Protocolos de fabricação (EcoFAB) ecossistema para a construção de ecossistemas de laboratório projetado para estudar interações planta-micróbio

O objetivo geral deste protocolo é definir abordagens padronizadas para a construção de ecossistemas de plantas modelo simplificados, chamados EcoFABs, que permitem experimentos laboratoriais controlados e replicados para investigar interações entre micróbios e plantas que podem ser testadas em campo. Este método pode ser usado para estudar as interações entre micróbios de plantas em ambientes controlados, o que nos permite obter insights mecanicistas detalhados sobre as funções dos microbiomas para nos permitir aproveitá-los para uma agricultura sustentável. Ajudamos a projetar este primeiro Eco-FAB, que emprega uma variedade de tecnologias de impressão 3D disponíveis e esteriliza as câmaras de crescimento de plantas que permitem imagens de alta resolução sem distração e análises químicas.

O dispositivo Eco-FAB desenvolvido aqui é adequado para a análise de interações entre micróbios de plantas porque incorpora análise da morfologia da raiz e imagens espectroscópicas de massa. Após a construção dos moldes Eco-FAB, utilizando impressão 3D de acordo com o protocolo de texto, em um recipiente descartável de um litro, misturar 40 mililitros de base de elastômero de siloxano com diferentes volumes de agente de cura, dependendo do experimento. Coloque o recipiente em uma câmara de vácuo por pelo menos 30 minutos para remover as bolhas de ar da mistura de elastômero.

Em seguida, remova a mistura e despeje-a no molde de plástico impresso em 3D montado. Para gerar uma camada PDMS uniforme, as bolhas de ar devem ser removidas com cuidado. Use ar comprimido para soprar quaisquer resíduos de ar após transferir a mistura para o molde.

Mantenha o molde em um bloco de aquecimento a 85 graus Celsius por quatro horas. Deixe o molde esfriar por cinco minutos. Em seguida, puxe suavemente a pastilha do molde e use uma faca para separar lentamente o PDMS da estrutura de fundição.

Pressione a base do molde com PDMS para fora da estrutura de fundição. Em seguida, use uma faca ou outras ferramentas para separar suavemente a camada PDMS da base do molde nas bordas e retire-a lentamente da superfície do molde. Usando uma agulha romba de calibre 15, crie um canal de entrada nas camadas do PDMS fazendo furos de 1,6 milímetros nessa parte.

Em seguida, use uma tesoura para aparar as bordas das camadas do PDMS. Para unir permanentemente as camadas de PDMS às lâminas do microscópio, use metanol para enxaguar o lado de ligação da camada de PDMS em uma lâmina de microscópio de 7,6 por cinco centímetros e, em seguida, seque-as com ar comprimido ou uma pistola de nitrogênio ultrapuro. Coloque a lâmina do microscópio e a camada PDMS em um limpador de plasma com os lados de colagem voltados para cima.

Feche a câmara e a válvula de ventilação de gás. Em seguida, ligue o aspirador e bombeie a câmara por um minuto. Ligue a energia do gerador de plasma e mude a frequência de rádio, ou nível de RF, para alto por um minuto.

Em seguida, desligue a bomba de vácuo e a energia de plasma e ventile a câmara para a atmosfera. Retire a lâmina do microscópio e a camada PDMS da câmara de plasma e pressione rapidamente todas as quatro bordas da camada PDMS na lâmina com pressão uniforme. Certifique-se de que a região oval central, que é a câmara da raiz, não toque na lâmina.

Usando água ultrapura, enxágue os dispositivos Eco-FAB. Coloque um dispositivo Eco-FAB em um recipiente Eco-FAB e adicione 70% de etanol até que o dispositivo esteja submerso. Em seguida, feche a tampa do recipiente e agite-a suavemente para molhar todas as superfícies internas com etanol, certificando-se de que a câmara de crescimento da raiz do dispositivo Eco-FAB esteja cheia de etanol, com muito poucas ou nenhuma bolha de ar.

Depois de incubar os dispositivos em temperatura ambiente por 30 minutos, despeje o etanol 70% e substitua-o por etanol 100%. Em seguida, incube os dispositivos por cinco minutos. Após a incubação, drene o etanol e deixe o Eco-FAB esterilizado em uma capela de fluxo laminar por 16 horas para secá-lo completamente.

Se disponível, esterilize o sistema ligando a luz ultravioleta no exaustor por uma hora. Para realizar a esterilização e germinação das sementes, mergulhe as sementes em etanol a 70% por dois minutos. Em seguida, com uma pipeta, remova o etanol e use água estéril para enxaguar as sementes três vezes.

Em seguida, mergulhe as sementes em solução de alvejante a 10% por cinco minutos. Em seguida, remova a solução de alvejante e use água estéril para lavar bem as sementes três vezes. Após as lavagens, adicione água estéril às sementes e incube o tubo a quatro graus Celsius por sete dias.

Espalhe uniformemente as sementes em 0,5 Murashige e Skoog, ou meio MS, com 0,6% de vitagel. E com fita micropore, sele as placas. Em seguida, cultive as plantas até um comprimento de raiz de cerca de cinco mililitros.

Para transferir as mudas para Eco-FABs, usando uma seringa ou micropipeta estéril e água estéril, lave a câmara radicular de um dispositivo Eco-FAB três vezes e, em seguida, encha a câmara radicular com o meio de crescimento de interesse, como meio 0,5 MS. Agora, insira cuidadosamente uma única muda no reservatório da planta do dispositivo Eco-FAB. É importante que as mudas sejam transferidas com cuidado da placa para o Eco-FAB para que as raízes não se quebrem.

Adicione três mililitros de água estéril no recipiente, evitando o dispositivo Eco-FAB. Isso aumentará a umidade e reduzirá a evaporação do meio da câmara radicular. Em seguida, feche o recipiente e use fita micropore para selar a tampa.

Coloque o Eco-FAB em uma incubadora de plantas ou utilize o sistema de iluminação Eco-FAB em um ambiente de temperatura controlada adequado para o crescimento da respectiva planta. Em seguida, defina a câmara para 24 graus Celsius. Por fim, realizar o perfil de metabólitos e espectrometria de massas, de acordo com o protocolo de texto.

Esses números mostram Aaabidopsis thaliana de sete dias, brachypodium distachyon e panicum virgatum crescendo em Eco-FABs. Tanto a dicotiledônea quanto a monocotiledônea foram encontradas de acordo com seus estágios de reprodução no Eco-FAB. Essas mudas representam um grupo de brachypodium distachyon de 14 dias crescendo em meio hidropônico, bem como areia e solo suplementados com meio hidropônico e água, respectivamente.

A camada de substrato fina e sólida e as câmaras de crescimento radicular permitem que a luz penetre para obter imagens microscópicas dos sistemas radiculares. Aqui, uma muda de brachypodium distachyon foi transferida para o dispositivo Eco-FAB, e sua estrutura radicular foi registrada por uma câmera dentro de um gerador de imagens de gel biorad. A quantificação da área radicular total ao longo de três semanas mostrou um aumento gradual no estágio inicial, seguido por uma tendência de crescimento linear até o final.

Nesta figura, um Eco-FAB contendo a rizobactéria promotora de crescimento vegetal, pseudomonas simiae, WCS417 foi adicionado ao sistema radicular da planta de 10 a sexta células por planta. Os micróbios WCS147 colonizaram a superfície de todo o sistema radicular com micróbios concentrados em torno das áreas das pontas das raízes. Ao atualizar o meio de cultivo e coletar exsudatos de raízes de Eco-FABs, é importante lembrar de processar todo o trabalho em um exaustor estéril para evitar qualquer contaminação.

Os dispositivos Eco-FAB também podem ser fabricados usando um selo físico reversível, usando um grampo impresso em 3D ou alterando a viscosidade do PDMS. Isso permite o uso de meios de crescimento sólidos e de imagens espectroscópicas de massa diretas. Após o desenvolvimento do Eco-FAB, este sistema permitirá que pesquisadores de todo o mundo usem esses ecossistemas modelo de laboratório para estudar as interações entre micróbios de plantas usando biologia de sistemas e tecnologias de imagem.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar um sistema Eco-FAB, bem como suas amplas aplicações em estudos de ecossistemas. Esperamos que este projeto Eco-FAB permita que outros cientistas alcancem seus objetivos científicos específicos. Mais importante, esperamos que outros cientistas desenvolvam esse projeto Eco-FAB e o tornem melhor, e compartilhem com outros cientistas, para que, como comunidade, possamos construir esses ecossistemas de laboratório para nos permitir entender melhor as interações entre micróbios e plantas.

Não se esqueça de que trabalhar com micróbios e perfurocortantes pode ser extremamente perigoso e que sempre devem ser tomadas precauções ao realizar esse procedimento.