Secas de sangue e soro manchas como uma ferramenta útil para o armazenamento de amostra avaliar biomarcadores de câncer

Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa translacional, como a chance de estudar biomarcadores em pacientes de países em desenvolvimento. A principal vantagem desta técnica é a possibilidade de armazenar amostras de sangue e soro por pelo menos duas semanas sem congelamento e fornecer material de alta qualidade para análise a jusante, como qPCR e ELISA. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de doenças como câncer e doenças infecciosas.

Este método também pode ser aplicado nos campos de diagnóstico ou pesquisa, como o estudo de doenças pré-natais ou a análise de patologias infecciosas, como o HIV. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando começamos a comparar biomarcadores entre uma série de casos caucasianos e africanos para os quais as amostras congeladas não estavam disponíveis. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de manchas de sangue são difíceis de aprender.

Neste procedimento, três mililitros de uma amostra de sangue são coletados em um tubo de três mililitros com 5,4 miligramas de EDTA. Escreva o número do código do paciente no canto inferior direito do cartão de poupança. Ressuspenda cuidadosamente o sangue com uma pipeta de cinco mililitros.

Em seguida, pipete e transfira um ponto de sangue para o cartão de proteção. Usando uma nova ponta para cada alíquota de sangue, repita o spotting para obter um total de três a cinco manchas de sangue. Deixe as manchas de sangue seco, ou DBS, secarem durante a noite em temperatura ambiente com a tampa do cartão de proteção aberta na posição horizontal sobre uma superfície aberta e não absorvente e evitando a luz solar direta.

No dia seguinte, guarde o cartão em temperatura ambiente em um saco plástico com dessecante até o uso. O DNA será extraído de três manchas de sangue seco do cartão de proteção. Comece cortando cada um dos DBS do cartão e separando-os do cartão.

Corte o DBS separado em pequenos pedaços de cerca de um milímetro de diâmetro. Coloque os pequenos pedaços de um DBS em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Para digerir as amostras, adicione ao tubo 180 microlitros de tampão de lise de um kit de extração de DNA disponível comercialmente e, em seguida, adicione 20 microlitros de proteinase K.Mix por vórtice.

Coloque o tubo em uma termo-incubadora e incube com agitação a 56 graus Celsius por 60 minutos. No final da incubação, centrifugue brevemente o tubo para remover as gotas da tampa. Comece a lavagem adicionando 200 microlitros de tampão de lise dois e vórtice por 10 segundos.

Coloque o tubo em um termo-misturador e incube a 70 graus Celsius por 10 minutos. Coloque a coluna de ilusão em um novo tubo de coleta de dois mililitros e descarte o antigo. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem e centrifugue a 6000 vezes a gravidade por um minuto.

Coloque a coluna em um novo tubo de coleta de dois mililitros e descarte o antigo. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem dois e centrifugue a 6000 vezes a gravidade por um minuto. Coloque a coluna em um novo tubo de coleta de dois mililitros e descarte o antigo.

Centrifugue a 20.000 vezes a gravidade por três minutos para secar a membrana. Para eluir o DNA, coloque a coluna em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e descarte o tubo de coleta. Coloque 50 microlitros de água destilada no centro da membrana e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.

Centrifugue o tubo a 20.000 vezes a gravidade por um minuto. Recolha o eluidor e coloque novamente no centro da membrana. Centrifugue o tubo novamente a 20.000 vezes a gravidade por um minuto.

Descarte a membrana. Depois de medir a concentração de DNA usando um espectrofotômetro, armazene o DNA a menos 20 graus Celsius até o uso. Para este procedimento, sete mililitros de amostra de sangue periférico são coletados primeiro em um tubo de sete mililitros sem EDTA.

Deixe a amostra de sangue coagular em temperatura ambiente por 30 minutos. Escreva o número do código do paciente no canto inferior direito do cartão de poupança. Centrifugue a amostra de sangue a 1100 vezes a gravidade à temperatura ambiente por 15 minutos.

Retirar o sobrenadante do tubo e transferi-lo para um novo tubo de 15 mililitros. Ressuspenda cuidadosamente o sangue com uma pipeta de cinco mililitros. Pipete e transfira um ponto de soro para o cartão de proteção.

Repita o sangramento para obter um total de três a cinco manchas de sangue. Deixe as manchas secas secarem durante a noite em temperatura ambiente com a tampa do cartão de proteção aberta. No dia seguinte, guarde o cartão em temperatura ambiente em um saco plástico com dessecante até o uso.

Se o armazenamento for superior a 14 dias, armazene a menos 20 graus Celsius. Prepare-se para o ensaio ELISA descongelando o DSS para cada amostra, se necessário. Para eluir a proteína do DSS, corte um DSS em pequenos pedaços de cerca de um milímetro de diâmetro e coloque os pedaços em um tubo de 1,5 mililitro.

Em seguida, adicione quatro microlitros de PBS. Agite as amostras em baixa velocidade a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, utilizar uma diluição adequada da proteína eluída como amostra de soro para a análise das proteínas secretadas ou dos factores de crescimento, utilizando um kit disponível no mercado.

Nesse protocolo, amostras de sangue e soro foram armazenadas como manchas secas em papel filtro à temperatura ambiente. Um cartão de proteção de proteína representativo é mostrado antes e depois da coleta de sangue. Para confirmar que o armazenamento em papel de filtro e o procedimento de eluir o sangue não interferem na qualidade da amostra, foram realizados ensaios de ELISA para os níveis de proteína ligadora de vitamina D, ou DBP, em oito amostras de soro coletadas em tubo de dois mililitros e armazenadas imediatamente a 80 graus Celsius negativos ou coletadas como manchas de soro seco.

O coeficiente de variação, ou CV, entre as amostras pareadas variou de 2% a 24% e o CV médio foi de 9,6%Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 10, 15 minutos se for realizada corretamente. Seguindo este procedimento, métodos a jusante de biologia molecular ou análise de proteínas podem ser realizados. Após seu desenvolvimento, essa técnica permite que pesquisas no campo da pesquisa translacional e análise de biomarcadores colaborem com institutos de todo o mundo que não possuem equipamentos de laboratório para armazenar amostras biológicas em condições padrão.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como armazenar corretamente amostras de sangue em sangue seco e manchas de soro. Não se esqueça de que trabalhar com sangue e reagentes químicos pode ser extremamente perigoso e precauções como usar luvas e jaleco devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.