Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos
March 22nd, 2018
Aqui, treinamos os ratos em uma tarefa de aprendizagem associativa para testar a discriminação do odor. Este protocolo permite também para estudos sobre aprendizagem-induzido mudanças estruturais no cérebro.
O objetivo geral desse protocolo de comportamento é treinar ratos para que eles associem um odor a uma recompensa e outro odor a uma punição. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como aprendizado, plasticidade sináptica e discriminação sensorial. A principal vantagem dessa técnica é que, uma vez treinados, os camundongos realizam centenas de tentativas em poucas horas para uma amostragem estatística robusta.
As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de doenças neurodegenerativas, porque a gravidade da disfunção olfativa é preditiva de declínio cognitivo subsequente em humanos. Embora esse método possa fornecer informações sobre o olfato, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como visão ou audição. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas iniciais para configurar a câmara de comportamento e usar o software são difíceis de aprender, devido às diferentes portas de conexão e etapas de treinamento.
Para começar, monte uma câmara de mouse com piso de câmara. Mantenha a caixa de treinamento em uma área de baixo tráfego e mal iluminada para evitar distrações. Em seguida, perfure cada porta de água com um pequeno orifício no topo, para permitir que uma agulha de calibre 18 dispense água dentro da porta.
Encha um frasco de vidro com odor dissolvido em óleo mineral e aperte bem a tampa. Em seguida, conecte uma agulha de calibre 18 ao tubo de silicone. Perfure a tampa do frasco de vidro e conecte a outra extremidade do tubo de silicone à entrada das portas de odor.
Depois disso, coloque cada tubo de silicone em uma válvula de odor. Conecte a linha de vácuo às portas de odor. Conecte duas seringas de 10 mililitros a uma haste de suporte de metal e conecte o tubo às seringas.
Em seguida, conecte o outro lado do tubo a uma agulha de calibre 18. Encaixe a agulha no orifício perfurado da porta de cutucar o nariz na câmara do mouse e conecte a outra extremidade do tubo à válvula de água. Encha as duas seringas de 10 mililitros com água potável para roedores.
Em seguida, conecte um medidor de fluxo de ar à entrada de ar e mantenha o fluxo de ar de três a cinco litros por minuto. Conecte as duas válvulas de água, duas válvulas de odor, duas portas de água, porta de odor e alimentação ao sistema de interface USB. E, por último, conecte a caixa de interface USB à energia.
Em seguida, ajuste a sucção a vácuo para evitar a contaminação cruzada de odores entre os testes e use tubos específicos para odores para conectar os frascos de odor à câmara. Para preparar os ratos para o treinamento, comece a restrição de água em 40 mililitros por quilograma por dia. Pese os camundongos diariamente para garantir que estejam acima de 80% do peso basal e mantenha todos os fatores ambientais constantes durante todo o protocolo, incluindo temperatura, ruído e odores dispersos.
Limpe a gaiola antes que cada mouse seja transferido para ela. Pulverize e limpe a câmara com 70% de etanol para minimizar a distração do odor do rato. Para o treinamento do estágio um, configure a caixa de comportamento com uma porta de água no centro e com todas as portas laterais inacessíveis.
Coloque um rato na câmara e feche-a. Em seguida, comece o programa do estágio um. Considere este estágio como completo quando o mouse atingir 100 tentativas em 60 minutos.
Remova o mouse da câmara após 60 minutos ou 100 tentativas foram concluídas. Para o treinamento do estágio dois, configure este e todos os estágios subsequentes com duas portas de água nas laterais e a porta de odor no meio. Coloque um rato na câmara e feche-a.
Em seguida, comece o programa do estágio dois. Considere este estágio como completo quando um mínimo de 40 tentativas são realizadas em 60 minutos, com pelo menos 25% das recompensas de água recebidas dentro de cinco segundos após a cutucada no nariz da porta central. Remova o mouse assim que esta etapa for concluída.
Para o treinamento do estágio três, conecte o odor S-plus ao controlador de entrega de odor. Coloque um rato na câmara e feche-a. Depois, comece o programa do estágio três.
Considere este estágio como completo quando houver mais de 60 recompensas em 60 minutos e remova o mouse assim que o estágio tiver competido. Para o treinamento do estágio quatro-A, defina a configuração da caixa da mesma forma que o estágio anterior três. Em seguida, conecte o odor S-plus e S-minus ao controlador de entrega de odor.
Coloque um rato na câmara e feche-a. Em seguida, comece o programa de estágio quatro-A. Depois que o mouse completar 40 tentativas, alterne o programa para fornecer os odores aleatoriamente.
Remova o mouse assim que o estágio for concluído. Para o treinamento do estágio quatro-B, torne este estágio idêntico ao estágio quatro-A. No entanto, a punição de tempo limite por tentar uma recompensa de água após um odor S-menos é de quatro segundos.
Conecte o odor S-plus e S-minus ao controlador de entrega de odor. Coloque um mouse na câmara. Feche a câmara do mouse e inicie o programa do estágio quatro-B.
Considere este estágio completo quando houver mais de 100 tentativas em 60 minutos, com precisão superior a 85%Para o ensaio go/no-go, defina a configuração da caixa da mesma forma que o estágio anterior quatro-B. Conecte o odor S-plus e S-minus ao controlador de entrega de odor. Em seguida, coloque um rato na câmara.
Comece o programa stage go/no-go e, em seguida, exponha o camundongo que aprendeu a tarefa de aprendizado olfativo a novos pares de odores quimicamente semelhantes. Uma vez que os camundongos tenham aprendido a tarefa de aprendizado olfativo, eles podem associar novos pares de odores com recompensa e punição. Esses mouses treinados normalmente começam com cerca de 50% de precisão na tarefa go/no-go.
A porcentagem correta pode ser plotada por bloco de teste como uma curva de aprendizado para novos pares de odores. Em 10 tentativas de bloco, os camundongos são capazes de discriminar corretamente entre os odores, com mais de 85% de precisão. Isso mostra que nosso protocolo treinou com sucesso camundongos do tipo selvagem para associar um odor a uma recompensa de água e outro a uma punição de castigo.
Uma vez que os ratos aprendem a tarefa, os pares de odores podem ser modificados para aumentar ou diminuir a dificuldade da tarefa. Por exemplo, diminuir a concentração do par de odores aumenta a dificuldade da tarefa. Os ratos também são capazes de se lembrar de pares de odores aprendidos anteriormente.
Depois de esperar sete dias desde que aprendeu a tarefa, um teste de recordação mostra que os ratos do tipo selvagem podem se lembrar rapidamente de associações de odor aprendidas anteriormente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de garantir que os odores desejados estejam conectados corretamente à caixa de comportamento. É especialmente importante se vários experimentadores estiverem usando odores diferentes.
Seguindo este procedimento, outros métodos, como mapeamento de odores, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais como: Como o aprendizado influencia a forma como a informação sensorial é representada pelo cérebro? Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem mudanças neurais induzidas pelo aprendizado no sistema olfativo de camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como ensinar os ratos a associar um odor a uma recompensa e outro odor a uma punição.
Não se esqueça de que trabalhar com agulhas afiadas pode ser extremamente perigoso, e precauções como o descarte adequado de perfurocortantes devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.
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Visão geral
Este estudo investiga a discriminação de odores usando uma tarefa de aprendizagem associativa em camundongos, focando em mudanças estruturais induzidas pela aprendizagem no cérebro. A técnica examina questões-chave da neurociência, como discriminação sensorial e plasticidade sináptica.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Neurociência
- Olfato
- Aprendizagem comportamental
Fundo
- Protocolos de aprendizagem associativa são fundamentais no estudo de funções cognitivas.
- A discriminação de odores desempenha um papel crucial no processamento sensorial dos mamíferos.
- Compreender o comportamento olfativo em camundongos pode estar relacionado ao declínio cognitivo humano.
- Este método pode ser adaptado para outros sistemas sensoriais, como visão e audição.
Propósito do estudo
- Treinar camundongos para associar odores com recompensas e punições.
- Explorar o processamento olfativo e suas implicações para doenças neurodegenerativas.
- Desenvolver um ensaio comportamental robusto para análise estatística da aprendizagem.
Métodos utilizados
- Os camundongos são treinados usando uma câmara comportamental especialmente configurada.
- O treinamento envolve várias etapas, avaliando a precisão na discriminação de odores.
- Nenhum fluxo de trabalho multiomics mencionado.
- Etapas críticas incluem restrição de água para gerenciar motivação e critérios de conclusão da etapa.
- Os procedimentos incluem configuração meticulosa de sistemas de entrega de odores e protocolos de condicionamento.
Principais resultados
- Os camundongos aprendem com sucesso a associar diferentes odores com recompensas ou punições.
- O treinamento permite alta amostragem estatística através de ensaios repetidos.
- A precisão na discriminação de odores aproxima-se de 85% após o treinamento.
- Os resultados sugerem que a aprendizagem olfativa pode ser avaliada efetivamente através deste protocolo.
Conclusões
- O protocolo demonstra um método confiável para estudar a aprendizagem associativa na olfação.
- Esta abordagem pode oferecer insights para estratégias terapêuticas para doenças neurodegenerativas.
- As descobertas aumentam a compreensão dos mecanismos de discriminação sensorial em mamíferos.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput, quantitative assessment of olfactory learning and discrimination in mice, providing a robust behavioral readout for target validation in neuroscience drug discovery. By supporting mechanistic de-risking of olfactory circuit function and plasticity, it informs early-stage hypothesis testing for compounds targeting neurodegenerative or sensory processing disorders. The assay’s reproducibility and scalability facilitate cross-functional alignment between discovery biology and translational research teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to olfactory learning, synaptic plasticity, and sensory discrimination mechanisms.
- Operational Value: Supports biological de-risking by quantifying odor association learning and memory retention in a controlled, reproducible system.
- Predictive Value: Generates quantitative behavioral data (e.g., accuracy rates, learning curves) that aid in portfolio triage and go/no-go decisions for CNS-targeted compounds.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems (trained mice) capable of hundreds of automated trials daily, enabling reliable compound evaluation.
- Standardization: Ensures reproducibility through strict environmental controls, water restriction protocols, and stage-based training criteria.
- Scalability: Facilitates high statistical sampling and longitudinal studies, supporting assay adaptation for dose-response or time-course screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with human olfactory dysfunction as a predictive biomarker of cognitive decline, supporting translational continuity from mouse models to clinical risk assessment.
- Mechanistic De-risking: Enables study of activity-dependent neuronal survival and plasticity, linking behavior to downstream biochemical, electrophysiological, or imaging readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions on compound effects on learning-induced neural changes, reducing late-stage biological risk in sensory or neurodegenerative programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical validation, particularly for projects focused on olfactory processing, sensory discrimination, or neurodegenerative disease mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring how odor learning alters neural structure and function.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs (trial accuracy, learning curves) that enable comparison across experimental conditions or genetic models.
- Analytics: Provides statistical learning curves and discrimination thresholds that help teams assess compound effects on sensory processing and memory.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through alignment with human olfactory biomarkers predictive of cognitive decline.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable behavioral platform for iterative testing across multiple compounds, genotypes, or environmental manipulations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in olfactory learning and plasticity pathways.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through automated trial performance and strict procedural controls.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS targets and reducing failure risk in later stages.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on learning, memory, and sensory discrimination.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral neuroscience, olfactory system anatomy, and operant conditioning techniques.
- Depends on specialized instrumentation including odor delivery systems, water valves, vacuum lines, and USB interface controllers.
- Necessitates cross-team standardization of environmental controls (odor, noise, temperature) and training protocols to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when transferring protocols across mouse strains, ages, or odorant physicochemical properties.
- Includes practical limitations such as setup complexity, needle hazards, and the need for consistent animal handling to avoid distraction or stress confounds.
