Name: Protocolos de fabricação (EcoFAB) ecossistema para a construção de ecossistemas de laboratório projetado para estudar interações planta-micróbio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprenda a construir dispositivos EcoFAB usando impressão 3D para estudar interações planta-micróbio em ecossistemas controlados de laboratório. Este protocolo padronizado permite análises de alta resolução e aplicações em agricultura sustentável.

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Este trabalho foi financiado pelo programa de laboratório dirigido a investigação e desenvolvimento (LDRD), do Lawrence Berkeley National Laboratory suportado pelo escritório da ciência, do departamento de energia dos EUA, sob contrato n º DE-AC02-05CH11231 e um prêmio DE-SC0014079 do Estados Unidos Departamento de energia escritório da ciência para UC Berkeley. Trabalho na fundição Molecular foi apoiado sob E.U. departamento da energia contrato n º DE-AC02-05CH11231. Agradecemos também Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen e Benjamin J. Cole no Lawrence Berkeley National Laboratory por toda sua ajuda.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Os protocolos aqui relataram para o uso de fabricação do ecossistema para criar que ecofabs fornece recursos comunitários para planta sistemática estudos de biologia em condições de laboratório altamente controlado. Avanços na impressão 3D fornecem tecnologias amplamente acessíveis para construir e refinar iterativamente EcoFAB projetos. A câmara de raiz aqui apresentada é encontrada para ser adequados para a microscopia de imagem e manter a esterilidade, permitindo a adição controlada de micróbios para investigar interações planta-micróbio. A plataforma EcoFAB é compatível com várias espécies de plantas. É importante reconhecer os efeitos fisiológicos de crescer as plantas dentro da câmara de raiz estreita tal que experimentos adicionais deverão generalizar conclusões para plantas que crescem em ambientes naturais.
O uso de câmaras estéril e cresce a luz LED possibilita a investigação dos efeitos das diversas condições de luz, incluindo o comprimento de onda, intensidade e duração, no crescimento das plantas e parâmetros fisiológicos relacionados em paralelo. Câmaras de raiz de ligação reversível permitam a utilização de substratos sólidos também quanto espacialmente coletar amostras sólidas para análise bioquímica e genética. As aplicações de substratos sólidos, como solos, areia e grânulos de quartzo, oferecem as possibilidades do uso EcoFABs construir ecossistemas de laboratório mais ecologicamente relevantes. No entanto, todos os sistemas aqui apresentados ainda mais uso líquido saturado (culturas hidropónicas) que não são um reflexo preciso da maioria dos solos e isso será importante para refinam estes projetos para manter os bolsos de ar dentro do solo, tal que melhor representam solos naturais.
O uso de câmeras simples e microscópios é descrito para o desenvolvimento de morfologia de raiz sistema de imagem em ambos em massa aos níveis celulares. Esta aptidão para monitoramento de imagem de morfologia de raiz e quantificação provavelmente será útil para compreender os mecanismos de regulação dos sinais fisiológicos e moleculares planta desencadeados por adaptações genotípica de planta para as condições de crescimento. No entanto, uma limitação para estudar o desenvolvimento fisiológico da raiz é o atual posicionamento horizontal do dispositivo EcoFAB. Em ambientes naturais, a resposta de gravitropic raízes leva a um desenvolvimento predominantemente vertical do sistema radicular. Assim, o sistema horizontal apresentado aqui provavelmente difere em alguns fatores de um ambiente natural, e a fabricação de sistemas EcoFAB com posicionamento vertical da câmara de raiz é um objetivo desejável para as futuras versões EcoFAB. Embora os dispositivos EcoFAB atuais são colocados horizontalmente, a análise de parâmetros de morfologia de raiz em várias condições, ou em resposta aos micróbios, é possível. Imagem de alta resolução pode ser aplicada para capturar a dinâmica de colonização de raiz de único isolados ou comunidades, fornecendo informações sobre qual planta peças são colonizadas em várias condições suficientes e deficientes de nutrientes. Prevê-se que tais estudos fornecerá importantes novos insights sobre como planta microbiomes são montados, e como essas dinâmicas mudam ao longo do tempo, por exemplo, como as raízes desenvolver.
Dispositivos microfluídicos permitem imagens de plantas muito jovens, e geralmente a quantidade de metabolitos recolhidos não é suficiente para análise LCMS. Sistemas baseados em solo, tais como rhizotrons, permitem a geração de imagens da morfologia da raiz quando as plantas também são transformadas com construção quimioluminescente (Glo-raiz) ou com métodos baseados em NMR33,34. Extrações de metabólito destes sistemas são demoradas por causa do grande volume de amostras. EcoFABs são uma combinação de ambos: a fabricação é similar aos dispositivos microfluídicos. EcoFABs foi projetados para ser simples e barata para reproduzir, mas o tamanho da câmara pode ser ajustado para crescer plantas com pequenas ou grandes sistemas de raiz, até seus estágios reprodutivos. Observações simultâneas de alterações de morfologia de raiz e exsudação de raiz são possíveis. O sistema é estéril, permitindo a adição controlada de micróbios específicos.
EcoFABs são projetados para permitir a introdução controlada e amostragem de micróbios e seus metabolitos. Especificamente, amostras colhidas em câmaras de crescimento de raiz são encontradas para ser suficiente para massa espectroscópico metabólito profiling. A integração de imagens de espectrometria de massa (ex., NIMS técnica apresentada aqui) fornece uma abordagem não-destrutiva de estudar distribuições espaciais de metabólito de sistemas da raiz. Esta técnica provavelmente será útil no futuro isótopos rastreamento experimentos e localização microbiana de mapeamento de metabolitos específicos36. Enquanto este protocolo centrou-se na único isolados, o mesmo projeto certamente pode ser usado para as comunidades mais complexas. Os volumes de amostra e biomassa dentro do EcoFABs são provavelmente mais do que suficiente para uma maior integração com tecnologias de sequenciamento de DNA, que será importante para caracterizar e monitorar a expressão de gene e estrutura de comunidade microbiana.
Em conclusão, este protocolo detalha a fabricação dos ecossistemas de laboratório projetado para a investigação de interações planta-micróbio, com ênfase em métodos simples e acessíveis que pode ser facilmente implementado e estendido por pesquisadores em todo o mundo. Os actuais esforços visam demonstrar a reprodutibilidade entre laboratórios e a integração de um sistema de controle de temperatura, tal que cada EcoFAB vai ter controlados independentemente luz e temperatura. Um avanço adicional do sistema será a integração de amostragem automatizada e o reenchimento de câmaras de raiz EcoFAB e o desenvolvimento de protocolos podem ser reproduzidos para estabelecer microbiomes de planta relevantes dentro de EcoFABs.

A aplicação de micróbios benéficos planta na agricultura oferece grande potencial para aumentar a alimentação sustentável e produção de biocombustíveis para fornecer para uma crescente população1,2,3,4. Uma quantidade significativa de trabalho suporta a importância da planta microbiomes na captação de nutrientes de planta, tolerância a estresses e resistência à doença5,6,7,8. No entanto, é difícil investigar esses mecanismos de interações planta-micróbio em ecossistemas do campo devido à complexidade e reprodutibilidade associada e incapacidade de controlar com precisão a composição microbiome e genética (EG., utilizando microbiana mutantes)4,9,10.
Uma estratégia é construir ecossistemas modelo simplificado para permitir controlada, experimentos de laboratório replicada investigando interações planta-micróbio para gerar ideias que podem ser mais testadas no campo10,11, 12. Este conceito baseia-se em abordagens tradicionais usando plantas cultivadas em vasos com solo cheio ou em placas de ágar dentro de estufas ou incubadoras13. Embora estas provavelmente continuará a ser o mais amplamente utilizado abordagens, falta-lhes a capacidade de precisamente monitorar e manipular os ambientes de crescimento de planta. Para esses fins, rhizoboxes e rhizotrons representam uma grande melhoria na capacidade de estudar processos abaixo do solo14,15, e, primeiros protocolos foram publicados para a análise de metabólitos de rizosfera em solo16. Mais recentemente, para permitir a análise de alto throughput, microfluidic avançados dispositivos13,17 como planta Chip18,19, RootArray20e RootChip21, foram desenvolvido como ferramentas eficientes para fenotipagem de planta com resolução espacial de micrômetro-escala para monitorar os estágios iniciais de crescimento da planta pequena modelo Arabidopsis thaliana no meio de vazão de líquidos. Recentemente, uma plataforma de imagem da dois-camada foi descrita que permite que a raiz do cabelo imaging de Arabidopsis thaliana na fase de plântula com uma plataforma de microfluidic22.
Aqui, protocolos detalhados para a construção de dispositivos controlados de laboratório (EcoFABs) são fornecidos, para estudar as interações micróbio de planta e mostrar que eles podem ser usados para estudar diversas plantas incluindo Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, a aveia selvagem ecologicamente importante Avena barbata e a colheita de bioenergia Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB é uma plataforma de crescimento de planta estéril que inclui dois componentes principais: o dispositivo EcoFAB e recipiente transparente tamanho planta estéril. O dispositivo é feito de um polidimetilsiloxano (PDMS), processo que envolve a carcaça PDMS de fabricação EcoFAB camadas de um molde de plástico impresso 3D e ligação de camadas PDMS para corrediças do microscópio usando métodos anteriormente relatados24,25 . Os procedimentos detalhados de EcoFAB fluxo de trabalho, tais como fabricação de dispositivo, esterilização, germinação de sementes, transplante de mudas, micróbio inoculação/cocultivation, preparação de amostras e análise, são descritos no presente protocolo (Figura 1). Outras modificações de fluxo de trabalho básico são descritas, incluindo a instalação do computador controlado luzes LED crescer e a utilização de substratos sólidos. A utilização de técnicas para investigar a morfologia da raiz de imagem muda, colonização microbiana das raízes, e imagem de massa espectroscópica de exsudados radiculares são descritos. Antecipamos que o design simples, barato, com base em materiais prontamente disponíveis, bem como os protocolos detalhados apresentados aqui, vai transformar a plataforma EcoFAB um recurso da Comunidade, a padronização de estudos de planta-microbiome de laboratório.

<table><tbody><tr>Arquivos <td>LBNL</td><td></td> STL <td>de molde personalizado impressos em 3D</td><td>disponíveis aqui www.eco-fab.org; Os moldes EcoFABs aqui descritos foram impressos pela FATHOM: http://studiofathom.com</td></tr><tr><td>Dow sylgard 184 kit transparente de elastómero de silicone</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5KG</td><td></td></tr><tr><td>Spray de espanador de ar</td><td>VWR</td><td>75780-350</td><td>qualquer espanador de gás comprimido deve funcionar</td></tr><tr><td>Agulha romba de calibre 15</td><td>VWR</td><td>89166-240</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 5 mL com ponta Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>BD309646</td><td></td></tr><tr><td>3" x2" lâmina de vidro para microscópio</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>1,75" x 2,56" x 3,56" Caixa EcoFAB</td><td>Amazon</td><td>B005GAQ25Q</td><td></td></tr><tr><td>4" x 3 &frac14; &rdquo; lâmina de vidro para microscópio</td><td>Ted Pella</td><td>260231</td><td></td></tr><tr><td>4,87" x 4,87" x 5,50" Caixa EcoFAB</td><td>Amazon</td><td>B00P9QVOS2</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de Plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Grampo personalizado impresso em 3D</td><td>LBNL</td><td></td><td>Arquivos STL disponíveis no laboratório de Trent Northen</td></tr><tr><td>Capuz estéril</td><td>AirClean Systems</td><td>Estações de trabalho</td> <td>de PCR da série AC600</td></tr><tr><td>Tubo de seringa de PTFE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z117315-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td></td></tr><tr><td>Alvejante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige e Skoog (MS) Laboratórios de Fitotecnologias à Base de Sal de Macronutrientes</td><td></td><td>M502</td><td></td></tr><tr><td>Laboratórios de Fitotecnologias</td><td>à Base de Sal de Micronutrientes Murashige e Skoog (MS)</td><td>M554</td><td></td></tr><tr><td>Solo</td><td>Hummert International</td><td>Pro-Mix PGX</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71010-52-1</td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana</td><td>Lehle Seeds</td><td>WT-24 Col-4 Columbia tipo</td><td></td>selvagem</tr><tr><td>Brachypodium distachyon</td><td>LBNL</td><td>Standard Bd-21 line</td><td>Disponível no laboratório de John Vogel</td></tr><tr><td>Panicum virgatum</td><td>The Samuel Roberts Noble Foundation</td>Fita micropore <td>switchgrass</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Alamo VWR</td><td>56222-182</td><td></td></tr><tr><td>metanol de grau LC-MS</td><td>VWR</td><td>JT9830-3</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>LABCONCO</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador SpeedVAC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant&trade; SPD111 SpeedVac</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC GV Filtro Centrífugo-0.22 &micro; m</td><td>Sistema</td> de cromatografia <td>líquida Millipore UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>Sistema Agilent 1290 LC</td><td></td></tr><tr><td>Q Espectrômetro de massa exativo</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive&trade; Chip híbrido Quadrupole-Orbitrap MS</td><td></td></tr><tr><td>NIMS e placa MALDI personalizada</td><td>LBNL</td><td></td><td>Para protocolo detalhado, consulte: doi:10.1038/nprot.2008.110</td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa MALDI</td><td>AB Sciex</td><td>TOF/TOF 5800 MALDI MS</td><td></td></tr><tr><td>Nano-revestido LED grow light strip</td><td>LED World Lighting</td><td>HH-SRB60F010-2835</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>LED World Lighting</td><td>MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J</td><td></td></tr><tr><td>Controlador TC420</td><td>Amazon</td><td>B0197U7R8Q</td><td></td></tr><tr><td>clipes de LED de silicone</td><td>Amazon</td><td>B00N9X1GI0</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de cola quente</td><td>Amazon</td><td>B006IY359K</td><td></td></tr><tr><td>Cabo conector de LED fêmea para nua</td><td>LED World Lighting</td><td>HH-F05</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de extensão de conector de LED fêmea para macho</td><td>LED World Lighting</td><td>HH-MF1</td><td></td></tr><tr>mundo do <td>diodo emissor</td> de luz da iluminação <td>6102051TFT4</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>WAGO 221-415 do diodo emissor de luz do cabo 20AWG 221-415 do fio</td> que liga o mundo <td>221-415</td><td></td> do <td>diodo emissor de luz</td></tr></tbody></table>

protocolos de fabricação (ecofab) ecossistema para a construção de ecossistemas de laboratório projetado para estudar interações planta-micróbio

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Interações planta-micróbio benéfico para oferecer uma solução biológica sustentável com o potencial para impulsionar a produção de alimentos e bioenergia de baixo-entrada. Uma melhor compreensão mecanicista dessas interações planta-micróbio complexo será crucial para melhorar a produção vegetal, bem como realizando basic ecológica estuda investigar interações planta-solo-micróbio. Aqui, uma descrição detalhada para fabricação de ecossistema é apresentada, usando tecnologias de impressão 3D amplamente disponíveis, para criar habitats laboratório controlado (EcoFABs) para estudos mecanicistas de interações planta-micróbio dentro específicos ambientais condições. Dois tamanhos de EcoFABs que são adequados para a investigação das interações microbianas com várias espécies de plantas, incluindo Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyone Panicum virgatumdescritos. Estes dispositivos de passagem permitem controlados manipulação e amostragem de raiz microbiomes, química de raiz, bem como a imagem da raiz morfologia e localização microbiana. Este protocolo inclui os detalhes para a manutenção de condições estéreis dentro EcoFABs e montagem de sistemas de iluminação LED independentes para EcoFABs. Métodos detalhados para adição de diferentes formas de mídia, incluindo os solos, areia e mídia de crescimento líquido acoplado para a caracterização desses sistemas utilizando imagens e metabolomics são descritos. Juntos, estes sistemas permitem a investigação detalhada e dinâmica da planta e planta-microbiana consórcios, incluindo a manipulação de microbiome composição (incluindo mutantes), o acompanhamento do crescimento da planta, morfologia de raiz, composição de exsudato, e Localização de microbiana sob condições ambientais controladas. Nós antecipamos que estes protocolos detalhados servirá como um importante ponto de partida para outros pesquisadores, idealmente, ajudando a criar sistemas experimentais padronizados para investigar interações planta-micróbio.

Cada sistema EcoFAB inclui um dispositivo EcoFAB e uma planta de tamanho de recipiente de plástico transparente. Um dispositivo EcoFAB tem um reservatório de planta, uma câmara de crescimento de raiz, uma entrada de fluxo de 1,6 mm e uma saída de 1,6 mm para dispositivo EcoFAB padrão (Figura 2D &amp; Figura 3 H) ou uma tomada de 10 mm para dispositivo de EcoFAB largo de corrente (Figura 2F &amp; Figura 3I ). O reservatório da usina é projetado em forma de trapézio que possui uma abertura superior de 6 mm e abertura de fundo de 3 mm, e este projeto reduz a possibilidade de vazamento de fluxo durante a injeção de líquido e também garante o espaço suficiente para o crescimento das plantas. A câmara de crescimento de raiz adota uma forma oval com 2 mm de profundidade para caber os sistemas da raiz de muitas plantas de modelo, como mostrado na Figura 2 e E. Canais de entrada e de saída de um dispositivo EcoFAB padrão podem ser conectados com tubo de PTFE para que soluções de nutrientes podem fluir na câmara de crescimento de raiz sem abrir o recipiente EcoFAB. O dispositivo de EcoFAB largo-tomada grandemente reduz a resistência ao fluxo de saída e é usado de preferência quando o cultivo de plantas com sistemas de raiz grossos ou periodicamente coleta exsudados de raiz depois de sistemas complexos de raiz são derivados de plantas.
Os moldes de fundição para a fabricação de camadas PDMS de dispositivos EcoFAB são criados em um software de design e 3D impresso em fotopolímeros opacos rígidos, como mostrado na Figura 2 e Figura 3. Plantas dentro de EcoFABs podem ser diretamente observadas com um microscópio usando uma distância de trabalho longa, garantindo que o estéril cresce ambiente (Figura 8A, Arquivo complementar 1). EcoFAB dispositivos com plantas também podem caber em um palco de microscópio de alta resolução, que permite que imagens de resolução mais elevada de interações planta-micróbio (Figura 8B, Arquivo complementar 2). Esterilidade não é mantida neste ambiente, e imagens de alta resolução, portanto, só é adequada para medições de ponto de extremidade.
EcoFABs são projetados para permitir estudos de sistemática de plantas, tais como a sua morfologia, metabolismo e comunidades microbianas em seus estágios de crescimento diferentes em seus ciclos de vida. Aqui, EcoFABs foram examinados como uma plataforma geral para estudar uma variedade de espécies de plantas. Figura 8 -E mostrar 7 - dias velho Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyone Panicum virgatum crescendo em EcoFABs. Todas as três plantas foram encontradas crescer bem no EcoFAB para mais de um mês. Tanto a dicot, Arabidopsis thaliana e a botânica, Brachypodium distachyon foram encontrados à altura de seus estágios de reprodução na EcoFABs.
O sistema de vedação reversível permite o uso de substratos sólidos (ex., solo) dentro do EcoFABs (passo 2.2). Este reversível da selagem abordagem permite um carregamento de substratos sólidos em câmaras de crescimento de raiz e também permite a coleta de amostra de regiões específicas de rhizospheres de raiz. Figura 8F -H mostra um grupo de 14 dias de idade Brachypodium distachyon crescendo no meio hydroponic, bem como a areia e solo suplementado com meio hydroponic (areia) e água (solo). A camada fina de substrato sólido em câmaras de crescimento de raiz permite que a luz penetrar para geração de imagens microscópica de sistemas da raiz.
Morfologia da raiz é definida como configuração espacial e a distribuição de um sistema de raiz da planta e foi aprovada como uma resposta de Fisiologia essencial para ambientes de crescimento diversas, tais como nutriente ou água disponibilidade32,33, 34. EcoFABs fornecem uma abordagem conveniente estudar a morfologia vegetal ao longo do tempo ou em diferentes condições de nutrientes. Figura 9A-F mostram um exemplo de usando EcoFABs para acompanhar as morfologias de raiz de Brachypodium distachyon nas primeiras três semanas. Uma muda de Brachypodium distachyon foi transferida para o dispositivo EcoFAB, e sua estrutura de raiz foi gravada por uma câmera dentro de um sistema de imagem de gel BIO-RAD. Programa de processamento de imagem, como imagem J, python e matlab, pode ser mais aplicado para quantificar as alterações de morfologias raiz ao longo do tempo ou em diferentes ambientes de médio. A quantificação da área total da raiz ao longo de três semanas, mostrou um aumento gradual da fase inicial (&lt; 1 semana) seguido por uma tendência de crescimento linear ao fim de três semanas, como mostrado na Figura 9.
A principal motivação para construir o EcoFAB é investigar interações planta-micróbio. Conforme descrito na etapa 5.4, microorganismos são transferidos para câmaras de crescimento de raiz da EcoFAB dispositivos através do canal de entrada. A Figura 10 mostra, um EcoFAB contendo simea Pseudomonas (anteriormentefluorescens) WCS417 (WCS417), um crescimento de planta promovendo rizobactérias com rótulos quimioluminescente, foi adicionado para os sistemas de raiz da planta com uma concentração de 106 células por planta. O sinal de WCS417 foi detectado com um Imageador de gel, que indicou uma distribuição espacial distinta dos micróbios WCS417 em câmaras de crescimento de raiz. Em ambos os MS meio líquido com e sem o substrato sólido areia, WCS417 micróbios colonizaram as superfícies dos sistemas da raiz inteiras com micróbios concentrados-se em torno das áreas de ponta de raiz, possivelmente devido à produção de nutriente ativa de dicas de raiz (Figura 10 &amp; H)35. Por outro lado, os micróbios WCS417 em substrato de solo acumularam em torno da região do reservatório de planta em vez de dicas de raiz (Figura 10eu). Como os micróbios foram adicionados através do canal de saída, os micróbios também foram capazes de mover-se ao substrato de solo, mas não se acumulam na raiz, como observado em meio líquido, com ou sem areia. Isso pode indicar que o solo é uma fonte de nutrientes suficiente, e os micróbios migraram para o reservatório de planta para as condições de respiração ideal.
Para estudar metabólito perfilação de exsudados de raiz da planta, bem como a captação de metabólito e liberte das interações planta-micróbio, as soluções de exsudato das câmaras de crescimento de raiz foi coletada através de vários estágios de crescimento das plantas em EcoFABs. Conforme descrito na etapa 6, amostras do exsudato então são extraídas para a análise de LC-MS. Usando este método, uma variedade de metabólitos exalava pela planta e consumido pelos micróbios foi detectada, e o perfil de metabólito relacionado de exsudados radiculares com e sem colonização micróbios é atualmente sob investigação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig1.jpg"> Figura 1: fluxo de trabalho The EcoFAB. Plantas são germinadas na placa e transferidas para o EcoFAB esterilizado, os micróbios podem ser adicionados. Amostragem não-destrutiva: exsudados de raiz podem ser amostrados e fotografados, e morfologia da raiz pode ser visualizada. Amostragem destrutiva permite a análise de micróbio, raiz e atirar parâmetros em detalhe.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig2.jpg"> Figura 2: componentes do 3D impresso moldes para a fabricação de dispositivo EcoFAB. (A) superiores e inclinadas vistas de um quadro de fundição. (B) superiores e inclinadas vistas de uma inserção. (C) superior e vistas inclinadas sobre uma base de molde padrão. (E) superiores e inclinadas vistas de uma base de tomada de todo o molde. (D, F) Moldes montados para fabricar dispositivos de EcoFAB padrão e a escala de corrente, respectivamente. As dimensões ovais são 51 x 34 mm para o pequeno EcoFAB molde e 76 mm x 62 mm para grandes EcoFAB molde. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig3.jpg"> Figura 3: fabricação de dispositivo EcoFAB. (A) despejar a mistura do agente de cura e base de elastômero no molde. (B) aquecimento do molde com uma mistura a 85 ° C por 4 h. (C) remover a inserção do molde. (D) separando o PDMS da armação da carcaça. (E) empurrando o molde base fora do quadro de fundição. (F) usando uma faca para separar o molde ao longo das bordas do PDMS. (G) a camada PDMS lentamente fora da base de molde a descascar. Buracos de Poking (H) para os canais de entrada e a saída da camada padrão de PDMS. (I) cutucando um buraco para o canal de entrada da camada de PDMS largo-tomada. Camada (J) o PDMS (feitas de um elastômero de 15:1 base para mistura de agente de cura) e uma lâmina de microscópio são lavadas e transferidas para um plasma líquido de limpeza para colagem. (K) usando os grampos para prender a camada PDMS (feita de uma base de elastômero de 5:1 a mistura do agente de cura) numa lâmina de microscópio. (L) pressionando a camada PDMS (feita de uma base de elastômero de 30: 1 a mistura do agente de cura) diretamente para uma lâmina de microscópio. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig4.jpg"> Figura 4: O design de braçadeiras personalizados. (A) superiores e inclinadas vistas do topo de uma braçadeira placa. (B) superiores e inclinadas vistas sobre um fundo fixar placa. (C) superior e inclinadas vistas do grampo montado com quatro conjuntos de parafusos hexagonais. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig5.jpg"> Figura 5: instalar LED crescer luzes. (A) marcação fora os locais para 9 clipes de LED em uma espiral em torno do recipiente EcoFAB. (B) LED clipes anexado ao contêiner EcoFAB. (C) threading uma tira de LED por esses clipes. (D) regueta o LED a um controlador com fio com uma fonte de alimentação de 24V. (E) o esquema de ligações dos fios para o controlador. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig6.jpg"> Figura 6: transferência de mudas para EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon plantas cultivadas há 2 dias em um prato de 0,5 MS. (B) enchendo a câmara de raiz com média de crescimento de planta. (C) usando uma pinça para inserir a raiz cuidadosamente o reservatório da usina. (D) selar o recipiente EcoFAB com fita micropore, depois de adicionar 3 mL de água para o fundo do recipiente. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig7.jpg"> Figura 7: imagem NIMS da planta raízes no EcoFABs. (A) um Brachypodium distachyon crescendo em um EcoFAB estéril. (B) anexar a camada PDMS com a planta em uma microplaqueta NIMS por 20 min. (C) usando cobre fita colocar o chip de NIMS em uma placa personalizada de MALDI e carregá-los em um espectrômetro de massa MALDI. (D-G) um 7 - velho dia e um 20 dia de idade Brachypodium distachyon planta usada para NIMS imaging (D, E) e as imagens correspondentes do NIMS (F, G). Os íons predominantes foram destacados em vermelho, verde e azul. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig8.jpg"> Figura 8: as aplicações gerais de EcoFABs. (A) diretamente capturando o crescimento da raiz de Brachypodium distachyon em um EcoFAB com uma configuração de microscópio de distância longa do trabalho. (B) diretamente, observando interações micróbio de raiz com uma configuração de alta resolução do microscópio. (C-E) 7 - dias velho Arabidopsis thaliana (C), Brachypodium distachyon (D) e Panicum virgatum (E) no meio hydroponic 0,5 MS, 14 dias de idade (F-H) Brachypodium distachyon cultivadas em hidroponia 0,5 MS (F), em areia (G) e solo (H) substrato fornecido com média de 0,5 MS e água, respectivamente. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig9.jpg"> Figura 9: usando EcoFABs para estudar a morfologia da raiz. (A-F) Desenvolvimento de raiz de Brachypodium distachyon crescendo em EcoFABs preenchido com média de 0,5 MS durante as primeiras três semanas: (A) há 2 dias, (B) 4, (C) 7 dias, (D) 11, e 14 dias, (F) 21 dias de crescimento. (G) áreas de superfície de raiz em média foram estimadas pelo software ImageJ. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig10.jpg"> Figura 10: usando EcoFABs para estudar interações de raiz-micróbio. (A, B, C) Um grupo de 15 dias de idade Brachypodium distachyon colonizar com Pseudomonas fluorescens WCS417 em diferentes formas de mídia-MS líquidos substratos de solução, areia e solo. (D, E, F) Fotos de campo brilhante de seus sistemas da raiz. (G, H, EU) As correspondentes imagens quimioluminescente destes sistemas de raiz após cultivo co 14 dias. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Complementar arquivo 1. Usando EcoFAB para capturar o crescimento da raiz. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video1_capture_growing_roots_(2).mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementar arquivo 2. Usando EcoFAB para capturar as interações de raiz-micróbios. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video2_capture_root_microbes_interaction.avi">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este artigo descreve protocolos detalhados para fabricação de ecossistema de dispositivos (EcoFABs) que permitem que os estudos de plantas e as interações planta-micróbio em condições de laboratório altamente controlado.

Protocolos de fabricação (EcoFAB) ecossistema para a construção de ecossistemas de laboratório projetado para estudar interações planta-micróbio

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

O objetivo geral deste protocolo é definir abordagens padronizadas para a construção de ecossistemas de plantas modelo simplificados, chamados EcoFABs, que permitem experimentos laboratoriais controlados e replicados para investigar interações entre micróbios e plantas que podem ser testadas em campo. Este método pode ser usado para estudar as interações entre micróbios de plantas em ambientes controlados, o que nos permite obter insights mecanicistas detalhados sobre as funções dos microbiomas para nos permitir aproveitá-los para uma agricultura sustentável. Ajudamos a projetar este primeiro Eco-FAB, que emprega uma variedade de tecnologias de impressão 3D disponíveis e esteriliza as câmaras de crescimento de plantas que permitem imagens de alta resolução sem distração e análises químicas.O dispositivo Eco-FAB desenvolvido aqui é adequado para a análise de interações entre micróbios de plantas porque incorpora análise da morfologia da raiz e imagens espectroscópicas de massa. Após a construção dos moldes Eco-FAB, utilizando impressão 3D de acordo com o protocolo de texto, em um recipiente descartável de um litro, misturar 40 mililitros de base de elastômero de siloxano com diferentes volumes de agente de cura, dependendo do experimento. Coloque o recipiente em uma câmara de vácuo por pelo menos 30 minutos para remover as bolhas de ar da mistura de elastômero.Em seguida, remova a mistura e despeje-a no molde de plástico impresso em 3D montado. Para gerar uma camada PDMS uniforme, as bolhas de ar devem ser removidas com cuidado. Use ar comprimido para soprar quaisquer resíduos de ar após transferir a mistura para o molde.Mantenha o molde em um bloco de aquecimento a 85 graus Celsius por quatro horas. Deixe o molde esfriar por cinco minutos. Em seguida, puxe suavemente a pastilha do molde e use uma faca para separar lentamente o PDMS da estrutura de fundição.Pressione a base do molde com PDMS para fora da estrutura de fundição. Em seguida, use uma faca ou outras ferramentas para separar suavemente a camada PDMS da base do molde nas bordas e retire-a lentamente da superfície do molde. Usando uma agulha romba de calibre 15, crie um canal de entrada nas camadas do PDMS fazendo furos de 1,6 milímetros nessa parte.Em seguida, use uma tesoura para aparar as bordas das camadas do PDMS. Para unir permanentemente as camadas de PDMS às lâminas do microscópio, use metanol para enxaguar o lado de ligação da camada de PDMS em uma lâmina de microscópio de 7,6 por cinco centímetros e, em seguida, seque-as com ar comprimido ou uma pistola de nitrogênio ultrapuro. Coloque a lâmina do microscópio e a camada PDMS em um limpador de plasma com os lados de colagem voltados para cima.Feche a câmara e a válvula de ventilação de gás. Em seguida, ligue o aspirador e bombeie a câmara por um minuto. Ligue a energia do gerador de plasma e mude a frequência de rádio, ou nível de RF, para alto por um minuto.Em seguida, desligue a bomba de vácuo e a energia de plasma e ventile a câmara para a atmosfera. Retire a lâmina do microscópio e a camada PDMS da câmara de plasma e pressione rapidamente todas as quatro bordas da camada PDMS na lâmina com pressão uniforme. Certifique-se de que a região oval central, que é a câmara da raiz, não toque na lâmina.Usando água ultrapura, enxágue os dispositivos Eco-FAB. Coloque um dispositivo Eco-FAB em um recipiente Eco-FAB e adicione 70% de etanol até que o dispositivo esteja submerso. Em seguida, feche a tampa do recipiente e agite-a suavemente para molhar todas as superfícies internas com etanol, certificando-se de que a câmara de crescimento da raiz do dispositivo Eco-FAB esteja cheia de etanol, com muito poucas ou nenhuma bolha de ar.Depois de incubar os dispositivos em temperatura ambiente por 30 minutos, despeje o etanol 70% e substitua-o por etanol 100%. Em seguida, incube os dispositivos por cinco minutos. Após a incubação, drene o etanol e deixe o Eco-FAB esterilizado em uma capela de fluxo laminar por 16 horas para secá-lo completamente.Se disponível, esterilize o sistema ligando a luz ultravioleta no exaustor por uma hora. Para realizar a esterilização e germinação das sementes, mergulhe as sementes em etanol a 70% por dois minutos. Em seguida, com uma pipeta, remova o etanol e use água estéril para enxaguar as sementes três vezes.Em seguida, mergulhe as sementes em solução de alvejante a 10% por cinco minutos. Em seguida, remova a solução de alvejante e use água estéril para lavar bem as sementes três vezes. Após as lavagens, adicione água estéril às sementes e incube o tubo a quatro graus Celsius por sete dias.Espalhe uniformemente as sementes em 0,5 Murashige e Skoog, ou meio MS, com 0,6% de vitagel. E com fita micropore, sele as placas. Em seguida, cultive as plantas até um comprimento de raiz de cerca de cinco mililitros.Para transferir as mudas para Eco-FABs, usando uma seringa ou micropipeta estéril e água estéril, lave a câmara radicular de um dispositivo Eco-FAB três vezes e, em seguida, encha a câmara radicular com o meio de crescimento de interesse, como meio 0,5 MS. Agora, insira cuidadosamente uma única muda no reservatório da planta do dispositivo Eco-FAB. É importante que as mudas sejam transferidas com cuidado da placa para o Eco-FAB para que as raízes não se quebrem.Adicione três mililitros de água estéril no recipiente, evitando o dispositivo Eco-FAB. Isso aumentará a umidade e reduzirá a evaporação do meio da câmara radicular. Em seguida, feche o recipiente e use fita micropore para selar a tampa.Coloque o Eco-FAB em uma incubadora de plantas ou utilize o sistema de iluminação Eco-FAB em um ambiente de temperatura controlada adequado para o crescimento da respectiva planta. Em seguida, defina a câmara para 24 graus Celsius. Por fim, realizar o perfil de metabólitos e espectrometria de massas, de acordo com o protocolo de texto.Esses números mostram Aaabidopsis thaliana de sete dias, brachypodium distachyon e panicum virgatum crescendo em Eco-FABs. Tanto a dicotiledônea quanto a monocotiledônea foram encontradas de acordo com seus estágios de reprodução no Eco-FAB. Essas mudas representam um grupo de brachypodium distachyon de 14 dias crescendo em meio hidropônico, bem como areia e solo suplementados com meio hidropônico e água, respectivamente.A camada de substrato fina e sólida e as câmaras de crescimento radicular permitem que a luz penetre para obter imagens microscópicas dos sistemas radiculares. Aqui, uma muda de brachypodium distachyon foi transferida para o dispositivo Eco-FAB, e sua estrutura radicular foi registrada por uma câmera dentro de um gerador de imagens de gel biorad. A quantificação da área radicular total ao longo de três semanas mostrou um aumento gradual no estágio inicial, seguido por uma tendência de crescimento linear até o final.Nesta figura, um Eco-FAB contendo a rizobactéria promotora de crescimento vegetal, pseudomonas simiae, WCS417 foi adicionado ao sistema radicular da planta de 10 a sexta células por planta. Os micróbios WCS147 colonizaram a superfície de todo o sistema radicular com micróbios concentrados em torno das áreas das pontas das raízes. Ao atualizar o meio de cultivo e coletar exsudatos de raízes de Eco-FABs, é importante lembrar de processar todo o trabalho em um exaustor estéril para evitar qualquer contaminação.Os dispositivos Eco-FAB também podem ser fabricados usando um selo físico reversível, usando um grampo impresso em 3D ou alterando a viscosidade do PDMS. Isso permite o uso de meios de crescimento sólidos e de imagens espectroscópicas de massa diretas. Após o desenvolvimento do Eco-FAB, este sistema permitirá que pesquisadores de todo o mundo usem esses ecossistemas modelo de laboratório para estudar as interações entre micróbios de plantas usando biologia de sistemas e tecnologias de imagem.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar um sistema Eco-FAB, bem como suas amplas aplicações em estudos de ecossistemas. Esperamos que este projeto Eco-FAB permita que outros cientistas alcancem seus objetivos científicos específicos. Mais importante, esperamos que outros cientistas desenvolvam esse projeto Eco-FAB e o tornem melhor, e compartilhem com outros cientistas, para que, como comunidade, possamos construir esses ecossistemas de laboratório para nos permitir entender melhor as interações entre micróbios e plantas.Não se esqueça de que trabalhar com micróbios e perfurocortantes pode ser extremamente perigoso e que sempre devem ser tomadas precauções ao realizar esse procedimento.

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Ambiente

Dispositivos microfluídicos pode ser usado para visualizar os complexos processos naturais em tempo real e nas escalas físico apropriado. Temos desenvolvido um dispositivo simples microfluídicos que imita características-chave de meios porosos naturais para o estudo de crescimento e de transporte de bactérias no subsolo.

Janela em um Microworld: Simple sistemas microfluídicos para estudar o transporte microbiana em Meios Porosos

Fonte: Nathoo, N., et al. Um sistema de co-cultivo hidropônico para análise simultânea e sistemática de interações moleculares e sinalização planta/micróbio. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra um sistema de co-cultivo hidropônico para estudar as interações planta-bactéria em condições estéreis. As mudas das plantas são transferidas para um meio de crescimento ácido estéril, incubadas e inspecionadas quanto à contaminação antes da inoculação com Agrobacterium. As bactérias ativadas se...

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O desenvolvimento de comunidades microbianas depende de uma combinação de fatores, incluindo arquitetura ambiental, abundância de membros, traços e interações. Este protocolo descreve um ambiente sintético e microfabricado para o rastreamento simultâneo de milhares de comunidades contidas em poços de femtoliter, onde fatores-chave como tamanho de nicho e confinamento podem ser aproximados.

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O sistema de cocultivação hidropônico descrito suporta plantas intactas com telas de malha metálica e as coculata com bactérias. O tecido vegetal, as bactérias e as moléculas segregadas podem então ser colhidas separadamente para análises a jusante, permitindo simultaneamente que as respostas moleculares de ambos os hospedeiros de plantas e micróbios ou microbiomas interativos sejam investigadas.

Um sistema de co-cultivo hidropônico para análises simultâneas e sistemáticas de interações moleculares e sinalizadoras de plantas / micróbios

Este artigo descreve a metodologia detalhada para preparar uma matriz multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulação de alta produtividade de física e química sugestões imitando na vivo o microambiente celular e para Identifica o ambiente celular ideal para as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) com perfis de célula única.

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Devido à opacidade do solo, as interações entre seus micróbios constituintes não podem ser facilmente visualizadas com resolução celular. Aqui, são apresentadas duas ferramentas microfluidas, que oferecem novas oportunidades para investigar interações fúngicas-microbianas. Os dispositivos são versáteis e simples de usar, permitindo alto controle espesso e imagens de alta resolução no nível celular.

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Protocolos de fabricação (EcoFAB) ecossistema para a construção de ecossistemas de laboratório projetado para estudar interações planta-micróbio (Vídeo) | JoVE Journal

Protocolos de fabricação (EcoFAB) ecossistema para a construção de ecossistemas de laboratório projetado para estudar interações planta-micróbio

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