Name: Secas de sangue e soro manchas como uma ferramenta útil para o armazenamento de amostra avaliar biomarcadores de câncer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprenda a armazenar sangue e soro em manchas secas para análise de biomarcadores de câncer sem congelamento. Este método permite preservar amostras por pelo menos duas semanas em temperatura ambiente.

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Soro e sangue periférico foram coletadas e armazenadas de doadores saudáveis e pacientes que deram consentimento escrito para participar no estudo. O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de ética local em conformidade com os padrões éticos estabelecidos na declaração de Helsinque 1964.
1. sangue armazenamento em DBS
<ol><li>
Coleta de amostra de sangue
	<ol>
<li>Colete 3 mL de amostra de sangue periférico em um tubo de 3 mL com 5,4 mg de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Nota: Guarde o sangue periférico como DBS logo que possível e dentro de 8 h.</li>
		<li>Escreva o número de código do paciente no canto inferior direito do cartão de poupança.</li>
		<li>Resuspenda cuidadosamente o sangue com uma pipeta de 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sangue manchando em DBS
	<ol>
<li>Pipeta e uma mancha de sangue (50 µ l) para o cartão de poupança (Tabela de materiais) com ponta 50 – 200 µ l de transferência.</li>
		<li>Repita a etapa 1.2.1. para ter um total de 3 – 5 manchas de sangue. Descartar a velha ponta e tomar um novo para cada sangue alíquota.</li>
		<li>Deixe o DBS para secar durante a noite em temperatura ambiente na posição horizontal, sobre uma superfície não-absorvente aberta, evitando a luz direta do sol. Deixe a tampa do cartão poupança aberta para facilitar a secagem do sangue. Nota: Quaisquer partículas no ar ou poeira durante esta etapa de secagem não afeta os aplicativos a jusante.</li>
		<li>Guarde o cartão em temperatura ambiente em um saco plástico com dessecante até o uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. extração de DNA a partir de DBS de acordo com o Datasheet de Kit de extração de DNA (seção de manchas de sangue seco)
<ol><li>
Preparação da amostra
	<ol>
<li>Use 3 manchas de sangue seco do cartão. Cortar cada uma das manchas de sangue seco do cartão e separá-los da placa com uma pinça. Corte as manchas de sangue seco separado em pedaços pequenos (diâmetro de cerca de 1 mm).</li>
		<li>Coloque as peças pequenas para um tubo de centrifugação de 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Digestão da amostra
	<ol>
<li>Adicione 180 µ l de tampão de Lise 1 fornecidos no kit (Tabela de materiais) para o tubo. Adicionar 20 µ l de Proteinase K. Não misture lise 1 com Proteinase k antes de pipetagem no tubo de 1,5 mL de sangue manchado o cartão. Misture-se pela utilização do vortex.</li>
		<li>Colocar o tubo em um thermoincubator e incubar a 56 ° C durante 60 min. Se o thermoincubator não está equipado com um agitador, vórtice a amostra cada 10 – 15 min pelo menos 10 s, tomando cuidado para não deixar a temperatura da amostra diminuir. Brevemente centrifuga os tubos para remover gotas da tampa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etapa de lavagem
	<ol>
<li>Adicionar 200 µ l de tampão de Lise 2 (Tabela de materiais) e vórtice por 10 s.</li>
		<li>Coloque os tubos em um thermomixer ou incubadora orbital aquecida e incubar a 70 ° C durante 10 min. Se o thermoincubator não está equipado com um agitador, vórtice amostras uma vez para pelo menos 10 s, tomando cuidado para não deixar a temperatura das amostras a diminuir.</li>
		<li>Repita a etapa 2.3.1. Transferi a 400 µ l de lisado do tubo de 1,5 mL para coluna de eluição (Tabela de materiais). Centrifugue a coluna a 6.000 x g por 1 min.</li>
		<li>Coloque a coluna de eluição em um novo tubo de coleta de 2 mL e descarte a outra.</li>
		<li>Adicione 500 µ l de tampão de lavagem 1 (Tabela de materiais) e centrifugar a 6.000 x g por 1 min.</li>
		<li>Colocar a coluna em um novo tubo de coleta de 2 mL e descarte a outra.</li>
		<li>Adicione 500 µ l de tampão de lavagem 2 (Tabela de materiais) e centrifugar a 6.000 x g por 1 min.</li>
		<li>Colocar a coluna em um novo tubo de coleta de 2 mL e descarte a outra.</li>
		<li>Centrifugar a 20.000 x g, durante 3 min secar a membrana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etapa de eluição
	<ol>
<li>Coloque a coluna para um novo tubo de centrifugação de 1,5 mL e descartar o tubo de coleta.</li>
		<li>Colocar 50 µ l de água destilada sobre o centro da membrana. Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 20.000 x g por 1 min. recolher o eluato e colocá-lo novamente no centro da membrana.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 20.000 x g por 1 min. descartar a membrana.</li>
		<li>Medir a concentração de DNA utilizando um espectrofotômetro.</li>
		<li>DNA de loja a-20 ° C até o uso. Nota: DNA extraído de DBS pode ser usado para executar várias análises, tais como avaliação de SNP por PCR em tempo Real ou DNA Sanger sequenciamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. soro armazenamento para DSS
<ol><li>
Coleta de amostra de sangue
	<ol>
<li>Colete 7 mL de amostra de sangue periférico em um tubo de 7 mL sem EDTA. Embora a amostra de sangue a coagular durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Escreva o número de código do paciente no canto inferior direito do cartão de poupança.</li>
		<li>Centrifugar a amostra de sangue a 980 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Nota: Guarde o soro como DSS logo que possível e dentro de 8 h.</li>
		<li>Cuidadosamente, remover o sobrenadante do tubo e transferi-lo para um novo tubo de 15 mL. Resuspenda cuidadosamente o sangue com uma pipeta de 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soro de spotting no DSS
	<ol>
<li>Pipeta e uma mancha de soro (50 µ l) para o cartão da poupança de transferência. Repita este passo para ter um total de 3 – 5 manchas de sangue. Nota: Tenha muito cuidado para pipetar exatamente 50 µ l de soro para cada ponto. Soro não deverá ir além da linha tracejada do cartão.</li>
		<li>Deixe o DSS para secar durante a noite em temperatura ambiente. Deixe a tampa do cartão poupança aberta para facilitar a secagem do sangue.</li>
		<li>Guarde o cartão em temperatura ambiente em um saco plástico com dessecante até o uso. Se o armazenamento é superior a 14 dias, guarde o cartão a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ensaio de ELISA a partir de DSS
<ol><li>
Eluir proteína de DSS.
	<ol>
<li>Se necessário, descongele um DSS para cada amostra. Corte o DSS em pequenos pedaços (cerca de 1 mm de diâmetro). Coloque os pedaços em um tubo de 1,5 mL com 400 µ l de PBS.</li>
		<li>Agitar as amostras durante a noite a 4 ° C. Nota: Perdê-los em baixa intensidade. PBS não molhar a tampa do tubo durante a tremer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use o eluato de proteína como uma amostra de soro para análise de fator de crescimento/proteína secretada de acordo com instruções do kit de ELISA, após diluições apropriadas. Nota: Este procedimento funciona bem para a deteção de DBP9. Para outros ensaios de ELISA, uma etapa de otimização pode ser necessária.</li>
</ol>

<ol><li>Bertagnolio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+drug+resistance+surveillance+using+dried+whole+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots.</a> Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).</li>
<li>Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+filter+paper+for+the+collection+and+analysis+of+human+whole+blood+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens.</a> J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).</li>
<li>Garrido, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype+variability%2C+virological+response+and+drug+resistance+assessed+on+dried+blood+spots+collected+from+HIV+patients+on+antiretroviral+therapy+in+Angola%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola.</a> J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).</li>
<li>Steegen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+detecting+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+in+DNA+extracted+from+whole+blood+or+dried+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots.</a> J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).</li>
<li>Costenaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+load+detection+using+dried+blood+spots+in+a+cohort+of+HIV-1-infected+children+in+Uganda%3A+correlations+with+clinical+and+immunological+criteria+for+treatment+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).</li>
<li>Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+glutathione+and+glutathione+disulfide+in+the+blood+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase-deficient+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns.</a> BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).</li>
<li>Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practice+in+the+measurement+and+interpretation+of+lysosomal+acid+lipase+in+dried+blood+spots+using+the+inhibitor+Lalistat+2%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2.</a> Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).</li>
<li>Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+25+inflammatory+markers+and+neurotrophins+in+neonatal+dried+blood+spots+by+immunoassay+with+xMAP+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology.</a> Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).</li>
<li>Amadori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+polymorphisms+or+serum+levels+as+key+drivers+of+breast+cancer+development%3F+The+question+of+the+vitamin+D+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway.</a> Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).</li>
<li>Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+hepatitis+B+virus+from+dried+blood+spots+by+polymerase+chain+reaction+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.</a> J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).</li>
<li>Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+commercial+ELISA+for+the+detection+of+measles-specific+immunoglobulin+G+%28IgG%29+in+dried+blood+spots+collected+from+children+living+in+low-resource+settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings.</a> J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).</li>
<li>Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA-based+assay+for+IP-10+detection+from+filter+paper+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples.</a> Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).</li>
<li>St Julien, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+quality+genome-wide+genotyping+from+archived+dried+blood+spots+without+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification.</a> PLoS One. 8 (5), e64710(2013).</li>
<li>Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+fentanyl+analogs+in+dried+blood+spots+by+flow-through+desorption+coupled+to+online+solid+phase+extraction+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry.</a> Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Este protocolo investiga o potencial para armazenamento de sangue e soro em papel de filtro quando os laboratórios não têm o pessoal ou as infra-estruturas necessárias para a manipulação correta de amostras de sangue. Em particular, sangue total ou soro coletado em tubos padrão ou por picada do dedo pode ser armazenado usando este método e não há nenhuma necessidade para congelar amostras a-20 ° C ou -80 ° C imediatamente após a coleta de sangue. DBS/DSS podem permanecer em temperatura ambiente por até 14 dias sem qualqu...

O principal objetivo da pesquisa em biomarcadores de câncer é a identificação de novos parâmetros biológicos que pode ser usada para diagnóstico, prognóstico de pacientes prever e para determinar se um paciente responderá a um tratamento específico. Esta área de investigação é fundamental para a descoberta de tratamentos inovadores e desempenha um papel fundamental no tratamento sob medido.
Os procedimentos realizados durante cada passo do biomarcador identificação e validação devem ser confiável e reprodutível. Uma pedra fundamental para o sucesso da investigação de translação é o correto armazenamento de amostras biológicas como sangue e soro. Este é o primeiro passo para obtenção de material biológico de alta qualidade que pode ser usado para realizar experimentos de biologia molecular ou ensaios da proteína.
Estudos multicêntricos são muitas vezes necessários para recrutar suficiente pacientes para obter dados robustos. Nem todos os institutos são capazes de armazenar amostras a-80 ° C ou para enviar amostras para outros centros internacionais em gelo seco. O uso de papel de filtro para coleta de sangue é um método simples para armazenar sangue e soro e não exige o imediato congelamento de amostras1,2. Uma gota de sangue ou soro pode ser vista no papel, deixada para secar durante a noite e então armazenado por até 14 dias em temperatura ambiente1,2. Isto dá a investigadores tempo para enviar as amostras de outros laboratórios. O uso de sangue seco manchas (DBS) e manchas secas soro (DSS), portanto, poderiam simplificar a colaboração entre os institutos em países desenvolvidos e em desenvolvimento.
Dada a sua facilidade de uso, amostragem de DBS é amplamente utilizada em diversos tipos de ensaios para análises a jusante serológicas ou genéticas. Por exemplo, no passado, DBS frequentemente foram usados para HIV triagem em países em desenvolvimento1,2,3,4,5. Outra vantagem deste método de armazenamento é que podem ser colhidas amostras de sangue do dedo-picas, permitindo seu uso para o recém-nascido, triagem de testes 6,7,8. Amostra de fácil manuseio e transporte são ainda mais vantagens de DBS, especialmente para amostras coletadas em locais remotos onde não há nenhum equipamento de laboratório. Em uma publicação anterior, usamos DBS e DSS para testar a vitamina D e vitamina D (DBP) proteína em uma série de pacientes africanos e caucasianos9. Nossos colegas africanas não foram capazes de obter gelo seco. Para comparar os marcadores biológicos para entender as diferenças na via da vitamina D, entre as duas populações étnicas, melhorámos ainda mais o procedimento usando combinadas amostras armazenadas sob condições normais e em papel de filtro. Depois de otimizar o procedimento DBS/DSS, fomos capazes de analisar DBP e vitamina D no soro em ambas as coortes. Avaliamos também um número de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) após a extração de DNA do sangue inteiro para brancos e de DBS para africanos9. O presente protocolo permite que as amostras de sangue de alta qualidade para ser armazenado em temperatura ambiente, sem afetar diferentes tipos de análises a jusante que variam de biologia molecular para ensaios de ELISA. É recomendável para uso gerenciar materiais biológicos em estudos multicêntricos ou para centros que não têm instalações para as condições de armazenamento padrão. O protocolo seguinte representa o culminar destes procedimentos otimizados.

<table><tbody><tr><td>Cartões de economia de proteína Whatman 903 Cartão de economia de proteína, 100/pk&lrm;</td><td>Sigma</td><td>Z761575</td><td>Útil para armazenar amostras à temperatura ambiente para análises a jusante</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas Falcon, 5 mL</td><td>Stem cell</td><td>#38003</td><td></td></tr><tr><td>50-200 &micro; Pontas L</td><td>Star-Lab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA microkit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Este é um kit de extração de DNA projetado para isolar pequenas quantidades de DNA&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Buffer ATL (incluído no microkit QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Isso é relatado como Buffer de Lise 1 no texto</td></tr><tr><td>Buffer AL (incluído no microkit QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Isso é relatado como Buffer de Lise 2 no texto</td></tr><tr><td>QIAamp mini coluna de eluir</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Isso é relatado como coluna no texto</td></tr><tr><td>AW1&nbsp; (incluído no microkit QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Isso é relatado como Wash Buffer 1 NO TEXTO</td></tr><tr><td>AW2&nbsp; (incluído no microkit QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Isso é relatado como Wash Buffer 2 no texto</td></tr><tr><td>Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D sistemas</td><td>DVDBP0</td><td></td></tr></tbody></table>

secas de sangue e soro manchas como uma ferramenta útil para o armazenamento de amostra avaliar biomarcadores de câncer

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Qualidade de amostra de sangue é essencial para garantir a precisa análises a jusante como real-time PCR ou ELISA. Armazenamento correto de materiais biológicos é o ponto de partida para alcançar resultados reprodutíveis e confiáveis. Todas as amostras devem ser tratadas da mesma forma de coleta de sangue para armazenamento. Dependendo de análises a realizar, amostras de soro e sangue total devem ser armazenadas a-20 ° C ou -80 ° C até o uso. Amostras de sangue/soro também devem ser aliquotadas para evitar múltiplas de congelamento-descongelamento. Outra questão importante é as condições da amostra durante o transporte de um laboratório para outro. Se o gelo seco não está disponível ou o carregamento demora mais do que alguns dias, são necessárias abordagens alternativas. Uma opção é usar papel de filtro para coleta de sangue. Aqui, propomos um método de sangue e coleta de amostra de soro que aproveita seca manchas de sangue (DBS) e seca manchas de soro (DSS). Nós desenvolvemos o procedimento para extrair DNA de DBS para a avaliação a jusante de alguns polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) por PCR em tempo real. Nós também Aperfeiçoamos um ensaio de ELISA, a partir de proteínas eluídas da DSS. Esse método pode ser usado com outros ensaios de ELISA ou procedimentos de avaliação de proteínas.

Tiramos vantagem dos procedimentos de DBS e DSS para armazenar sangue e soro à temperatura ambiente, sem afetar a qualidade do material biológico. A Figura 1 mostra um exemplo do protetor de cartão de proteína sem sangue e após a coleta de sangue. A fim de confirmar que o armazenamento em papel de filtro e o procedimento para eluir sangue não interferem com a qualidade da amostra, realizamos uma comparação com métodos de armazenamento padrão. Que extraímos o ...

Este protocolo descreve um método simples e útil para armazenar o sangue periférico e soro/plasma para análises a jusante, tais como avaliação de nucleotídeo único (SNP) de polimorfismo e ensaio de ELISA.

Secas de sangue e soro manchas como uma ferramenta útil para o armazenamento de amostra avaliar biomarcadores de câncer

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa translacional, como a chance de estudar biomarcadores em pacientes de países em desenvolvimento. A principal vantagem desta técnica é a possibilidade de armazenar amostras de sangue e soro por pelo menos duas semanas sem congelamento e fornecer material de alta qualidade para análise a jusante, como qPCR e ELISA. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de doenças como câncer e doenças infecciosas.Este método também pode ser aplicado nos campos de diagnóstico ou pesquisa, como o estudo de doenças pré-natais ou a análise de patologias infecciosas, como o HIV. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando começamos a comparar biomarcadores entre uma série de casos caucasianos e africanos para os quais as amostras congeladas não estavam disponíveis. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de manchas de sangue são difíceis de aprender.Neste procedimento, três mililitros de uma amostra de sangue são coletados em um tubo de três mililitros com 5,4 miligramas de EDTA. Escreva o número do código do paciente no canto inferior direito do cartão de poupança. Ressuspenda cuidadosamente o sangue com uma pipeta de cinco mililitros.Em seguida, pipete e transfira um ponto de sangue para o cartão de proteção. Usando uma nova ponta para cada alíquota de sangue, repita o spotting para obter um total de três a cinco manchas de sangue. Deixe as manchas de sangue seco, ou DBS, secarem durante a noite em temperatura ambiente com a tampa do cartão de proteção aberta na posição horizontal sobre uma superfície aberta e não absorvente e evitando a luz solar direta.No dia seguinte, guarde o cartão em temperatura ambiente em um saco plástico com dessecante até o uso. O DNA será extraído de três manchas de sangue seco do cartão de proteção. Comece cortando cada um dos DBS do cartão e separando-os do cartão.Corte o DBS separado em pequenos pedaços de cerca de um milímetro de diâmetro. Coloque os pequenos pedaços de um DBS em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Para digerir as amostras, adicione ao tubo 180 microlitros de tampão de lise de um kit de extração de DNA disponível comercialmente e, em seguida, adicione 20 microlitros de proteinase K.Mix por vórtice.Coloque o tubo em uma termo-incubadora e incube com agitação a 56 graus Celsius por 60 minutos. No final da incubação, centrifugue brevemente o tubo para remover as gotas da tampa. Comece a lavagem adicionando 200 microlitros de tampão de lise dois e vórtice por 10 segundos.Coloque o tubo em um termo-misturador e incube a 70 graus Celsius por 10 minutos. Coloque a coluna de ilusão em um novo tubo de coleta de dois mililitros e descarte o antigo. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem e centrifugue a 6000 vezes a gravidade por um minuto.Coloque a coluna em um novo tubo de coleta de dois mililitros e descarte o antigo. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem dois e centrifugue a 6000 vezes a gravidade por um minuto. Coloque a coluna em um novo tubo de coleta de dois mililitros e descarte o antigo.Centrifugue a 20.000 vezes a gravidade por três minutos para secar a membrana. Para eluir o DNA, coloque a coluna em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e descarte o tubo de coleta. Coloque 50 microlitros de água destilada no centro da membrana e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.Centrifugue o tubo a 20.000 vezes a gravidade por um minuto. Recolha o eluidor e coloque novamente no centro da membrana. Centrifugue o tubo novamente a 20.000 vezes a gravidade por um minuto.Descarte a membrana. Depois de medir a concentração de DNA usando um espectrofotômetro, armazene o DNA a menos 20 graus Celsius até o uso. Para este procedimento, sete mililitros de amostra de sangue periférico são coletados primeiro em um tubo de sete mililitros sem EDTA.Deixe a amostra de sangue coagular em temperatura ambiente por 30 minutos. Escreva o número do código do paciente no canto inferior direito do cartão de poupança. Centrifugue a amostra de sangue a 1100 vezes a gravidade à temperatura ambiente por 15 minutos.Retirar o sobrenadante do tubo e transferi-lo para um novo tubo de 15 mililitros. Ressuspenda cuidadosamente o sangue com uma pipeta de cinco mililitros. Pipete e transfira um ponto de soro para o cartão de proteção.Repita o sangramento para obter um total de três a cinco manchas de sangue. Deixe as manchas secas secarem durante a noite em temperatura ambiente com a tampa do cartão de proteção aberta. No dia seguinte, guarde o cartão em temperatura ambiente em um saco plástico com dessecante até o uso.Se o armazenamento for superior a 14 dias, armazene a menos 20 graus Celsius. Prepare-se para o ensaio ELISA descongelando o DSS para cada amostra, se necessário. Para eluir a proteína do DSS, corte um DSS em pequenos pedaços de cerca de um milímetro de diâmetro e coloque os pedaços em um tubo de 1,5 mililitro.Em seguida, adicione quatro microlitros de PBS. Agite as amostras em baixa velocidade a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, utilizar uma diluição adequada da proteína eluída como amostra de soro para a análise das proteínas secretadas ou dos factores de crescimento, utilizando um kit disponível no mercado.Nesse protocolo, amostras de sangue e soro foram armazenadas como manchas secas em papel filtro à temperatura ambiente. Um cartão de proteção de proteína representativo é mostrado antes e depois da coleta de sangue. Para confirmar que o armazenamento em papel de filtro e o procedimento de eluir o sangue não interferem na qualidade da amostra, foram realizados ensaios de ELISA para os níveis de proteína ligadora de vitamina D, ou DBP, em oito amostras de soro coletadas em tubo de dois mililitros e armazenadas imediatamente a 80 graus Celsius negativos ou coletadas como manchas de soro seco.O coeficiente de variação, ou CV, entre as amostras pareadas variou de 2% a 24% e o CV médio foi de 9,6%Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 10, 15 minutos se for realizada corretamente. Seguindo este procedimento, métodos a jusante de biologia molecular ou análise de proteínas podem ser realizados. Após seu desenvolvimento, essa técnica permite que pesquisas no campo da pesquisa translacional e análise de biomarcadores colaborem com institutos de todo o mundo que não possuem equipamentos de laboratório para armazenar amostras biológicas em condições padrão.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como armazenar corretamente amostras de sangue em sangue seco e manchas de soro. Não se esqueça de que trabalhar com sangue e reagentes químicos pode ser extremamente perigoso e precauções como usar luvas e jaleco devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Biomarcadores são indicadores biológicos diretamente-medidos de doença ou de saúde. Na população e as ciências sociais, os biomarcadores precisa ser de fácil obtenção, transporte e analisar. Secas mancha de sangue (DBS) coleção atende a essa necessidade, podem ser coletadas no campo com altas taxas de resposta e analisados ​​para uma variedade de biomarcadores.

Secas Coleta de Sangue Mancha de Biomarcadores de saúde para maximizar a participação em Estudos Populacionais

Aqui descrevemos um ensaio de cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massa em tandem (HPLC-MS/MS) para quantificar o imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco usando uma etapa de precipitação de proteína manual simples e extração em coluna online.

Quantificação do imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando LC-MS / MS

A preparação e o processamento de manchas de sangue seco (DBS) para sua análise final ainda mal são padronizados para a maioria das aplicações de diagnóstico. Para superar esta lacuna, um abrangente protocolo passo a passo é sugerido e posteriormente avaliado no que respeita à sua eficácia para a detecção de marcadores de infecções virais.

Manchas de sangue seco - preparação e processamento para uso em imunoensaios e em técnicas moleculares

Os tumores cutâneos são frequentemente descartados após a cirurgia micrográfica de Mohs. Descreve-se aqui um protocolo que permite que a equipe de suporte clínico processe e armazene eficazmente amostras de tumores cutâneos ( por exemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular e melanoma) para aplicações laboratoriais a jusante sem interferir com as operações clínicas.

Estabelecimento de um Biorepository baseado em Clínica

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Os biobancos são recursos cruciais para a investigação biomédica e a Unidade Biobank for Translational and Digital Medicine do Instituto Europeu de Oncologia é um modelo neste domínio. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada dos procedimentos operacionais padrão dos biobancos para o manejo de diferentes tipos de amostras biológicas humanas.

Biobanco para Medicina Translacional: Procedimentos Operacionais Padrão para o Gerenciamento Ótimo de Amostras

A biópsia líquida revolucionou nossa abordagem para estudos translacionais em oncologia, com coleta de amostras, qualidade e armazenamento sendo passos cruciais para sua aplicação clínica bem sucedida. Aqui descrevemos um protocolo padronizado e validado para aplicações de DNA sem circulação a jusante que podem ser aplicados na maioria dos laboratórios de pesquisa translacional.

Um protocolo pré-analítico de biópsia líquida padronizada para aplicações de DNA sem circulação a jusante

Este artigo descreve a aplicação de equipamentos automatizados para separar e coletar substâncias de forma fácil e eficiente, como DNA livre de células e células tumorais circulantes, do sangue total.

Separação Automática e Coleta de Substâncias Relacionadas ao Câncer de Amostras Clínicas

Um protocolo é apresentado para a determinação de biomarcadores de baixa abundância a partir de amostras secas de soro exemplificadas com o biomarcador progastrina-releasing peptide (ProGRP). Esferas magnéticas revestidas com anticorpos são usadas para a limpeza seletiva e enriquecimento de um peptídeo proteotípico ProGRP. O peptídeo capturado é posteriormente analisado por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem.

Microamostragem em Análise de Proteínas de Baixa Abundância Baseada em Espectrometria de Massa

Este protocolo descreve um método para facilitar a coleta de amostras de espécimes de prostatectomia radical. O objetivo é mapear, caracterizar e dissecar micro-macro amostras de tecido dos espécimes com base em critérios anatomopatológicos antes de armazená-los em um Biobanco.

Melhorando a confiabilidade do biobanco de tumores de próstata com técnica de amostragem aprimorada e caracterização histológica

Este protocolo padroniza a análise SDS-PAGE para perfilamento personalizado de corona proteica em nanopartículas, permitindo a detecção reprodutível, escalável e de baixo custo de assinaturas específicas do câncer. Projetado para o diagnóstico precoce do adenocarcinoma ductal pancreático, oferece uma alternativa prática e alinhada ao REASSURED aos métodos proteômicos complexos tanto em pesquisas quanto em ambientes clínicos.

Fluxo de Trabalho Padronizado SDS-PAGE para Perfil Personalizado de Corona de Proteínas na Detecção Precoce de Câncer

Aprenda a armazenar sangue e soro em manchas secas para análise de biomarcadores de câncer sem congelamento. Este método permite preservar amostras por pelo menos duas semanas em temperatura ambiente.

Secas de sangue e soro manchas como uma ferramenta útil para o armazenamento de amostra avaliar biomarcadores de câncer

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