Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos
22 de março de 2018
Aqui, treinamos os ratos em uma tarefa de aprendizagem associativa para testar a discriminação do odor. Este protocolo permite também para estudos sobre aprendizagem-induzido mudanças estruturais no cérebro.
O objetivo geral desse protocolo de comportamento é treinar ratos para que eles associem um odor a uma recompensa e outro odor a uma punição. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como aprendizado, plasticidade sináptica e discriminação sensorial. A principal vantagem dessa técnica é que, uma vez treinados, os camundongos realizam centenas de tentativas em poucas horas para uma amostragem estatística robusta.
As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de doenças neurodegenerativas, porque a gravidade da disfunção olfativa é preditiva de declínio cognitivo subsequente em humanos. Embora esse método possa fornecer informações sobre o olfato, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como visão ou audição. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas iniciais para configurar a câmara de comportamento e usar o software são difíceis de aprender, devido às diferentes portas de conexão e etapas de treinamento.
Para começar, monte uma câmara de mouse com piso de câmara. Mantenha a caixa de treinamento em uma área de baixo tráfego e mal iluminada para evitar distrações. Em seguida, perfure cada porta de água com um pequeno orifício no topo, para permitir que uma agulha de calibre 18 dispense água dentro da porta.
Encha um frasco de vidro com odor dissolvido em óleo mineral e aperte bem a tampa. Em seguida, conecte uma agulha de calibre 18 ao tubo de silicone. Perfure a tampa do frasco de vidro e conecte a outra extremidade do tubo de silicone à entrada das portas de odor.
Depois disso, coloque cada tubo de silicone em uma válvula de odor. Conecte a linha de vácuo às portas de odor. Conecte duas seringas de 10 mililitros a uma haste de suporte de metal e conecte o tubo às seringas.
Em seguida, conecte o outro lado do tubo a uma agulha de calibre 18. Encaixe a agulha no orifício perfurado da porta de cutucar o nariz na câmara do mouse e conecte a outra extremidade do tubo à válvula de água. Encha as duas seringas de 10 mililitros com água potável para roedores.
Em seguida, conecte um medidor de fluxo de ar à entrada de ar e mantenha o fluxo de ar de três a cinco litros por minuto. Conecte as duas válvulas de água, duas válvulas de odor, duas portas de água, porta de odor e alimentação ao sistema de interface USB. E, por último, conecte a caixa de interface USB à energia.
Em seguida, ajuste a sucção a vácuo para evitar a contaminação cruzada de odores entre os testes e use tubos específicos para odores para conectar os frascos de odor à câmara. Para preparar os ratos para o treinamento, comece a restrição de água em 40 mililitros por quilograma por dia. Pese os camundongos diariamente para garantir que estejam acima de 80% do peso basal e mantenha todos os fatores ambientais constantes durante todo o protocolo, incluindo temperatura, ruído e odores dispersos.
Limpe a gaiola antes que cada mouse seja transferido para ela. Pulverize e limpe a câmara com 70% de etanol para minimizar a distração do odor do rato. Para o treinamento do estágio um, configure a caixa de comportamento com uma porta de água no centro e com todas as portas laterais inacessíveis.
Coloque um rato na câmara e feche-a. Em seguida, comece o programa do estágio um. Considere este estágio como completo quando o mouse atingir 100 tentativas em 60 minutos.
Remova o mouse da câmara após 60 minutos ou 100 tentativas foram concluídas. Para o treinamento do estágio dois, configure este e todos os estágios subsequentes com duas portas de água nas laterais e a porta de odor no meio. Coloque um rato na câmara e feche-a.
Em seguida, comece o programa do estágio dois. Considere este estágio como completo quando um mínimo de 40 tentativas são realizadas em 60 minutos, com pelo menos 25% das recompensas de água recebidas dentro de cinco segundos após a cutucada no nariz da porta central. Remova o mouse assim que esta etapa for concluída.
Para o treinamento do estágio três, conecte o odor S-plus ao controlador de entrega de odor. Coloque um rato na câmara e feche-a. Depois, comece o programa do estágio três.
Considere este estágio como completo quando houver mais de 60 recompensas em 60 minutos e remova o mouse assim que o estágio tiver competido. Para o treinamento do estágio quatro-A, defina a configuração da caixa da mesma forma que o estágio anterior três. Em seguida, conecte o odor S-plus e S-minus ao controlador de entrega de odor.
Coloque um rato na câmara e feche-a. Em seguida, comece o programa de estágio quatro-A. Depois que o mouse completar 40 tentativas, alterne o programa para fornecer os odores aleatoriamente.
Remova o mouse assim que o estágio for concluído. Para o treinamento do estágio quatro-B, torne este estágio idêntico ao estágio quatro-A. No entanto, a punição de tempo limite por tentar uma recompensa de água após um odor S-menos é de quatro segundos.
Conecte o odor S-plus e S-minus ao controlador de entrega de odor. Coloque um mouse na câmara. Feche a câmara do mouse e inicie o programa do estágio quatro-B.
Considere este estágio completo quando houver mais de 100 tentativas em 60 minutos, com precisão superior a 85%Para o ensaio go/no-go, defina a configuração da caixa da mesma forma que o estágio anterior quatro-B. Conecte o odor S-plus e S-minus ao controlador de entrega de odor. Em seguida, coloque um rato na câmara.
Comece o programa stage go/no-go e, em seguida, exponha o camundongo que aprendeu a tarefa de aprendizado olfativo a novos pares de odores quimicamente semelhantes. Uma vez que os camundongos tenham aprendido a tarefa de aprendizado olfativo, eles podem associar novos pares de odores com recompensa e punição. Esses mouses treinados normalmente começam com cerca de 50% de precisão na tarefa go/no-go.
A porcentagem correta pode ser plotada por bloco de teste como uma curva de aprendizado para novos pares de odores. Em 10 tentativas de bloco, os camundongos são capazes de discriminar corretamente entre os odores, com mais de 85% de precisão. Isso mostra que nosso protocolo treinou com sucesso camundongos do tipo selvagem para associar um odor a uma recompensa de água e outro a uma punição de castigo.
Uma vez que os ratos aprendem a tarefa, os pares de odores podem ser modificados para aumentar ou diminuir a dificuldade da tarefa. Por exemplo, diminuir a concentração do par de odores aumenta a dificuldade da tarefa. Os ratos também são capazes de se lembrar de pares de odores aprendidos anteriormente.
Depois de esperar sete dias desde que aprendeu a tarefa, um teste de recordação mostra que os ratos do tipo selvagem podem se lembrar rapidamente de associações de odor aprendidas anteriormente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de garantir que os odores desejados estejam conectados corretamente à caixa de comportamento. É especialmente importante se vários experimentadores estiverem usando odores diferentes.
Seguindo este procedimento, outros métodos, como mapeamento de odores, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais como: Como o aprendizado influencia a forma como a informação sensorial é representada pelo cérebro? Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem mudanças neurais induzidas pelo aprendizado no sistema olfativo de camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como ensinar os ratos a associar um odor a uma recompensa e outro odor a uma punição.
Não se esqueça de que trabalhar com agulhas afiadas pode ser extremamente perigoso, e precauções como o descarte adequado de perfurocortantes devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.
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Visão Geral
Este estudo investiga a discriminação de odores utilizando uma tarefa de aprendizado associativo em camundongos, com foco em alterações estruturais induzidas pelo aprendizado no cérebro. A técnica examina questões-chave da neurociência, como discriminação sensorial e plasticidade sináptica.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Olfato
- Aprendizado comportamental
Antecedentes
- Protocolos de aprendizado associativo são fundamentais no estudo das funções cognitivas.
- A discriminação de odores desempenha um papel crucial no processamento sensorial de mamíferos.
- Compreender o comportamento olfativo em camundongos pode estar relacionado à deterioração cognitiva humana.
- Este método pode ser adaptado para outros sistemas sensoriais, como a visão e a audição.
Objetivo do Estudo
- Treinar camundongos para associar odores a recompensas e punições.
- Explorar o processamento olfativo e suas implicações para doenças neurodegenerativas.
- Desenvolver um ensaio comportamental robusto para análise estatística da aprendizagem.
Métodos Utilizados
- Os camundongos são treinados usando uma câmara comportamental especialmente configurada.
- O treinamento envolve várias etapas, avaliando a precisão na discriminação de odores.
- Nenhum fluxo de trabalho de multiômica mencionado.
- As etapas críticas incluem a restrição de água para controlar a motivação e os critérios de conclusão de cada etapa.
- Os procedimentos incluem a configuração minuciosa dos sistemas de entrega de odor e dos protocolos de condicionamento.
Resultados Principais
- Os camundongos aprendem com sucesso a associar diferentes odores a recompensas ou punições.
- O treinamento permite uma alta amostragem estatística por meio de ensaios repetidos.
- A precisão na discriminação de odores atinge cerca de 85% após o treinamento.
- Os resultados sugerem que a aprendizagem olfativa pode ser efetivamente avaliada por meio deste protocolo.
Conclusões
- O protocolo demonstra um método confiável para estudar a aprendizagem associativa na olfação.
- Essa abordagem pode oferecer insights sobre estratégias terapêuticas para doenças neurodegenerativas.
- Os achados aprimoram a compreensão dos mecanismos de discriminação sensorial em mamíferos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a avaliação quantitativa e de alto rendimento da aprendizagem olfativa e da discriminação em camundongos, fornecendo uma leitura comportamental robusta para a validação de alvos na descoberta de fármacos em neurociência. Ao apoiar a redução de riscos mecanicistas da função e plasticidade dos circuitos olfativos, ele orienta testes de hipóteses em estágios iniciais para compostos direcionados a distúrbios neurodegenerativos ou de processamento sensorial. A reprodutibilidade e escalabilidade do ensaio facilitam o alinhamento entre equipes de biologia de descoberta e pesquisa translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar hipóteses terapêuticas relacionadas ao aprendizado olfativo, plasticidade sináptica e mecanismos de discriminação sensorial.
- Valor Operacional: Apoia a desconsideração de riscos biológicos ao quantificar o aprendizado por associação a odores e a retenção de memória em um sistema controlado e reproduzível.
- Valor Preditivo: Gera dados comportamentais quantitativos (por exemplo, taxas de acurácia, curvas de aprendizado) que auxiliam na triagem de portfólios e decisões de avançar/não avançar para compostos direcionados ao SNC.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Produz sistemas biológicos validados (camundongos treinados) capazes de centenas de ensaios automatizados diariamente, permitindo avaliação confiável de compostos.
- Padronização: Garante reprodutibilidade por meio de controles ambientais rigorosos, protocolos de restrição hídrica e critérios de treinamento baseados em estágios.
- Escalabilidade: Facilita amostragem estatística elevada e estudos longitudinais, apoiando a adaptação do ensaio para triagem de resposta à dose ou em função do tempo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Alinha-se à disfunção olfativa humana como biomarcador preditivo de declínio cognitivo, apoiando a continuidade translacional de modelos em camundongos para avaliação clínica de risco.
- Redução Mecanística de Riscos: Permite o estudo da sobrevivência neuronal e plasticidade dependentes de atividade, conectando o comportamento a desfechos bioquímicos, eletrofisiológicos ou de imagem.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões sobre os efeitos de compostos em alterações neurais induzidas pelo aprendizado, reduzindo riscos biológicos em fases tardias de programas sensoriais ou neurodegenerativos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a validação pré-clínica, especialmente para projetos focados no processamento olfativo, na discriminação sensorial ou nos mecanismos de doenças neurodegenerativas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao medir como a aprendizagem olfativa altera a estrutura e a função neurais.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis (precisão dos ensaios, curvas de aprendizagem) que permitem comparações entre condições experimentais ou modelos genéticos.
- Análises: Oferece curvas de aprendizagem estatísticas e limiares de discriminação que ajudam as equipes a avaliar os efeitos de compostos no processamento sensorial e na memória.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica por meio da associação com biomarcadores olfativos humanos preditivos de declínio cognitivo.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma comportamental reutilizável para testes iterativos com múltiplos compostos, genótipos ou manipulações ambientais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de aprendizado e plasticidade olfativa.
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio da realização automatizada de ensaios e controles procedimentais rigorosos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a redução precoce de riscos em alvos do sistema nervoso central e diminuir o risco de falha em estágios posteriores.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos com base em seus efeitos sobre aprendizado, memória e discriminação sensorial.
Considerações sobre a Implementação
- Exige especialização em neurociência comportamental, anatomia do sistema olfativo e técnicas de condicionamento operante.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo sistemas de entrega de odor, válvulas de água, linhas de vácuo e controladores de interface USB.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao controle ambiental (odor, ruído, temperatura) e protocolos de treinamento para garantir a reprodutibilidade.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir protocolos entre linhagens de camundongos, idades ou propriedades físico-químicas dos odorizantes.
- Inclui limitações práticas, como a complexidade da montagem, riscos com agulhas e a necessidade de manejo consistente dos animais para evitar distrações ou confundimentos por estresse.
