Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

O objetivo geral deste procedimento é gerar renderizações tridimensionais de fragmentos de árvores vilosas placentárias que sejam adequadas para a análise de suas redes vasculares contidas. Esse método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave em nosso campo, como por que uma criança pode ter crescimento restrito ou qual estresse e quão grave o estresse pode ter levado ao nascimento prematuro. A principal vantagem do nosso procedimento é que agora estamos em posição de imunomarcar o tecido claro da árvore vilosa placentária e, em seguida, visualizar suas redes vasculares e usar essas visualizações para caracterizar e analisar essas redes vasculares.

As implicações dessa técnica podem se estender a muitos diagnósticos e terapias, uma vez que a maioria das ciências da vida depende da caracterização histológica bidimensional. Demonstrando o procedimento estará a Sra. Valerie Schwenk, que realizará a imunomarcação e limpeza do tecido placentário e, em seguida, o Sr. Phillip Necaise fará a dissecção do tecido placentário e também a limpeza reversa do tecido. Para se preparar para a dissecção da árvore vilosa, primeiro enxágue o tecido placentário formal e fixo com solução salina tamponada com fosfato.

Em seguida, coloque em uma placa de Petri no palco de um microscópio de dissecação. Para localizar a árvore vilosa, use bisturi e pinças finas para rasgar o tecido placentário. Em seguida, disseque pedaços da vilosidade com aproximadamente cinco milímetros de comprimento e transfira para um microtubo contendo um mililitro de solução salina tamponada com fosfato.

Substitua a solução salina tamponada com fosfato por uma nova e aguarde 10 minutos com um redemoinho ocasional. Em seguida, substitua a solução salina tamponada com fosfato por tampão permeabilizante para permeabilizar o tecido e bloquear a ligação não específica de anticorpos secundários. Em seguida, incube por 30 minutos.

Em seguida, substitua o tampão permeabilizante por solução salina tamponada com fosfato contendo dois por cento de soro de cabra por anti CD31 monoclonal de camundongo e anti CK7 de coelho. Deixe o tecido a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, remova os anticorpos restantes com lavagens adicionais com solução salina tamponada com fosfato com soro de cabra a dois por cento.

Em seguida, remova a solução salina tamponada com fosfato com dois por cento de soro de cabra e adicione o mesmo tampão, suplementado com imunoglobulina G anti-camundongo de cabra acoplada a um fluoróforo verde e imunoglobulina G anti-coelho de cabra acoplada a um fluoróforo infravermelho. Incube por 30 minutos no escuro em temperatura ambiente. Em seguida, lave o lenço uma vez com PBS-GS e guarde o lenço rotulado no escuro em temperatura ambiente até a limpeza.

Lave as amostras três vezes com PBS em intervalos de 10 minutos. Para desidratar o tecido, remova a solução salina tamponada com fosfato e adicione 50% de etanol ao tecido e incube por 10 minutos. Após a incubação, descarte e posteriormente lave três vezes com etanol a 70% em intervalos de 10 minutos, seguido de três lavagens com etanol a 100% em intervalos de 15 minutos.

Em seguida, use uma pinça de ponta fina para transferir o tecido para um microtubo preenchido com um mililitro de solução um por quatro horas. Após quatro horas, transferir o tecido para um microtubo cheio da solução dois e incubar por mais quatro horas. Para montar o tecido em uma câmara de Sykes-Moore, use uma pinça de ponta fina para posicionar uma lamínula redonda de 25 milímetros na base da câmara.

Novamente, use a pinça de ponta fina para colocar uma junta de borracha na base da lamínula. Remova o tecido imerso na solução dois e coloque-o no centro da lamínula. Em seguida, adicione uma gota da solução dois, aproximadamente 40 microlitros, no tecido.

Em seguida, pegue uma segunda lamínula e coloque-a em cima da junta. Em seguida, comprima a lamínula e a junta com firmeza, enfiando um anel de travamento na parte superior da base. Em seguida, insira uma agulha de calibre 25 através da junta na porta da base.

Em seguida, encha uma seringa de três mililitros com um vírgula cinco mililitros da solução dois. Em seguida, monte uma agulha de calibre 25 na seringa e insira a agulha na porta oposta através da junta. Em seguida, comece a injetar a câmara com a solução dois e verifique se o ar dentro da câmara está sendo ventilado pela outra agulha de calibre 25.

Quando a câmara estiver cheia, remova a agulha e a seringa e coloque o suporte da câmara Sykes-Moore no microscópio confocal stage. Use uma objetiva de 10X para focar o tecido colocado na câmara. Em seguida, defina um ponto de referência para a platina e mova a platina do microscópio para cima e para baixo através do plano focal para identificar e definir a parte superior e inferior do tecido.

Defina o tamanho do passo para dois vírgula cinco micrômetros e colete um arquivo de imagem confocal contendo um conjunto de imagens do tecido de cima para baixo. Em seguida, transfira o tecido para um microtubo contendo mais de 20 vezes o volume de etanol 100% para reverter a limpeza. Em seguida, após cada intervalo de uma hora, substitua por 70 e, em seguida, por 50% de etanol e, finalmente, solução salina tamponada com fosfato.

Armazene a quatro graus Celsius no escuro até incorporar. Aqui, para mostrar a rede vascular placentária, foram adquiridas imagens microscópicas e microscópicas confocais de uma placenta humana. Essas imagens microscópicas da placenta mostram a árvore vilosa radiante que penetrou no parênquima placentário.

Essas imagens microscópicas mostram a presença de uma porção distal de pedaços de árvores vilosas terminando no aglomerado de vilosidades. Em seguida, para mostrar a camada trofoblástica das vilosidades, a porção distal da árvore das vilosidades foi imunomarcada. Na imagem, a camada externa do trofoblasto é mostrada em verde e os capilares são mostrados em vermelho.

Em seguida, para verificar o tecido placentário antes e depois da limpeza, foram adquiridas imagens confocais de tecidos placentários não limpos e limpos. As imagens mostram que, para um tecido não limpo, a imunofluorescência pode ser capturada a 100 micrômetros ou menos profundidade do tecido. Pelo contrário, para tecido placentário limpo, a imunofluorescência pode ser capturada em uma profundidade muito maior.

Além disso, para comparar o tecido convencional com as seções claras invertidas, o tecido limpo foi desidratado em um processo reverso com etanol. A coloração imuno-histoquímica do tecido placentário com anti CK7 antes e após a limpeza não demonstra alteração significativa na morfologia do tecido devido à limpeza. A animação mostra que o tecido viloso imunomarcado é distribuído ao longo de toda a profundidade do volume do tecido.

Quando estiver confortável em fazer o procedimento, você pode esperar que leve cerca de 18 horas, divididas em três dias. Ao tentar fazer este procedimento, é importante lembrar que ele requer vários conjuntos de habilidades diferentes. É preciso ser capaz de fazer patologia placentária, microscopia confocal.

Você precisa ser capaz de gerar renderizações tridimensionais da imagem e precisa estar familiarizado com o imunoprocessamento e a análise. Seguindo este procedimento, outros métodos como histologia tradicional, página STS ou maldi podem ser realizados. Com seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho no campo da medicina materno-fetal, neonatologia e biologia trofoblástica para explorar as causas subjacentes à pré-eclâmpsia, baixo crescimento fetal e sofrimento fetal.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como limpar, renderizar e analisar o tecido das vilosidades placentárias. Muito obrigado por assistir ao vídeo e boa sorte com seus experimentos.