Um ensaio de buraqueira/Tunneling para deteção de hipóxia em larvas de Drosophila melanogaster

O objetivo geral deste ensaio é identificar larvas de drosófila que sofrem de hipóxia tecidual, apesar de estarem em níveis normais de oxigênio. Na drosófila, existem muitas mutações que produzem crescimento lento e pobre das larvas e alguma lentidão das larvas. Este ensaio identifica dentro dessa classe de larvas, aquelas que sofrem de hipóxia tecidual.

Em última análise, este ensaio ajudará a identificar mais mutações que produzem deficiência de oxigênio nos tecidos por meio de vários processos fisiológicos. A ideia para este ensaio surgiu da observação de que larvas com vias aéreas ou traqueia danificadas apresentavam dois comportamentos estranhos. Esses comportamentos anormais são a falha em se enterrar na comida durante o início da vida da larva e a falha em fazer um túnel em um substrato mais macio durante a fase errante.

Configure os cruzamentos genéticos de controle e experimentais em pratos de postura de ovos, conforme descrito no protocolo de texto. Mantenha as moscas na escuridão por pelo menos dois dias antes de iniciar as coletas de ovos cronometradas. Para a coleta cronometrada de ovos, transfira os adultos para novos pratos de ágar uva decorados com uma mancha fresca de pasta de fermento no início do dia e deixe os adultos colocarem ovos nos pratos por quatro horas.

Após quatro horas, transfira os adultos para placas de ágar uva fresca. Em seguida, incube as placas de coleta de quatro horas durante a noite a 25 graus Celsius. Na tarde seguinte, a maioria das larvas terá eclodido.

Planeje ter pelo menos 50 para cada grupo experimental. Para uma única execução do ensaio, prepare pelo menos cinco placas de ensaio por grupo experimental. Adicione 16 gramas de ágar mosca e 700 mililitros de água deionizada por aquecimento.

Prepare um Nipagen de 17,5 mililitros em etanol a 95%. Aqueça a solução de ágar até que esteja quase completamente dissolvida. Em seguida, adicione a solução de Nipagen à solução de ágar e aqueça até que o ágar se dissolva completamente.

Resfrie a solução de ágar brevemente e, em seguida, carregue placas de 10 centímetros com 15 mililitros da solução de ágar. Assim que o ágar gelificar, coloque as tampas nos pratos e deixe-os secar em temperatura ambiente por algumas horas ou durante a noite. O ágar curado deve ser firme ao toque e resistir ao desmoronamento quando os pedaços são cortados.

Depois que o ágar estiver curado, use uma placa de cortiça de 1,5 centímetro para fazer um orifício central no gel de ágar em cada placa. Em seguida, preencha os buracos cuidadosamente com pasta de fermento fresco. Para transferir as larvas para a placa de ensaio, faça uma ferramenta simples.

Dobre uma curva na ponta de uma microespátula de plástico e mergulhe a ponta em pasta de fermento para torná-la adesiva às larvas. Agora pegue as larvas do primeiro ínstar individualmente e coloque-as no prato de ágar perto do monte de comida. Para cada grupo experimental, prepare pelo menos cinco placas, cada uma com 10 larvas.

Para garantir uma reprodutibilidade entre as réplicas do ensaio, é fundamental que apenas 10 larvas sejam colocadas em cada placa de ensaio. Certifique-se de verificar cuidadosamente a placa de ensaio para determinar que uma, e apenas uma, larva é transferida cada vez que você entrega uma larva com a ponta da microespátula. Depois que um prato estiver carregado, etiquete-o, cubra-o e coloque-o no escuro com a tampa voltada para cima em temperatura ambiente.

Examine cada placa diariamente até que todas as larvas tenham morrido ou se transformado em pupa. Aqui estão exemplos de placas para uma cepa do tipo selvagem para o segundo dia até o oitavo dia do ensaio. No segundo dia, as larvas são enterradas na comida e não ocorre tunelamento.

A escavação do túnel começa no terceiro dia e atinge o máximo entre os dias cinco e oito, à medida que as larvas param de vagar e se transformam em pupas em seus túneis. Transfira cuidadosamente as pupas com uma agulha de provocação dobrada para um prato de uva e, se desejar, conte quantas pupas envolvem. Observe a formação de pupas e avalie as pupas quanto a anormalidades.

Para obter imagens dos túneis dentro da placa de ensaio, primeiro remova e descarte cuidadosamente todo o alimento fermentado do poço central de cada placa. Em seguida, inunde suavemente cada placa com água da torneira e use um pincel macio para esfregar cuidadosamente quaisquer detritos que tenham sido rastreados na superfície do ágar. Alguns pedaços de ágar podem desmoronar onde a escavação do túnel é mais intensa.

Isso pode ser corrigido mais tarde. Continue a repor a água várias vezes e escove suavemente os detritos até que a placa esteja completamente limpa. Em seguida, enxágue o prato com água deionizada, cubra-o e deixe-o secar em temperatura ambiente durante a noite.

É importante usar um fluxo suave de água e pinceladas suaves para limpar as placas de ágar para que você não quebre ou danifique partes do gel de ágar. No dia seguinte, prepare uma imagem de arquivo tiff da placa usando um fundo preto para mostrar os túneis como linhas brancas brilhantes. Os sistemas de documentação em gel funcionam bem para esta etapa.

Em seguida, quantifique o tunelamento na imagem usando a Imagem J com a ferramenta Oval, defina o gel de ágar até, mas não incluindo, a borda plástica da placa de Petri. Em seguida, aplique um limite automático para produzir uma imagem reversa da placa para que os túneis apareçam como linhas pretas. Para corrigir áreas escuras que não contêm túneis, use o seletor de cores e as ferramentas Pincel para esclarecer essas regiões.

Em seguida, no menu suspenso Analisar, selecione Definir escala e clique para remover a escala. Em seguida, vá para a janela Definir medidas em Analisar e marque Área e Limite ao limite. Agora pressione a tecla Control com a tecla M para obter uma medida da área preta na imagem na unidade de pixels que representa a área encapsulada.

Para quantificar a escavação de túneis perdida por erosão de ágar ao redor do orifício central, desmarque Limitar ao limiar. Use a ferramenta Varinha para definir o furo central e pressione Control mais M para medir seu valor em pixels. Subtraia desse valor o valor de pixel de um furo de 1,5 centímetro de diâmetro.

Adicione a diferença ao valor de pixel obtido anteriormente para fornecer o valor total de pixel de tunelamento. Para as placas em que o ágar em falta se estende para além do anel central de tunelamento, é necessária uma etapa adicional para evitar que a quantificação inclua áreas fora da região central. Use as ferramentas Seletor de cores e Pincel para adicionar uma barra preta, conforme mostrado, para limitar a área quantificada.

O ensaio descrito foi utilizado para investigar potencial hipóxia em larvas com função prejudicada do gene não inflável nas traqueias. O gene foi suprimido RNAi via Gal4 UAS. Foram utilizadas duas linhagens Gal4.

Gal4 sem fôlego, que se expressa através de todo o desenvolvimento em todo o sistema traqueal. Ou cut(ue)Gal4, que se expressa fortemente em uma pequena seção traqueal durante a vida da larva. As larvas de controle continham uma das linhas Gal4, mas nenhum RNAi não inflável.

As larvas com RNAi não inflável cut(ue)Gal4 foram indistinguíveis dos controles ao longo do desenvolvimento em termos de crescimento e comportamento. No entanto, a forte supressão de RNAi não inflável em toda a traqueia com blt-Gal4 resultou em falha na escavação na fase de alimentação e produziu uma alta taxa de mortalidade. Essas larvas também mostraram uma completa ausência de tunelamento durante a fase errante.

Além disso, as larvas experimentais Gal4 sem fôlego eram menores, mais finas e mais lentas do que os controles e permaneceram como larvas por muito tempo depois que todos os outros grupos puparam. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como testar larvas de drosófila para hipóxia tecidual, monitorando até que ponto elas se enterram em seus montes de comida ou fazem um túnel em um substrato macio. A ausência completa de tunelamento é um forte indicador de hipóxia tecidual.