Name: Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Aprenda o método de transplante de ilhotas pancreáticas para o omento em camundongos diabéticos usando hidrogel. Esta técnica avança pesquisas em terapia celular para diabetes tipo I.

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Alguns dos autores deste trabalho foram apoiados em parte por concessões do nacional chave R & D programa de China (2017YFC1103704), projeto de Sanming de medicina em Shenzhen (SZSM201412020), fundo para alto nível médico disciplina construção de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Fundação de ciência e tecnologia (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Fundação de Shenzhen, da saúde e da Comissão de planejamento familiar (SZXJ2017021).

Todos os mouses utilizados neste estudo foram obtidos a partir da centro médico Animal de Guangdong província. A utilização de animais foi aprovada pelo Hospital de ética revisão Comissão de Shenzhen segundo do povo, em conformidade com os princípios de bem-estar animal.
1. ilhéu transplante para o omento
Nota: Este protocolo requer 2 pessoas realizar.
<ol><li>Monte o material cirúrgico, que está listado na tabela 1. Preparar o campo asséptico na área cirúrgica com materiais estéreis, como cortinas e descartáveis e manter condições assépticas durante cirurgia. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos. Use vestidos estéril.</li>
	<li>Escolha os ilhéus usando uma ponta de pipeta 200 µ l sob o microscópio. Cada rato receberá 450-500 ilhéu equivalente (IEQ) por transplante. Para cada animal, coloque bastante Ilhéus para um único transplante em um tubo de pressão-top estéril 1,5 mL com 100 µ l de meio CMRL-1066. Nota: Ilhéus podem ser isoladas no dia do transplante, mas é melhor para isolá-los um dia antes para permitir a recuperação para o processo de isolamento.</li>
	<li>Manter os tubos de pressão-top com ilhotas no gelo até que esteja pronto para o transplante.</li>
	<li>Descongelar o hidrogel de matriz da membrana basal e mantê-lo no gelo depois de removê-lo do congelador a-20 ° C. O hidrogel é líquido a 4 ° C a 10 ° C e solidifica a temperaturas mais altas.</li>
	<li>Pesar e etiquetar todos os mouses destinatários diabéticos. 60 mg/kg pentobarbital de sódio injete intraperitonealmente. Teste a profundidade da anestesia através da administração de uma pitada de dedo do pé. Dar um adicional de 10 mg/kg pentobarbital de sódio, se o animal reage para o aperto. Se não houver nenhum retirar o reflexo, o nível da anestesia é correto para a cirurgia.</li>
	<li>Esfregue o local cirúrgico no abdômen usando etanol a 70%. Raspar o cabelo do site com uma lâmina de razer e desinfetar a área com Iodofor. Administre o vet pomada para os olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.</li>
	<li>Utilizar a tesoura oftalmológica para abrir o abdômen ao longo da linha média do abdômen com uma incisão de 4 a 5 cm. movimento dos intestinos para o lado esquerdo e cobrir com gaze embebida salina para prevenir a desidratação excessiva durante o procedimento de cirurgia.</li>
	<li>Use cotonetes de algodão totalmente expor o campo visual do estômago e localize o omento (localizado abaixo do estômago). Use dois pares de pinças bem para distender o omento. Tome cuidado para evitar danos de destruírem.</li>
	<li>O hidrogel é completamente descongelado neste ponto. Girar o tubo com os ilhéus por 30 s em 200 x g e remover o sobrenadante. Aspirar a 50 µ l de hidrogel, adicioná-lo ao tubo contendo os ilhéus e ressuspender a mistura suavemente, evitando a formação de bolhas. Manter os tubos em gelo durante o procedimento.</li>
	<li>Use dois pares de pinças para pegar as bordas do omento e delicadamente levantá-lo para formar um sulco entre a parede gástrica e intestinos que podem acomodar um pequeno volume de líquido com o enxerto de ilhéu.</li>
	<li>Deixe a segunda pessoa ajudar no procedimento e aspirar a mistura de ressuspensão ilhéu-hidrogel (todo o conteúdo do tubo) com uma ponta de pipeta de 200 µ l, entregar o conteúdo na ranhura.</li>
	<li>Certifique-se de que a mistura está bem posicionada no sulco suavemente, aumentando ou diminuindo as bordas do omento. Completa de posicionamento da mistura dentro de 3 min antes o hidrogel se solidifica como um efeito da temperatura do corpo. Depois define o hidrogel, dobre o omento para cobrir o enxerto. Nota: O omento irá aderir à parede gástrica circundante como o hidrogel solidifica.</li>
	<li>Depois que o hidrogel é completamente solidificado, use cotonetes para reposicionar os intestinos volta na cavidade abdominal, tomando cuidado para não tocar o site de transplante.</li>
	<li>Adicionar 20 µ l de cefalosporina (5 ~ 10 mg) na cavidade abdominal, para prevenir a infecção, em seguida, use 4-0 sutura para fechar o abdome.</li>
	<li>Retorne o mouse para sua gaiola e repetir todos os passos para cada destinatário de rato. Manter os ratos quentes e monitorar visualmente até totalmente recobra a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Manter os ratos separado dos outros animais até que eles se recuperaram totalmente.</li>
	<li>Injete 50 µ l de sódio cefazolina (0,05 mg/mL) a cada dia por uma semana como profilaxia pós-operatório. Administrar bupivacaina + buprenorfina, ou seja, aplicar 1-3 gotas de 0.25% bupivacaina no local da incisão topicamente antes da colocação de clipes de ferida. Administrar Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) via via intraperitoneal (IP).</li>
	<li>Medir o nível de glicose no sangue não-jejum de uma amostra de sangue da cauda-veia usando um medidor de glicose de sangue uma vez por dia após o transplante. Ao transplantar para o omento, o enxerto de ilhéu pode ter uma função retardada e não alcançar um nível de glicose no sangue completamente normal para 2-3 semanas.</li>
	<li>Para histologia, remova o enxerto omental do mouse ao final do experimento após o transplante. Fixe o tecido de acordo com os protocolos histológicos. O enxerto pode ser analisado para estudos de imunocoloração ou imunofluorescência.</li>
</ol>2. título subsidiário para transplante para o omento
Nota: Um hidrogel de fibrina-trombina alternativo que é usado em temperatura ambiente pode ser substituído para o hidrogel de matriz de membrana basal. Consiste em 2 componentes, uma solução de proteína de selante de fibrina (50 U/mL trombina e fibrinogênio de 10 mg/mL). Quando os componentes são misturados, formam um coágulo que prende as ilhotas no lugar.
<ol><li>Use o hidrogel de fibrina-thombin composto à temperatura ambiente. Como na etapa 1.2, cada rato receberá equivalentes do Ilhéu de 450-500 (IEQ) por transplante. Coloca os ilhéus num tubo estéril 1,5 mL agarrar-parte superior com 100 µ l de meio CMRL-1066. Imediatamente antes do transplante, Aspire os ilhéus para um tubo estéril de PE50 para um comprimento de 10 cm e centrifugar suavemente (30 s a 200 x g) para formar uma bola solta.</li>
	<li>Prepare o animal como acima referido (etapas 1.5-1.8) com o omento espalhar-se. Misturar os componentes de hidrogel (10 µ l/cada) e coloque sobre o omento. (Figura 3D)</li>
	<li>Imediatamente expulse os ilhéus da tubagem para o hidrogel. O hidrogel forma um coágulo em torno dos ilhéus. (Figura 3E)</li>
	<li>Dobre o omento o hidrogel e ilhotas para formar uma bolsa. (Figura 3F) Continue com passos 1.13 para 1.18.</li>
</ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+research+and+clinical+practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).</li>
<li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+Induction+Immunotherapy+Promotes+Long-Term+Insulin+Independence+After+Islet+Transplantation+in+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes.</a> American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).</li>
<li>Moberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue+factor+by+pancreatic+islet+cells+as+a+trigger+of+detrimental+thrombotic+reactions+in+clinical+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+lancet%22%5BJournal%5D)">Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation.</a> The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).</li>
<li>Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction+to+improve+islets+of+Langerhans+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).</li>
<li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients%2C+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li>
<li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%3A+recent+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+metabolic+syndrome+and+obesity%3A+targets+and+therapy%22%5BJournal%5D)">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211(2014).</li>
<li>Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27834384">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li>
<li>Cantarelli, E., Piemonti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+transplantation+sites+for+pancreatic+islet+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts.</a> Current diabetes reports. 11 (5), 364(2011).</li>
<li>Cantarelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+animal+models+for+preclinical+islet+transplantation%3A+no+model+fits+all+%28research+purposes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes).</a> Islets. 5 (2), 79-86 (2013).</li>
<li>Beli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum+to%3A+CX3CR1+deficiency+accelerates+the+development+of+retinopathy+in+a+rodent+model+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes.</a> J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).</li>
<li>Hafner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Patterns+of+Retinal+Oxygen+Saturation+and+Microvascular+Hemodynamic+Parameters+Preceding+Retinopathy+in+Patients+With+Type+II+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).</li>
<li>Schmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islets+find+a+new+transplant+home+in+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 82017(2017).</li>
<li>Voigt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+Progression+Rate+of+Diabetic+Retinopathy+in+Type+2+Diabetes+Patients+in+Correlation+with+the+Duration+of+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).</li>
<li>Baidal, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+of+an+Intraabdominal+Endocrine+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas.</a> New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).</li>
<li>Espes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+restoration+of+vascularity+and+oxygenation+in+mouse+and+human+islets+transplanted+to+omentum+may+contribute+to+their+superior+function+compared+to+intraportally+transplanted+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets.</a> American Journal of Transplantation. , (2016).</li>
<li>Berman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+the+endocrine+pancreas%3A+intraomental+islet+transplantation+within+a+biologic+resorbable+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold.</a> Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).</li>
<li>Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28109023">Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment.</a> Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).</li>
<li>Espes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+restoration+of+vascularity+and+oxygenation+in+mouse+and+human+islets+transplanted+to+omentum+may+contribute+to+their+superior+function+compared+to+intraportally+transplanted+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets.</a> American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).</li>
<li>Hajizadeh-Saffar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+VEGF+expression+by+human+embryonic+stem+cell-derived+mesenchymal+stromal+cells+reduces+the+minimal+islet+mass+required+to+reverse+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
</ol>

Os autores relatam que não há conflitos de interesse.

Transplante de ilhotas no fígado através da veia portal é o método mais usado de transplante de ilhotas em seres humanos, mas ainda existem preocupações de segurança e eficiência como a veia porta-trombose e fígado esteatose17. Estudos recentes mostram que o omento pode ser uma alternativa adequada para o fígado, mas mais pesquisa precisa ser realizada antes da tradução clínica12,14,18,<sup cla...

De acordo com a Federação Internacional de Diabetes (IDF), o diabetes mellitus afeta atualmente 382 milhões de pessoas, com um aumento previsto de 592 milhões de pessoas por 20351. Em ambos os transplante alogênico e xenogénica ilhéu, terapia imunossupressora sistêmica é necessária. Sem imunossupressão, imune a rejeição é das principais causas de perda de enxerto2. Há também um problema significativo de perda de ilhéu transplantado devido o sangue instantânea mediada por reação inflamatória (IBMIR)3,4. No entanto, mesmo na ausência de uma resposta imune, tal como em syngeneic ou modelos de autotransplante, células das ilhotas transplantadas para o fígado através da veia porta são perdidas devido à inflamação e/ou a condições ambientais desfavoráveis, tais como sangue pobre fornecer com oxigenação reduzida e/ou nutrientes5,6. Como resultado, para assegurar a função metabólica a longo prazo, os números mais altos da ilha são necessários para compensar a perda de célula inicial que reduz a enxertia7.
Na tentativa de otimizar a enxertia ilhéu, vários sítios anatômicos alternativos têm sido investigados experimentalmente bem como clinicamente, com promissor, ainda não definitiva resulta8. Considerando que alguns dos sites alternativos oferecem acesso fácil e seguro (ex., pele, cápsula renal, submucosa gástrica e câmara anterior do olho) ou uma superfície mais ampla para maiores massas ilhéu (EG., cavidade peritoneal), sobrevivência e fisiológica performance metabólica dos ilhéus transplantados ainda são limitado e permanecem uma preocupação9. A busca de um local mais apropriado para enxertia Ilhéu está em curso.
O omento estava entre os muitos sites anatômicos que foram investigados no desenvolvimento precoce do transplante de ilhotas e provou ser um ambiente bem sucedido para Ilhéus10,11,12,13, 14. No entanto, infusão intraportal ilhota tornou-se o clínico escolha devido em parte para a relativa simplicidade do procedimento e6modelos de sucesso precoce no animal. Também, em parte, os negativos associados com este site, particularmente maciça perda precoce do Ilhéu, eram menos compreendido e menos a restrição nos primeiros dias do transplante de ilhotas experimental como o campo amadureceu. Com as mais recentes evidências indicando que a infusão intravascular Ilhéu está longe do ideal, o omento é re-emergente como um local potencialmente valioso para transplante de células.
O omento (sob a forma de uma bolsa omental) oferece vantagens relativas sobre o fígado15,16. É facilmente acessível e bem vascularizado. Permite a recuperação do enxerto (se necessário) e/ou biópsia. O período isquêmico vivido por Ilhéus é reduzido em comparação com o fígado, e o omento pode aceitar relativamente massas ilhéu grande, que não é possível intraportally, onde um aumento da pressão portal podem causar complicações.
Um modelo de mouse syngeneic de transplante foi usado no protocolo testado no estudo, empregando camundongos C57BL/6 do sexo masculino entre 6-8 semanas de idade com um peso corporal de 20 – 25 destinatários do Ilhéu de g. foram renderizados diabéticos com uma única injeção de estreptozotocina com uma dose de 250 mg/kg ip. A indução do diabetes pode ser considerada bem sucedida se o nível de glicose do sangue do rato é maior que 24 mmol/L 48 h após a injeção e permanece acima desse nível por um período mínimo de 5 dias.
Syngeneic ilhéus foram isoladas a partir do pâncreas de doadores de idade-combinadas seguindo métodos publicados anteriormente, com algumas modificações. Em breve, a colagenase foi injetado a vesícula em vez do ducto biliar. Isso foi feito como uma melhoria para facilitar a facilidade de injeção. Infusão de colagenase foi seguido de incubação, rompimento de tecido, separação de gradiente de densidade e de mão-colheita para obter puras ilhotas. Ilhéus foram cultivados durante a noite em CMRL-1066 suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) em balões T175 a 37 ° C, abaixo dos 95% ar - 5% CO2 antes do transplante.

<table><tbody><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 polegadas (12-13 cm) Tesoura</td><td>RWD Ciências da Vida&nbsp;</td><td>S12030-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>RWD Life Science</td><td>F11010-13</td><td></td></tr><tr><td>Pequenos clipes para feridas</td><td>RWD Life Science</td><td>R33003-01</td><td></td></tr><tr><td>Acutenáculo</td><td>RWD Life Science</td><td>F31044-13</td><td></td></tr><tr><td>2 pares de pinças de tecido</td><td>RWD Life Science</td><td>&nbsp; F13023-10</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Sutura com agulha</td><td>Chenghe, China</td><td>17094</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipeta e pontas</td><td>Gilson</td><td>PN11</td><td></td></tr><tr><td>One Touch ultraeasy Sistema básico de monitoramento de glicose no sangue&nbsp; &nbsp;</td><td>Johnson & Lâmina</td><td>de</td> barbear 33391713 <td></td>Johnson</tr><tr><td></td><td>Philips</td><td>HC1099/15</td><td></td></tr><tr><td><forte>Material e animais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sódico</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>P3761</td><td>Para anestesia&nbsp;</td></tr><tr><td>Hidrogel&nbsp;</td><td>bdbiosciences.com</td><td>356234</td><td>Matriz de Membrana Basement</td></tr><tr><td>Fibrina-Trombina Hidrogel&nbsp;</td><td>Baxter.com</td><td>1501250</td><td>Os componentes coagulam quando misturados</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Yingniu medical, Anhui, China</td><td>23170608</td><td></td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>Lierkang medical technology, Shangdong, China</td><td>170521</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina normal</td><td>Baxter.com</td><td>2B1324</td><td></td></tr><tr><td>Cefalosporina</td><td>Lukang medical, Shangdong, China</td><td>150303</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>Baxter.com</td><td>2G3508</td><td></td></tr><tr><td>pomada lubrificante para os olhos</td><td>Major Pharmaceuticals</td><td>203964</td><td></td></tr><tr><td>estreptozotocina</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>colagenase Tipo V</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>C9262</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>media celltrans, Wenzhou, China</td><td>X018D1</td><td></td></tr><tr><td>histopaco</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>10771</td><td>gradiente de densidade</td></tr><tr><td>Tubulação PE50</td><td>Braintreesci.com</td><td>PE50 100 FT</td><td>Polietileno .023" x .038</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>C1359</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>composto de temperatura de corte ideal (OCT)</td><td>Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL</td><td>4583</td><td>incorporando</td></tr><tr><td>meio insulina anticorpo</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular, Danvers, MA 01923</td><td>8138S</td><td></td></tr><tr><td>meio de coloração de hematoxilina</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular, Danvers, MA 01923</td><td>14166S</td><td></td></tr><tr><td>meio de coloração de eosina</td><td>Beyotime Biotech, China</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl / 6 Camundongos Centro</td><td>de Animais Médicos da Província de Guangdong</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>Soro Fetal</td><td>Bovino GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30084</td><td></td></tr><tr><td>Frascos T175</td><td>Falcon</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubos Snap-top</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr></tbody></table>

um método de transplante de ilhotas para o omento no mouse

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Transplante de ilhotas tem sido proposto para ser um potencial tratamento para o diabetes tipo 1. Recentes evidências indicam que a infusão intravascular Ilhéu está longe do ideal e, portanto, o omento é re-emergente como um local potencialmente valioso para transplante de ilhotas. Esse experimento requer o isolamento de ilhotas de alta qualidade e a implantação dos ilhéus aos destinatários diabéticos. Transplante para o omento requer etapas cirúrgicas que podem ser melhor demonstradas visualmente. Aqui, as etapas detalhadas para este procedimento são apresentadas. Dois métodos de misturar as ilhotas isoladas com hidrogel antes de colocar a mistura dentro da bolsa omental de ratos diabéticos são descritos aqui. Hidrogel diferentes é utilizados para as diferentes condições. Níveis de glicose de destinatários de rato diabético de ilhotas syngeneic no omento foram monitorados por até 35 dias. Alguns animais foram sacrificados após 14 dias para realizar a análise imuno-histoquímico. Esta abordagem pré-clínico de transplante pode ser usada como dados preliminares que antecederam a tradução para transplante clínico.

Post-digestive estado do pâncreas é mostrado na figura 1A. Purificada ilhotas são mostradas na figura 1B. Ditizona manchando e teste de viabilidade dos ilhéus são mostrados na Figura 2. As principais etapas da transplante de ilhotas para o omento são mostradas na Figura 3. Os níveis de glicose do sangue dos destinatários após transplante omental são mostrados na <strong ...

É apresentado um método para o omental transplante de ilhotas em um rato. As ilhotas isoladas são misturadas com hidrogel e a mistura é colocada em bolsa omental de um rato diabético. Então, a glicose no sangue é monitorada, e é realizada a análise imuno-histoquímico.

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de transplante de ilhotas, como o transplante de ilhotas para o omento. As implicações dessa técnica se estendem para a terapia do diabetes tipo I porque o omento é ressurgente como um potencial local de valor para o transplante de ilhotas. A principal vantagem dessa técnica é que as ilhotas isoladas são misturadas com hidrogel e a mistura é colocada na bolsa de omento de camundongo diabético.Comece preparando um campo asséptico na área cirúrgica com material estéril, como cortinas e descartáveis. Coloque os instrumentos cirúrgicos esterilizados no campo asséptico. Escolha as ilhotas do doador sob o microscópio estéreo usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros.Para cada animal, colete de 450 a 500 ilhotas e transfira para um tubo superior estéril de 1,5 mililitro com 100 microlitres de cmrl 10 66 médio. Coloque o tubo no gelo até estar pronto para o transplante. Uma vez que as ilhotas tenham sido colhidas, descongele o hidrogel da matriz de membrana do porão no gelo.Pesar e marcar todos os ratos beneficiários diabéticos. Depois de anestesiar o primeiro rato de acordo com um protocolo institucionalmente aprovado, teste a profundidade da anestesia administrando uma pitada de dedo do dedo do dedo. Se não houver reflexo de abstinência, o nível de anestesia está correto para a cirurgia.Administre a pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia. Cotonete o abdômen com 70% de etanol. Então raspe o cabelo do local da cirurgia.Cubra o animal com uma cortina estéril e desinfete a área com um esfoliante de iodo. Depois de usar uma tesoura oftálmica para criar uma incisão de 4 a 5 centímetros ao longo da linha média do abdômen, mova os intestinos para o lado esquerdo e cubra com gaze salina encharcada para evitar a desidratação durante o procedimento cirúrgico. Em seguida, use cotonetes de algodão para expor totalmente o estômago e localizar o omento abaixo do estômago.Neste ponto, o hidrogel deve ser completamente descongelado. Gire o tubo contendo as ilhotas a 200 vezes g durante 30 segundos. Depois do giro, remova o supernaspe.Em seguida, aspire 50 microliters do hidrogel adicioná-lo ao tubo contendo as ilhotas e misturar suavemente evitando a formação de bolhas. Em seguida, use dois pares de fórceps para pegar as bordas do omento e criá-lo suavemente para formar uma ranhura entre a parede gástrica e os intestinos. Neste ponto da cirurgia, uma segunda pessoa é necessária para aspirar a mistura de hidrogel de ilhotas resuspended com uma ponta de pipeta de 200 microliter e entregá-la no sulco.Certifique-se de que a mistura está bem posicionada na ranhura, levantando suavemente ou baixando as bordas do omento. Complete o posicionamento da mistura dentro de três minutos antes que o hidrogel se solidifique. Depois do hidrogel definir, dobre o omento para cobrir o enxerto.O omento vai aderir à parede gástrica circundante à medida que o hidrogel se solidificar. Quando o hidrogel estiver completamente solidificado, use cotonetes de algodão para reposicionar os intestinos na cavidade abdominal, tomando cuidado para não tocar no local do transplante. Em seguida, dispense 200 microliters de um antibiótico apropriado para a cavidade abdominal para prevenir infecções.Em seguida, use sutura 4 O para fechar o abdômen. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão porque os locais do omento em camundongos são pequenos e cansativos de avaliar. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação aquecida até que ele recupere totalmente a recumbência externa.No dia seguinte e todos os dias depois de uma semana, injete antibiótico como profilaxia pós-cirurgia. Além disso, meça o nível de glicose no sangue não em jejum de uma amostra de sangue da veia da cauda usando um medidor de glicose no sangue uma vez por dia após o transplante. Ao transplantar para o omento, o enxerto de ilhota pode ter uma função atrasada e não atingir um nível de glicemia completamente normal por duas a três semanas.O tecido enxertado foi recuperado do rato eutanizado 14 dias após o transplante. Aqui o enxerto é visível como um aglomerado de núcleos após a coloração da DAPI. A funcionalidade do tecido enxertado é revelada pela coloração de imunofluorescência com anticorpos anti-insulina.A coloração de H&E mostra os tecidos enxertados cercados pelos adipócitos do omento. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar também que o omento do rato é frágil.Após esse procedimento, outros métodos como o utilizado em diferentes escolas secundárias, o desempenho de MB em todos os que responderão a perguntas particulares como a disseminação da ilhota na vascuolização e o desempenho. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores em seu transplante explorarem o tratamento para diabetes tipo I em mais de um trecho. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transplantar as ilhotas para o omento no mouse.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nosso protocolo foi desenvolvido para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de camundongos. Células estão concentradas em pelotas na tubulação final utilizada para o transplante de células sob a cápsula renal. A facilidade desta técnica reduz o estresse nas células e mouse.

Transplante de ilhotas pancreáticas para a cápsula renal de ratos diabéticos

Transplante de ilhotas isoladas foi proposto para ser um potencial tratamento para diabetes tipo 1. Aqui nós descrevemos um método para isolar ilhotas de rato pancreata e transplantá-las para o espaço subcapsular do rim.

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

Este vídeo descreve o protocolo de enxerto de ilhotas pancreáticas humanas na câmara anterior do olho do camundongo para monitorar a revascularização de enxertos de ilhotas humanas in vivo. Também ajuda a entender a contribuição das células receptoras versus doadoras na promoção do encapsulamento e vascularização do enxerto.

Enxertia de ilhotas pancreáticas: um método para implantar ilhotas pancreáticas na câmara anterior do olho do camundongo para imagens in vivo

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para infundir células das ilhotas pancreáticas na veia porta hepática, seguido pela aplicação de espuma de gel para prevenir o sangramento com sucesso. O sangramento pós-operatório é uma causa comum de alta mortalidade durante o transplante de ilhotas.

Modelo Murino de Transplante de Ilhotas: Um Método Cirúrgico para Infundir Ilhotas Pancreáticas na Veia Portal e Prevenção de Sangramento Pós-Operatório

Este protocolo demonstra isolamento de manchas murinas e semeadura em um andaime decelularizado. As ilhotas suportadas em andaimes foram transplantadas para a almofada de gordura epididimática de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). As ilhotas sobreviveram no local do transplante e revertearam a condição hiperglicêmica.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Transplante de ilhotas pancreáticas é uma maneira de conseguir normoglycemia no diabetes tipo 1. Este artigo centra-se na técnica de transplante através da rota intraportal para manter os níveis normais de glicose em ratos diabéticos.

Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse

Aqui, apresentamos um protocolo de validação em vivo de terapia celular baseada em hidrogel, ilustrada pelo exemplo de transplante de ilhotas. h-Omental ilhéu de Matrix (localizador) implantação de enchimento permite a implantação de uma célula-hidrogel mistura entre as camadas omental, perto dos vasos sanguíneos, para maximizar a enxertia em um ambiente apropriado e metabólica.

Transplante de ilhotas intra-Omental usando h-Omental enchimento Matrix ilhéu (hOMING)

Neste protocolo, um método de isolamento e transplante de isto de murina no tecido adiposo branco subcutâneo inguinal é descrito. Ishotas singeneicas isoladas são transplantadas em um receptor de murina usando um hidrogel de membrana do porão. O nível de glicemia dos receptores é monitorado, e a análise de histologia dos enxertos de lumiçal é realizada.

Modelo de transplante de tecido adiposo branco subcutâneo inguinal (ISWAT) de Isletas murina

Este método de transplante de ilhotas cobertas de gordura é adequado para a detecção de ilhotas enxertadas na cavidade intraperitoneal. Notavelmente, não requer o uso de agentes bioligantes ou sutura.

Transplante de ilhotas cobertas de gordura usando tecido adiposo branco epididimal

Aqui apresentamos procedimentos cirúrgicos refinados na realização com sucesso do transplante de ilhotas intraportais, um procedimento cirúrgico clinicamente relevante, mas tecnicamente desafiador, em camundongos.

Minimizando o sangramento da veia do portal pós-infusão durante o transplante de ilhotas intrahápticas em camundongos

Neste protocolo, discutimos a implementação de um modelo de transplante ortotópico de fígado (THO) bem-sucedido em camundongos. Além disso, são discutidos também os adjuvantes para analisar melhor a patência do aloenxerto após o sucesso do TOL em camundongos, especificamente utilizando exames de microtomografia computadorizada (microTC).

Transplante Ortotópico de Fígado em Camundongos Utilizando Angiotomografia Microcomputadorizada

Aprenda o método de transplante de ilhotas pancreáticas para o omento em camundongos diabéticos usando hidrogel. Esta técnica avança pesquisas em terapia celular para diabetes tipo I.

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

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