systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene.</a> Clin Cancer Res. 15 (19), 6079-6086 (2009).</li>
<li>Merron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+Na%2FI+symporter+as+a+reporter+gene+to+visualize+oncolytic+adenovirus+propagation+in+peritoneal+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Assessment of the Na/I symporter as a reporter gene to visualize oncolytic adenovirus propagation in peritoneal tumours.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37 (7), 1377-1385 (2010).</li>
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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

O primeiro passo para processar câncer células rastreáveis na vivo por esse método requer engenharia-los para expressar o repórter de fusão de NIS-FP. A escolha da proteína fluorescente no repórter de fusão é fundamental como oligomerizing proteínas fluorescentes pode levar a repórter artificial de clustering, afectando assim negativamente a sua função. Tivemos sucesso com comprovada monoméricos proteínas fluorescentes como mEGFP (com a mutação monomerizing A206K36,37), mTagRFP ou mCherry. NIS também pode ser de humanos ou origem do mouse (hNIS ou msNIS), dependendo da finalidade do experimento e o modelo de câncer. Eficiências de transdução geralmente variam entre linhas de células de câncer diferente. No entanto, linhas de células de câncer gerado posteriormente são purificadas por FACS neste protocolo, reduzindo assim a necessidade de otimizar as condições de transdução. Transdução com alta multiplicidade de infecção não é sempre aconselhável, como múltiplos construção integração no genoma é susceptível de resultar não só na expressão de construção mais elevado, mas também na modificação de genoma mais indesejados/não regulamentada. Portanto, é importante deixar polyclonal transduzidas células crescem a estabilidade de expressão (monitorado por citometria de fluxo) e evitar classificar os clones mais brilhantes apenas pela FACS. Ele também processa validação funcional de características não-repórter crucial antes que essas células devem ser usadas para experimentos na vivo . Uma alternativa desenvolvida recentemente para entrega do gene viral é gene edição tecnologia38, que oferece controle mais específico sobre os locais de integração viral. Análise da expressão por citometria de fluxo e immunoblotting é importante. Citometria de fluxo permite a aquisição de dados de base populacional única célula, por exemplo, para examinar se há qualquer deriva em níveis de expressão de repórter ao longo do tempo. Ai vem o moiety FP apenas, a menos que as células também estão manchadas com um anticorpo dirigido contra a superfície ou total NIS. Citometria de fluxo não informa na integridade de repórter de fusão. Em contraste, immunoblotting informa sobre a integridade do repórter fusão. O peso molecular do NIS e o FP deve ser adicionado para determinar o peso molecular esperado do escolhido NIS-FP Confocal fluorescência microscopia demonstrada fusão repórter colocalization com as aglutininas de gérmen de trigo-membrana plasmática marcador em todos os recém feita de linha celular. Este foi o local esperado para a maioria das proteínas celular e indicado um marco go-ahead para posterior validação funcional. Se mínima/no NIS-FP foi encontrado na membrana plasmática (por exemplo, somente em compartimentos celulares internos), isto indicaria uma questão biológica de célula com o repórter de fusão nesta linha de celular, ou uma mutação potencial do repórter fusão afetando sua tráfico intracelular. Vale ressaltar que não temos observado nesse caso em qualquer uma das pilhas de cancer testamos até agora, que incluiu: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (melanoma humano); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (câncer de mama humano); ICN-H1975 (câncer de pulmão humano); SK-Hep1 (câncer de fígado humano); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (câncer de mama inflamatório murino); B16F0, B16F3, B16F10 (melanoma murino); MTLn3 (adenocarcinoma de mama de rato).
Função de NIS deve ser medida utilizando ensaios de absorção com substratos radioactivos do NIS. Devido o SPECT radiotracer 99mTcO4– gerador-produzido e, portanto, amplamente disponível nos hospitais, sem a necessidade de qualquer síntese radiotracer também como tendo uma meia-vida mais longa mais conveniente (6,01 h para 99 m TC em comparação com 110 min para 18F), usamos este substrato de NIS para rotina validação funcional de novas linhas de células expressando de NIS-FP. Pre-bloqueio de células NIS-expressando com o perclorato de sódio NIS co substrato resultou na esperada redução/abolição da captação radiotracer, mostrando assim a especificidade de absorção radiotracer. Este teste de especificidade de NIS é uma etapa crítica de validação. Se um experimento de especificidade de NIS não resultaria na captação reduzida radiotracer comparável às respectivas células parentais, um erro técnico durante o experimento ou a absorção de radiotracer não foi devido ao NIS. Também é possível que o perclorato de sódio pre-bloqueio reduz absorção radiotracer em uma linha da célula parental; Isto identificaria linhas celulares com expressão endógena de NIS funcional (por exemplo, estimulado tireoide células6).
Uma vantagem crucial do presente protocolo de imagem é que informação é recolhida em 3D e ao longo do tempo. Isto permite a comparação de imagens do mesmo animal ao longo do tempo, proporcionando dados emparelhados e, assim, superar os problemas causados pela variabilidade de animal para animal. Isto contrasta com métodos de avaliação de metástase relacionados mais non-imagem latente que se baseiam em sacrificar animais diferentes em pontos diferentes do tempo. Na Figura 3B é evidente como metástase disseminação e consequência progrediram ao longo do tempo em um animal individual. Os sinais detectados por imagens de PET/CT são causados fundamentalmente pela expressão de NIS. Isso inclui todos os sinais de forma exógena NIS-expressando as células cancerosas, assim como todos os órgãos endogenamente expressando NIS. Sinais típicos de NIS endógenos são encontrados na tireoide e glândulas salivares, o estômago e, em níveis baixos em algumas partes das glândulas mamárias e lacrimais. Além de expressão endógena de NIS, NIS radiotracer [18F] BF4– também é excretado através dos rins, assim explicando a captação radiotracer em bexigas cheias de urina. Captação de rim não é mais detectável no ponto de imagem tempo recomendado neste protocolo (45 min post radiotracer injeção6). Se os sinais de bexigas cheias de urina devem conduzir a problemas de sinal-para-plano de fundo, a bexiga pode ser esvaziada mecanicamente sob anestesia antes de imagem. Importante, os sinais endógenos podem variar entre cepas de animais. Também é interessante notar que a expressão endógena de NIS nas glândulas mamárias pode ser mais elevado sob lactantes condições10. No caso apresentado e nos casos dessas linhas de célula metastático caracterizada com sucesso antes (cf. lista acima), não encontramos a expressão endógena de NIS para interferir significativamente com deteção de metástase. Vale ressaltar, que [18F] BF4– permanece mais disponível para captação nos tecidos cancerosos em comparação com o iodeto, porque o iodeto é metabolizado em hormônios tireoidianos6. Este fenômeno também pode contribuir para quantidades maiores de radioiodide na corrente sanguínea em comparação com [18F] BF4- 6. Para diferentes aplicações (acompanhamento em outros cânceres ou células não-cancerosas aplicativos de rastreamento de célula cancerosa), isto pode ser diferente, e, portanto, recomenda-se avaliar se a expressão endógena de NIS é susceptível de causar problemas de sinal-para-fundo através Experimentos preliminares. Um aspecto importante na imagem pré-clínicos é a atividade molar da radiotracer. O método descrito aqui usa ~1.5 GBq 18F– como material inicial14 e foi mostrado para produzir atividades molares significativamente acima o método de substituição anteriormente relatados12. [18-F] BF4– produzido no molar atividades ≤ 1 µmol/GBq12 pode levar a absorção reduzida em NIS-expressando os tecidos. Isto é particularmente importante quando a quantidade injetada de radioatividade por quilograma é alta, ou seja, quando são pequenos animais como ratos, fotografada39; é menos importante no ser humano definindo40. Atividades de alto molares são, portanto, imperativas para a imagem latente PET pré-clínicos de alta qualidade. Atividades molares obtidas por boro trifluoreto adição método14, que é mostrado em sua forma automatizada no presente protocolo, superar esse problema. Além disso, vale ressaltar que o protocolo apresentado para a síntese de4– [18F] BF não é compatível com boas práticas de fabricação (GMP) e, portanto, impróprias para uso em ensaios clínicos humanos neste formulário. Um protocolo de GMP (através do método de substituição de 18F para radiolabel BF4–) está disponível em outros lugares40.
Imagens de PET/CT permite a visualização de captação radiotracer, que é indicativa de absorção mediada por NIS radiotracer decorrentes de células de câncer expressando NIS-FP. Mais importante, os sinais de PET associados podem ser quantificados. É necessário aplicar procedimentos de limiarização confiável para garantir uma diferenciação consistente e imparcial de sinais relevantes de qualquer fundo de potencial. Como o fundo varia em diferentes locais na vivo, é importante levar em consideração a segmentação e limiarização local e regional. Um tal método foi desenvolvido por e nomeado após Otsu34, e sua aplicação 3D é empregada para renderização em 3D do tumor primário e metástases no presente protocolo. Geralmente, a imagem vista pelo observador visualmente melhor corresponda aos valores de dose (% ID) quantificados % injetado. Quanto à quantificação baseada em imagem, é igualmente importante normalizar os valores de medição de radioactividade dos diferentes tecidos para os volumes. Há duas maneiras predominantemente usadas de expressar resultados normalizados, ID de (i) % por volume (por exemplo, %ID/mL) e o valor de (ii) o padrão de captação (SUV35). Eles diferem em que %ID/mL leva em conta o volume individual apenas, enquanto o SUV é uma medida que é relativo a radioatividade média em todo o animal inteiro. Também é importante notar que imagem de NIS processa o volume do tumor ao vivo (LTV) acessível, porque as células morto/morrendo não sintetizar ATP não pode mais importar radiotracer10. Isto explica a grande área de baixo sinal dentro do tumor primário ("em forma de donut" tumor) indicando áreas de tumor de célula morte/necrose. Importante, LTV foi uma medida muito mais confiável do fardo de tumor em comparação com o volume bruto de tumor acessível através de medições de maxila (que não leva em viabilidade de conta e avalia apenas as regiões tumor superficial).
Uma grande vantagem desta estratégia de rastreamento de modo dual é evidente quando a colheita de tecidos após o abate de animais. Guiado por imagens na vivo e assistida por células cancerosas fluorescente durante a dissecção de animais, profundos e pequenos órgãos/metástases pode também ser colhidas confiantemente. Metodologia de preservação/corte de tecido congelado permite que a imagem de fluorescência direta de GFP, sem a necessidade de coloração com um anticorpo anti-GFP, mas em detrimento da preservação de tecido estrutural reduzido em comparação com fixada em formol metodologia de parafina (FFPE). O último criticamente requer também coloração anti-FP, porque o método FFPE é incompatível com preservação intacta de proteínas fluorescentes (devido a fixação/desidratação/reidratação). Enquanto o sinal de fluorescência é indicativo da presença de células do tumor, é importante garantir que essa classificação é confirmada pelo ex vivo medições de radioactividade dos tecidos colhidos ('biodistribuição'). Ex vivo medições de radioactividade são mais sensíveis de detecção visual de fluorescência, portanto, pode permitir que a identificação do câncer de sinais de celular-dependente que caso contrário permaneceria sem ser detectado. No caso de um terminal sessão de imagem, é fundamental observar com precisão os montantes radiotracer injetado, bem como os horários de medições de radioactividade radiotracer, injeção de animal, animal de abate e calibrado contador de cintilação medições de tecidos colhidos. Isto é crucial para garantir a correção para decaimento radiotracer e desse modo permitir análise biodistribuição confiável.
PET/CT imaging permite repetido quantificação 3D não-invasivo de progressão de tumor, incluindo a avaliação da disseminação metastática em um nível de corpo inteiro. Esta característica é uma vantagem significativa sobre os métodos convencionais, que muitas vezes dependem de grandes coortes de animais que são sacrificados para a avaliação da progressão do tumor em diferentes pontos do tempo. As vantagens desta abordagem baseada em imagem são: (i) altamente sensível invasivo 3D na vivo quantificação, (ii) uma redução significativa no número de animais devido à possibilidade de repetição de imagem, (iii) a aquisição de dados emparelhados longitudinais de subsequentes de imagem sessões de aperfeiçoamento das estatísticas, excluindo a variabilidade de animal para animal, que por sua vez mais reduz o número de animais, (iv) automatizada produção de [18F] BF4– em atividades específicas de alto e (v) a opção intrínseca para ex vivo confirmação nos tecidos por metodologias de fluorescência como microscopia ou citometria.
Na vivo celular de rastreamento é um campo crescente. Ele foi alimentado pelos recentes avanços na tecnologia, o que resultou em maior resolução, limites de detecção e capacidade multiplex (através de imagiologia multimodal) de imagem. Neste protocolo, aplicamos esse conceito para controlar a progressão do tumor incluindo metástases celular espontânea em 3D por repetição de imagem. As aplicações incluem estudos vistos desvendar os mecanismos de metástases celular espontânea. Por exemplo, células tumorais rastreável poderiam ser usadas para estudar o impacto dos componentes de diferentes células imunes (como presente/funcional em cepas de animais de diferentes níveis de immunocompromisation) sobre o processo metastático. Da mesma forma, o impacto dos genes individuais, na estirpe animal ou a linhagem de células de câncer, poderia ser estudado. Além disso, o protocolo apresentado pode ser usado para avaliar/validar a eficácia de medicamentos específicos ou conceitos terapêuticos na progressão do tumor. Importante, este par de gene: radiotracer de repórter para a imagem latente de PET (NIS: [18F] BF4–) também poderia ser usado para aplicativos de rastreamento de célula diferente. Por exemplo, várias terapias celulares atualmente estão surgindo abordagens terapêuticas tão promissoras. Isso inclui celular terapêutica para tratamento de câncer41 , mas também em transplante42 e configurações de44 43,medicina regenerativa. Todo o corpo na vivo celular rastreamento está se tornando cada vez mais importante para o desenvolvimento e a tradução clínica de terapias celulares, por exemplo, para avaliar a segurança e para o monitoramento da terapia.

Doença metastática é a causa para a maioria das mortes relacionadas ao câncer 1. Apesar de inúmeras pesquisas em processos metastáticos, monitoramento confiável de metástases em sistemas modelo animal é difícil de alcançar. Recentes avanços em tecnologias de imagem de corpo inteiro e abordagens de imagiologia multimodais permitiram invasivo na vivo celular rastreamento2,3,4,5. Este último pode ser usado como uma ferramenta para monitorar a presença, distribuição, quantidade e viabilidade de células, de forma não-invasiva e repetidamente em um animal vivo ou um ser humano.
O objetivo do método descrito aqui é para longitudinalmente e de forma não-invasiva acompanhar as células cancerosas em 3D em modelos de tumor roedores vivos. Usando esse método, os pesquisadores será capazes de quantificar com precisão a progressão do tumor incluindo propagação metastática em 3D. Em comparação com as técnicas tradicionais não baseados em imagem latente, este método oferece a aquisição de dados quantitativos com o número de animais em grande parte reduzida. Outra característica desse método é que permite a correlação da imagem latente na vivo com análise simplificada a jusante ex vivo das células controladas em tecidos colhidos por histologia ou citometria de3,6.
A justificativa para o desenvolvimento deste método era fornecer uma ferramenta na vivo para o acompanhamento e a quantificação do processo inteiro metastático em modelos de roedores do tumor. Importante, ele foi projetado para minimizar o uso de animais e, ao mesmo tempo, reduzir a variabilidade de animal para animal. Imagem longitudinal de corpo inteiro invasivo é excelentemente adequada para informar na consequência metastática, para que por si é difícil de prever com precisão o tempo e o local de sua ocorrência. Imagens 3D de todo o corpo, portanto, tem sido o centro de desenvolvimento de um método. Para fechar a lacuna de escala entre todo o corpo na vivo imaging e potencial a jusante ex vivo confirmação histológica, uma abordagem de imagem com base em um repórter radionuclídeo de modo duplo-fluorescência multi-escala foi adotaram3, 6.
Tomografia por emissão de pósitrons (PET) é a mais sensível 3D corpo inteiro imagem tecnologia atualmente disponível, oferecendo excelente profundidade penetração e quantificação absoluta7 com uma resolução de < 1 mm8,9. Atualmente, pré-clínicos celular rastreamento a nível de todo o corpo pela imagem latente do radionuclídeo confiável pode detectar células em densidades de ~ 1.000 células por volume de 1 milhão de células de3,6 com resoluções na região sub milímetros. Ao contrário de microscopia intravital, que não consigo detectar o único espalhar as células cancerosas, mas não requer procedimentos cirúrgicos (por exemplo, câmaras de janela), não está limitado a um pequeno campo de visão e não tecido de baixa penetração e dispersão. Imagens de bioluminescência fornece uma alternativa barata, mas é associada com a dispersão e problemas de absorção da luz, bem como a penetração de profundidade pobre e consequentemente severamente limitada na quantificação2. Imagem de corpo inteiro de fluorescência tem sido utilizada para a aquisição de imagens 3D, mas é muito menos sensível em comparação com bioluminescência ou radionuclídeos tecnologias2. Não obstante, fluorescência oferece a oportunidade de realizar ex vivo tecido a jusante a análise por citometria ou microscopia. O último fecha a diferença de escala entre imagem de corpo inteiro macroscópica (resolução mm) e fluorescência microscópico tecido análise (resolução µm)3. Portanto, radionuclídeos e fluorescência modalidades se complementam, que vão desde o nível de corpo inteiro à escala celular (sub-).
Imagens de gene repórter é ideal para celular prolongada de rastreamento conforme exigido na pesquisa de metástase. Nesta aplicação é superior à célula direta rotulando como é (i) não afetado pela diluição de rótulo e, portanto, não limitado no tempo de acompanhamento e (ii) melhor reflete o número de células vivas. Consequentemente, todo o corpo celular de rastreamento é particularmente útil para aplicações em que células rastreáveis proliferaram ou expandir na vivo, por exemplo, em câncer, pesquisa3,6, para a detecção da formação de teratoma no tronco pesquisa de célula, ou para a quantificação de imune celular expansão5.
Vários genes repórter baseado em radionuclídeos são disponíveis2. Estes incluem enzimas como a herpes simplex vírus HSV11 timidina quinase (HSV1 -tk), transportadores, tais como o iodeto de sódio symporter (NIS) ou o transportador de norepinefrina (NET), bem como receptores de superfície celular como a dopamina D2 receptor ( D2R). NIS é uma proteína trans-membrana glicosilados que medeia activamente a captação de iodeto, por exemplo, em células foliculares na glândula tireoide para a posterior síntese de hormônios da tireoide10. Este processo é conduzido pela symport do at+ e depende do gradiente de celular de sódio, que é mantido pela nd+/k+-ATPase11. Consequentemente, NIS reflecte melhor a vida celular números do que outros repórteres como captação de iodeto/radiotracer está ligada a uma ativo Na+/k+ gradiente ao invés da mera presença do transportador. Tradicionalmente, a radioiodide tem sido usado para a imagem latente de NIS. Para o rastreamento de pilha, radiotracers de NIS alternativos que não são metabolicamente aprisionados na tireoide foram relatados para ser superior6. Este recentemente desenvolvido PET radiotracer [18F] tetrafluoroborate ([18F] BF4–)12,13 mostra farmacocinética superior em comparação com radioiodide6 estando disponível em atividades específicas de alto14 , sem a necessidade de instalações complexas de radioquímica. [18-F] BF4– podem ser sintetizados através de duas maneiras diferentes. O primeiro método é baseado na troca de isótopo não-radioativo 19F em BF4– com radioativo 18F12. O segundo método é através da adição de 18F de trifluoreto de boro não-radioativo14. O último método foi relatado para produzir maior actividades específicas14 e é o método de escolha para a imagem latente pré-clínicos.
NIS é altamente expressa em tecidos da tireoide. Também é expressa em glândulas mamárias salivares, lacrimais e lactantes, bem como o estômago, mas em níveis mais baixos em comparação com a glândula tireoide10. Portanto, imagem excelente contraste em outras regiões do corpo pode ser alcançada usando o NIS. É também altamente homólogo entre humanos, rato e do rato10. Além disso, não existem relatos de toxicidade sobre expressão ectópica de NIS em células não-thyroidal. Importante, NIS também não foi associado com o anfitrião respostas imunes, nem em humanos nem em roedores. NIS tem sido usado como um gene repórter, para medir o promotor atividade15,16,17 e gene expressão18,19,20,21,22 ,23 , em vários contextos diferentes. Ele também tem sido usado para tratamento de imagens não-invasivo de terapia de gene a vetores24,25e para rastrear células cardíacas4, hematopoiéticas26, inflamação5e estudos neurais27. Recentemente, NIS também tem sido usado como um gene repórter para rastrear metástases de câncer em vivo3,6.
Em resumo, as principais vantagens deste método sobre técnicas anteriores são: (i) altamente sensível invasivo 3D na vivo localização e quantificação de metastático espalhar, (ii) automatizada produção de [18F] BF4– no atividades de molares alto, (iii) uma redução significativa nos animais necessários através de imagem longitudinal, (iv) a aquisição de dados emparelhados de sessões subsequentes de imagem, resultando em dados estatísticos melhorados, que por sua vez mais reduz o uso de animais e (v) a opção intrínseca para confirmação ex vivo de células cancerígenas nos tecidos por microscopia de fluorescência e citometria.

<table><tbody><tr><td>Etapa 1) Engenharia e caracterização&nbsp; de células cancerígenas para expressar a fusão radionuclídeo-fluorescente repórter NIS-FP.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2'-(4-etoxifenil)-5-(4-metil-1-piperazinil)-2,5'-Bi-1H-benzimidazol</td><td>Thermo Scientific</td><td>H3570</td><td>Nome trivial: Hoechst 33342; Número CAS: 23491-52-3; Hoechst 33342, Tricloridrato, Trihidrato - 10 mg / mL Solução em Água.</td></tr><tr><td>Linha celular de câncer de mama murino 4T1</td><td>ATCC</td><td>CRl-2539</td><td>para obter detalhes, consulte o site da ATCC</td></tr><tr><td>Contador automático de células, por exemplo, CASYCounter</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>5651697001</td><td>CASY Modelo TT Contador e Analisador</td></tr> de <tr><td>Células CASYclean Reagente de limpeza</td><td>Sedna Scientific</td><td>2501036</td><td></td></tr><tr><td>Diluente isotônico CASYton Sedna</td><td>Scientific</td><td>2501037</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência confocal, e.g. Leica TCS SP5</td><td>Leica, Wetzlar, Alemanha</td><td></td><td>Equipado com Plan-Neofluor 25&times; 0.5NA e plano-apocromático 63&times; Objetivas UV de óleo 1.4NA e lasers de diodo (405 nm), íon de argônio (458, 477, 488, 496, 514 nm) e HeNe (543 e 633 nm); Utilizou-se um software Leica LAS AF Lite 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) para aquisição e análise</td></tr><tr><td>de lamínulas de cobertura n.º 1,5 de espessura</td><td>VWR International</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5546</td><td>Suplemento com 10% (v/v) de FBS e L-glutamina (2 mM) para constituir o meio de crescimento ideal para células MDA-MB-231.</td></tr><tr><td>Classificador FACS, por exemplo, BD FACSAria III&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Equipado com um software BD FACS DIVA, um sistema de 6 lasers (lasers de 375/405/488/561/633 nm) - células classificadas com um 100 &mu; Bico M sob pressão de fluxo de 20 psi, extensão da janela de 2,0 &mu; m, Filtro de Densidade Neutra 2.0 e Tensão da placa de 3 kV</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Inativado por calor a 56 &graus; C por 30 min</td></tr><tr><td>Contador Gama Automatizado, por exemplo, 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>99mTc-janela de energia pertechnetate 110-155 keV&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Janela de energia 18F 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 solução</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>1-3 &micro; g/mL; O DAPI (de vários fornecedores) pode ser usado em seu lugar.</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Solução 200 mM concentrada, filtrada estéril</td></tr><tr><td>Polietilenonimina linear (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>Linear, 25 kDa; reagente de transfecção para linha celular 293T.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 células de câncer de mama humano</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>para obter detalhes, consulte o site da ATCC</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mEGFP</td><td>solicitação de nosso laboratório</td><td>n/a</td><td>Para obter detalhes (geração e mapas), consulte Informações Suplementares</td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mCherry</td><td>solicitação de nosso laboratório</td><td>n/a</td><td>Para obter detalhes (geração e mapas), consulte Informações Suplementares</td></tr><tr><td>plasmídeos pMD2.G</td><td>Addgene</td> <td># 12259</td><td>que codificam para o envelope VSV-G</td></tr><tr><td>pRRE</td><td>Addgene</td> <td># 12251</td><td>plasmídeo de embalagem</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td> <td># 12253</td><td>plasmídeo de embalagem</td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído 4% (p / v) em PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P43330</td><td>Contendo penicilina (10.000 unidades/mL) e estreptomicina (10 mg/mL),</td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato filtrado estéril (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>pH 7,4, filtrado estéril e sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio</td></tr><tr><td>Poli(álcool vinílico - acetato de vinila)</td><td>Polysciences</td><td>17951</td><td>Nome trivial: Mowiol 4-88; Número CAS: 9002-89-5</td></tr><tr><td>Cloridrato de puromicina Sigma</td><td></td><td>P8833</td><td>De Streptomyces alboniger, reconstituído em água estéril&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada, por exemplo, Rotina 380 R Centrífuga de bancada</td><td>Hettich Lab Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td>Suplemento com 10% (v/v) de FBS e L-glutamina (2mM) para compor o meio de crescimento ideal para células 4T1.</td></tr><tr><td>Filtro de seringa SFCA 0,45 &mu; m</td><td>Seringas Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>BD Emerald</td><td></td><td>Seringas descartáveis não estéreis</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência para cultura de tecidos, por exemplo, EVOS-FL&nbsp;</td>Sistema de imagem celular <td>da Life Technologies</td><td></td><td>equipado com uma objetiva de 10 vezes (PlanFL PH2, 10 vezes; / 0,25, "infinito / 1,2") e uma solução de</td></tr><tr><td>tripsina-EDTA 10X</td> com câmera colorida<td>Sigma</td><td>59418C</td> <td>(0,5% (m/v) tripsina, 0,2% (m/v) EDTA) gama irradiada pelo processo SER-TAIN e sem vermelho de fenol&nbsp;</td></tr><tr><td>Aglutinina de Gérmen de Trigo Alexa Fluor 633 Conjugado&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp;</td><td>W21404</td><td>Usado em 1:1000 (2 &micro; g/mL) para imunofluorescência celular</td></tr><tr><td>Etapa 2) Estabelecimento de modelos tumorais in vivo.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paquímetro digital</td><td>World Precision Instruments</td><td>501601</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>Para inalação</td></tr><tr><td>Tocha de fluorescência, por exemplo, Tocha de fluorescência NightSea DFP-1</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Equipado com filtros de emissão GFP e RFP e óculos de proteção com filtro NightSea (DFP-1)</td></tr><tr><td>Seringas 0,3 mL U-100 insulina</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G &vezes; 1/2'' - 0,33 &vezes; 12 mm</td></tr><tr><td>Materiais/equipamentos padrão para técnica asséptica e manutenção</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>animalEtapa 3) Produção de [18F]BF4- usando uma plataforma automatizada de síntese de radiotraçador.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-crown-5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>188832</td><td>CAS 33100-27-5</td></tr><tr><td>Acetonitrila (anidra)</td><td>Acros Organics</td><td>326811000</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoreto de boro dietila</td><td></td><td>216607</td><td>BF3. OEt2, purificado por redestilação, etc; 46,5% BF3 base. CAS 109-63-7</td></tr><tr><td>Plataforma de Síntese Automatizada de Radiotraçadores (ARS), por exemplo, FASTLab</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>descartáveis para plataforma ARS, por exemplo, FASTLab</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FASTlab Developer pack</td></tr><tr><td>Polygram Alox N/UV254 folhas de poliéster Placas</td><td>Macherey-Nagel</td><td>802021</td><td>RadioTLC, 40&vezes; </td></tr><tr><td>Cartucho de troca aniônica forte de 80 mm, por exemplo, Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light</td><td></td><td>Waters WAT023525</td><td>Condição com 1M NaCl (10 mL) e H2O (10 mL)</td></tr><tr><td>Cartucho neutro de alumina, por exemplo, Sep-Pak Alumina N Plus Light</td><td>Waters</td><td>WAT023561</td><td>Condição com H2O (10 mL), acetona (10 mL) e ar (20 mL)</td></tr><tr><td>Água para injeção USP</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen filtro</td><td>Millipore</td><td>SE2M049I05</td><td>Estéril 0.2 &micro; m FG Millex 13 mm</td></tr><tr><td>Etapa 4) In vivo de células que expressam NIS-FP por nanoPET/CT.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>Para inalação</td></tr><tr><td>Instrumento de imagem multimodal pré-clínica PET/CT, por exemplo, nanoScan PET/CT</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapeste, Hungria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tocha de fluorescência, por exemplo, NightSea Fluorescence Torch DFP-1</td><td>Microscopia eletrônica</td><td>Ciências SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Equipado com filtros de emissão GFP e RFP e óculos de filtro NightSea (DFP-1)</td></tr><tr><td>Câmara de indução de anestesia para roedores</td><td>Vet-Tech</td><td>AN010R</td><td>Com válvulas de três vias (x2), conector de montagem em tubo para entrada, tubo de PVC para entrada de gás (2 m) e tubo de limpeza de 22 mm (2 m)</td></tr><tr><td>Sistema de anestesia para roedores</td><td>Vet-Tech</td><td>AN001B</td><td>Incluindo máscara facial de animal adequadamente dimensionada para animal de interesse e vaporizador de isolflurano</td></tr><tr><td>Solução salina fisiológica estéril</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>BO0334B</td><td></td></tr><tr><td>Seringas 0,3 mL U-100 insulina</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G &vezes; 1/2'' - 0,33 &vezes; 12 mm, para injeção intravenosa de radiotraçador Mecanismo de</td></tr><tr>pesagem do filtro<td>Veterinary Scavenger</td><td>Vet-Tech</td><td>AN200</td><td>VetScav - 240 V com compensação automática de temperatura e sistema LED</td></tr><tr><td>5) In vivo análise de dados.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tera-Tomo Algoritmo iterativo 3D completo baseado em Monte Carlo</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapeste, Hungria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant Software</td><td>Invicro LLC., Boston, EUA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>6) Ex vivo análises</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2- Metilbutano&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>59070-1L-D</td><td>Pré-resfriado sobre nitrogênio líquido para congelar tecidos incorporados em OCT Albumina</td></tr> de <tr><td>soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas 22&vezes; Criostato</td><td>de SMITMCQ211022X50</td><td></td><td>VWR International</td> de 50 mm</tr><tr><td>, por exemplo, Cryostat MNT</td><td>SLEE Medical</td><td></td><td>máquina de incorporação de histologia modular de duas peças equipada com um módulo de incorporação, um compartimento de armazenamento de tecido e uma placa fria</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson/Stratech</td><td>111-175-144</td><td>Usado a 1:500 (2 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/mL</td></tr><tr><td>Lâminas de micrótomo, por exemplo, Feather S35&nbsp;</td>Microscópio de fluorescência <td>CellPath</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(campo amplo ou confocal), por exemplo, microscópio de fluorescência invertida Nikon Eclipse Ti-E</td><td></td> Nikon equipado com 10 vezes, 20 vezes;<td></td><td> (ar) e idealmente 40 vezes; objetivas (óleo) e lasers/filtros ou cubos de filtro, respectivamente, que são adequados para Hoechst 33342, GFP e Cy5</td></tr><tr><td>Automated Gamma Counter, por exemplo, 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>99mTc-pertechnetate janela de energia 110-155 keV, janela de energia 18F 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 solução</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de fluorescência para microscópio de dissecação, por exemplo, Adaptador NightSea</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Equipado com filtros de emissão GFP e RFP</td></tr><tr><td>Composto O.C.T.</td><td>VWR international</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Caneta de cera, por exemplo, PAP-PEN</td><td>Dako UK Ltd</td><td></td><td>Caneta de cera para desenhar ao redor da seção de tecido para reduzir os volumes necessários de solução de coloração/lavagem</td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído 4% (p/v) em PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Polyclonal anti-mouse usado 1:50 (20 &micro; g/mL) para imunofluorescência de tecidos</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio, por exemplo, lâminas Superfrost</td><td>VWR, Lutterworth, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com tris (TBS)</td> <td>disponíveis em vários fornecedores.</td><td></td><td>Solução salina tamponada com Tris; NaCl 150 mM, Tris/HCl 25 mM a pH 7,4</td></tr></tbody></table>

radionuclídeo-fluorescência gene do repórter de imagem para controlar a progressão do tumor em modelos de roedores tumor

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Metástase é responsável pela maioria das mortes por cancro. Apesar de inúmeras pesquisas, a compreensão mecanicista dos complexos processos que regem a metástase permanece incompleta. Modelos in vivo são primordiais para a pesquisa de metástase, mas exigem refinamento. Rastreamento de metástases espontânea pelo não-invasivo na vivo imagem agora é possível, mas permanece um desafio que requer observação de longa data e alta sensibilidade. Descrevemos um longitudinal combinada radionuclídeo e fluorescência corpo inteiro na vivo abordagem para controlar a progressão do tumor e metástases espontânea de imagem. Esta metodologia de gene repórter emprega o iodeto de sódio symporter (NIS) fundida a uma proteína fluorescente (FP). As células cancerosas são projetadas para NIS-FP expressa estàvel, seguido de seleção com base na classificação de fluorescência-ativado da pilha. Modelos de tumor correspondentes são estabelecidos em camundongos. NIS-FP expressando as células cancerosas são controladas não invasiva na vivo a nível de todo o organismo, por emissão de positrões (PET) usando o NIS radiotracer [18F] BF4–. Animal de estimação é atualmente o mais sensível na vivo tecnologia disponível nesta escala de imagem e permite a quantificação confiável e absoluta. Métodos atuais dependem de grandes coortes de animais que são sacrificados para avaliação de metástase em diferentes pontos do tempo ou confiam nas imagens 2D quase não quantificáveis. As vantagens do método descrito são: (i) altamente sensível invasivo na vivo 3D PET imaging e quantificação, (ii) automatizada produção traçador de PET, (iii) uma redução significativa no número de animais necessário devido às opções de repetição de imagem, (iv). a aquisição de dados emparelhados de sessões subsequentes de imagem, proporcionando melhor dados estatísticos e (v) a opção intrínseca para confirmação ex vivo de células cancerígenas nos tecidos por microscopia de fluorescência ou citometria. Este protocolo, descreveremos todos os passos necessários para rotina NIS-FP-oferecidas invasivo na vivo câncer celular rastreamento usando PET/CT e ex vivo de confirmação dos resultados na vivo . Este protocolo tem aplicações além da pesquisa sobre o câncer, sempre que na vivo a localização, ampliação e monitoramento de longa data de uma população celular é de interesse.

Descreveremos um protocolo para pré-clínicos em vivo rastreamento de metástases. É baseado em um repórter de radionuclídeos-fluorescência combinando o symporter de iodeto de sódio, detectado pelo não-invasiva [18F] tetrafluoroborate-animal de estimação e uma proteína fluorescente para confirmação simplificada ex vivo . O método é aplicável para pré-clínicos na vivo celular rastreamento além da biologia do tumor.

Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

O objetivo geral deste protocolo é acompanhar o crescimento tumoral e a metástase em roedores vivos por meio de imagens. Um repórter de fusão radionuclídeo-fluorescência permite a detecção não invasiva in vivo por tomografia por emissão de pósitrons, com o fluoróforo auxiliando na confirmação ex vivo dos resultados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sempre que for necessário rastrear células em animais vivos durante um período prolongado.Pode contribuir para a compreensão da metástase à distância e do impacto de tratamentos na progressão tumoral. A técnica descrita é o rastreamento de células cancerígenas por meio de imagem não invasiva e altamente sensível in vivo com um traçador PET produzido por síntese automatizada. Oferece uma redução significativa no uso de animais em comparação com a metodologia convencional.Indivíduos novos neste método podem se sentir sobrecarregados pela sua complexidade. Particularmente, a síntese automatizada do radiofármaco para PET simplifica significativamente este processo. Acreditamos que a demonstração visual deste método ilustra essas perspectivas das etapas críticas associadas à imagem.As implicações desta técnica estendem-se aos testes pré-clínicos de novos terapêuticos, que também podem ser rastreados juntamente com as células cancerígenas. Este método pode fornecer informações sobre a biologia do câncer e o desenvolvimento de tratamentos, sempre que a localização, realocação, expansão e monitoramento de longo prazo de uma determinada população forem de interesse in vivo.Para começar, utilize plasmídeos de genes repórter, gere partículas de lentivírus, transduza células e caracterize-as. Em seguida, analise a função do gene repórter por meio da captação de radio-traçador em linhagens celulares que expressam NISFP. Semeie as células purificadas e o meio de crescimento em placas de seis poços, garantindo que todas as amostras sejam preparadas em triplicata.Na manhã seguinte, lave as células com meio de crescimento livre de soro e incube as placas com 50 quilobecquerels de tetrafluoreto de boro F18 a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, colete o sobrenadante e transfira 100 microlitros para um tubo de coleta previamente rotulado. Descarte o sobrenadante restante e, então, lave as células com um mililitro de PVS gelado contendo cálcio e magnésio em níveis fisiológicos.Colete a solução de lavagem e transfira 100 microlitros da solução de lavagem para um tubo de coleta previamente rotulado. Em seguida, repita o processo de lavagem mais uma vez. Adicione 500 microlitros de PVS contendo tripsina e EDTA para destacar as células.Incube as amostras a 37 graus Celsius até que as células se desprendam, utilizando um microscópio para verificar o desprendimento. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de coleta rotulado. Em seguida, centrifugue as amostras celulares a 250 G durante quatro minutos a quatro graus Celsius.Utilize um contador gama automatizado para contar as amostras de cada um dos quatro tipos de amostra e obter a porcentagem de captação usando a equação um. Para iniciar a síntese de tetrafluoroborato F18, configure a plataforma automatizada de síntese radioativa em um capuz químico apropriado e certifique-se de que o arquivo XML correto foi carregado no computador de controle. Enquanto o sintetizador estiver em funcionamento, o tetrafluoroborato F18 será produzido e, em seguida, purificado em uma cartela de troca iônica aniónica.A cartela de troca iônica será lavada com água e, em seguida, seca com gás nitrogênio. O produto final é eluído da cartela de troca iônica com um mililitro de cloreto de sódio 0,9% e transferido para um frasco coletor de vidro por meio da linha de saída. Para iniciar a imagem, anestesie e prepare os camundongos de acordo com o protocolo escrito.Em seguida, use solução salina estéril a 0,9% para diluir a solução de tetrafluoroborato de F18 até 5 megabecquerels por 50 microlitros. Use uma seringa com agulha hipodérmica para aspirar 100 microlitros da solução de tetrafluoroborato de F18. Meça a radioatividade na seringa e registre o valor e o horário da medição.Administre 50 microlitros da solução de tetrafluoroborato F18 na veia da cauda previamente aquecida por via intravenosa. Em seguida, meça a radioatividade remanescente na seringa e registre o valor e o horário da medição. A injeção do radiofármaco na veia da cauda é essencial.Realizamos o procedimento com o animal anestesiado para minimizar o risco de injeção incorreta e derramamento do radio-traçador. O animal permanece anestesiado até o início da aquisição da imagem por PET. Exatamente 45 minutos após a injeção do radio-traçador.Em seguida, configure um temporizador para contagem regressiva de 45 minutos e certifique-se de que o camundongo esteja posicionado sobre a mesa na posição esternal. Instale os instrumentos apropriados de monitoramento cirúrgico e verifique se os instrumentos estão funcionando corretamente antes de prosseguir. Depois, defina os parâmetros para a aquisição de imagens de tomografia computadorizada (TC) e de emissão de pósitrons (PET).Quando o cronômetro regressivo marcar 15 minutos, inicie a aquisição da imagem de TC e, quando o cronômetro marcar zero minuto, inicie a aquisição da imagem de PET. Primeiro, meça a radioatividade de todo o camundongo eutanasiado e registre o valor e o horário da medição. Em seguida, dissecione os camundongos e colete os tecidos necessários.Meça a radioatividade do carcaça restante com e sem a cauda. Registre esses valores e anote os horários das medições. Em seguida, pese todos os tecidos colhidos individualmente e tire fotografias dos órgãos cancerosos à luz do dia e sob luz de fluorescência.Em seguida, inclua os tecidos em OCT para histologia subsequente. Meça a radioatividade de todos os tecidos coletados, registre o valor e anote o horário da medição. Por fim, apresente os dados como valores de captação padronizados ou SUV, conforme descrito na equação dois.Neste experimento, utilizou-se imagem gênica por registro de fluorescência de radionuclídeos para rastrear a progressão tumoral em um modelo de tumor em roedor. A microscopia de fluorescência confocal demonstrou a localização precisa dos NISFPs na membrana plasmática. A função e especificidade dos NISFPs foram quantificadas por meio da captação de radiofármaco proporcionada pelo NIS.Não foram observadas diferenças significativas entre as linhagens celulares 4T1NISGFP e 4T1NISRFP com níveis semelhantes de expressão de NIS. Importante, o bloqueio com perclorato demonstrado em todas as linhagens celulares indicou que a captação do radio-traçador obtida é devida à expressão específica de NISFP. A imagem por PET de corpo inteiro de animais com tumores revelou informações sobre a progressão tumoral e a disseminação metastática.O exemplo mostrado aqui apresenta metástase pulmonar extensa com vários nódulos distintos no pulmão. Os valores de porcentagem da dose injetada e os volumes ocupados pelas metástases individuais nos pulmões variaram. No entanto, os valores de porcentagem da dose injetada normalizados pelo volume estavam dentro de uma faixa semelhante.A proteína fluorescente no gene repórter de modo duplo permitiu a identificação de tecidos cancerosos sob luz fluorescente durante a dissecação do animal. A distribuição bioquímica subseqüente do radio-traçador ex vivo revelou órgãos com alta captação do radio-traçador e, portanto, tecidos que expressam NIS. Embora tireóide, glândulas salivares e estômago expressem naturalmente NIS, todos os demais sinais positivos indicam tecidos cancerosos, como o tumor e metástases.O marcador fluorescente de radionuclídeo também permite a identificação de células cancerígenas em cortes teciduais subsequentes. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de oncologia visualizassem o processo de metástase espontânea e testassem como medicamentos o afetam. Ao tentar realizar este procedimento, é importante planejar cuidadosamente todas as etapas com antecedência.As linhagens celulares devem ser estabelecidas, os modelos de tumor em animais montados, e todos os reagentes e equipamentos para imagem devem estar disponíveis no dia exigido. Recomendamos começar com pequenos experimentos piloto. Uma vez dominados, a produção de radio-traçadores e a imagem em animais in vivo podem ser realizadas com seis animais em um dia de trabalho de oito horas, se for feito corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como abordar um gene repórter fornecido para rastreamento celular in vivo utilizando o repórter radionuclídeo NIS combinado com proteína fluorescente. Você também deverá ser capaz de caracterizar linhagens celulares que expressam o repórter NISFP para produzir o radiofármaco PET necessário para imageamento in vivo e para realizar experimentos de distribuição in vivo e ex vivo. Após este procedimento, outros métodos, como a fluorocitometria, podem ser realizados com o objetivo de responder perguntas adicionais.Por exemplo, como o perfil das células imunes de um tumor e sua metástase estão relacionados entre si ou mudam ao longo do tempo. Não se esqueça de garantir que as linhagens celulares que você produzir estejam livres de micoplasmídeos, já que estes últimos foram relatados como capazes de afetar os resultados. Importante: não se esqueça de que trabalhar com radioisótopos pode ser extremamente perigoso, e a proteção própria e de outras pessoas deve sempre ser priorizada ao realizar este procedimento.

radionuclide-fluorescence-reporter-gene-imaging-to-track-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Tomografia de fluorescência difusa oferece uma abordagem de custo relativamente baixo e com elevado potencial de todo a...

Tomografia Computadorizada guiada por tomografia difusa no domínio do tempo de fluorescência em pequenos animais para localização de biomarcadores de câncer

Este vídeo demonstra o protocolo para implantar células cancerígenas pancreáticas que expressam proteínas fluorescentes verdes ortotopicamente no pâncreas do camundongo. O modelo ortotópico de camundongo ajuda a investigar a eficácia de novas terapêuticas em tumores primários e metastáticos.

Modelo de camundongo ortotópico fluorescente: implantando células cancerígenas que expressam GFP em camundongos para avaliar a progressão do tumor in vivo

Fonte:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Brasília, 2Departamento de Processos Psicológicos Básicos, Instituto de Psicologia, Universidade de BrasíliaEste vídeo demonstra o procedimento para rastrear a progressão do tumor in...

Imagem bioluminescente da progressão do tumor de mama em um modelo de camundongo fêmea

Neste vídeo, descrevemos a tomografia molecular de fluorescência ou FMT para imagens in vivo de xenoenxertos de glioblastoma marcados com proteína fluorescente em modelos de camundongos. A técnica é útil para elucidar os efeitos da terapêutica antitumoral em nível molecular.

Tomografia Molecular de Fluorescência: Uma Técnica de Imagem para Imagem In Vivo de Xenoenxertos de Glioblastoma Marcados com Proteína Fluorescente em Modelo de Camundongo

Descreve-se um sistema (Maroi) para in vivo quantificação de um marcador fluorescente entregue por saposina C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesículas multi-ângulo de rotação de imagem óptica. Utilizando modelos de ratinho de cancro e artrite, é mostrado como a análise da curva de sinal Maroi pode ser utilizado para o mapeamento preciso e caracterização biológica de processos de doença.

In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

Um procedimento para implantar células cancerígenas pancreáticas que expressam proteínas fluorescentes verdes (PANC-1 GFP) ortotopicamente no pâncreas de camundongos Balb-c Ola Hsd-Fox1nu para avaliar a progressão e metástase do tumor é apresentado aqui.

Fluorescente modelo de camundongo ortotópico de câncer de pâncreas

Descreve-se um método para rotulagem de xenoenxertos estável derivado do doente (PDXs) com partículas lentivirais que expressam a proteína e repórteres de luciferase fluorescente verde. Este método permite acompanhar o crescimento de PDXs no sítio primário, bem como a detecção de metástases espontâneas e experimentais que utilizam em sistemas de imagem in vivo.

Rotulagem de cancro da mama xenoenxertos derivados do paciente com rastreáveis ​​Repórteres para o crescimento de tumores e metástases Estudos

Ortotópico intracraniana injeção de células de tumor tem sido usada na pesquisa do câncer para estudar a biologia do tumor de cérebro, progressão, evolução e resposta terapêutica. Aqui nós apresentamos fluorescência molecular tomografia computadorizada de xenografts tumor, que fornece em tempo real imagens intravital e quantificação de um tumor massa em modelos pré-clínicos glioblastoma.

Fluorescência Molecular Tomography para a imagem latente na Vivo de Glioblastoma Xenografts

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo do rato do tumor-rolamento para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor no tempo real pela imagem latente dupla do bioluminescência.

Imagem de bioluminescência dupla de progressão tumoral e angiogênese

Aqui, descrevemos um método de monitoramento não invasivo envolvendo expressão de luciferase e proteína fluorescente verde em várias linhas de células cancerígenas de mama. Este protocolo fornece uma técnica para monitorar a formação de tumores e a colonização metastática em tempo real em camundongos.

Monitoramento do crescimento do câncer de mama e formação de colônia metastática em camundongos usando bioluminescência

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Aprenda a rastrear crescimento e metástase tumoral em roedores usando imagem por PET com repórter radionuclídeo-fluorescência. Este método não invasivo reduz o uso de animais em pesquisas oncológicas.

Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor

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