Formação de ligações covalente DNA adutos por agentes cancerígenos ativados enzimaticamente drogas In Vitro e sua determinação por ³²P-postlabeling

O objetivo geral deste protocolo é a descrição de métodos que empregam as reações catalisadas pelo citocromo p450 e enzimas de biotransformação adicionais para investigar a potência de produtos químicos ou drogas para sua ativação em metabólitos formando adutos de DNA covalente. Este método pode ajudar a responder às questões-chave no campo do desenvolvimento do câncer e seu tratamento. A principal vantagem dessa técnica é que ela mostra um tipo de método para avaliar a potência de produtos químicos ou drogas ambientais para formar adutos de DNA covalente que representam o início do desenvolvimento do câncer.

As implicações da técnica que determina a potência cancerígena dos produtos químicos. Potência ambiental, tóxicos e drogas e também determina métodos relativamente simples para a formação de adutos de DNA covalente formados por tais compostos. Embora esse método possa fornecer informações sobre o início do desenvolvimento do câncer e seu tratamento, ele também pode ser aplicado a outros campos científicos.

Como estudos de mecanismos moleculares, de danos ao DNA e estudos orais sobre ativação enzimática e toxicidade de produtos químicos. Ouvi pela primeira vez a ideia desse método quando investiguei os processos envolvidos na fase de iniciação da carcinogênese química. Primeiro prepare a mistura de incubação adicionando todos os compostos e os sistemas enzimáticos a um volume final de 0,75 mililitro a quatro graus Celsius.

Isso é para incubar o carcinógeno com o DNA na presença do citocromo p450. Em seguida, adicione microssomas ou p450 recombinante puro em supersoma à mistura. Em seguida, adicione 7,5 microlitros de elipticina 0,1 milimolar dissolvida em DMSO e 42,5 microlitros de água para ajustar o volume final para 0,75 mililitro.

Em seguida, misture os componentes agitando o tubo por cinco segundos. Imediatamente depois, incube o tubo a 37 graus Celsius com a tampa aberta por 30 a 60 minutos. Em seguida, misture fenol ou fenol clorofórmio em uma proporção de um para um com a mistura de incubação em um tubo Eppendorf.

Isso removerá a contaminação proteica do DNA na mistura de incubação. Em seguida, mexa a mistura para formar uma emulsão. Em seguida, gire a mistura a 1600 vezes g por três minutos em temperatura ambiente.

Quando a centrifugação terminar, use uma pipeta para transferir a fase aquosa superior para um novo tubo de polipropileno. Em seguida, descarte a interface da proteína junto com a fase orgânica. Em seguida, misture a fase aquosa com volume equivalente de fenol e clorofórmio na proporção de um para um.

Em seguida, repita a centrifugação. Em seguida, adicione volumes iguais de clorofórmio à fase aquosa coletada e centrifugue novamente. Em seguida, precipite o DNA da fase aquosa adicionando dois volumes de etanol frio mantidos a menos 20 graus Celsius.

Em seguida, misture bem a solução. Para se preparar para a marcação dos adutos de DNA, misture a solução tampão de bicina com a solução de ATP radiomarcada para marcar os adutos de DNA. Adicione a mistura de rotulagem à solução NP1 ou à mistura de enriquecimento de butanol.

Deixe a mistura repousar em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, aplique aproximadamente 20 microlitros em toda a amostra na placa de TLC de PEI-celulose. Depois de localizar a amostra na placa de PEI-celulose TLC, deixe a placa se desenvolver na direção D1 para limpar os adutos.

Assim que a placa estiver seca, deixe a placa se desenvolver nas direções D3 e D4. Para desenvolver em D3, use tampão de formato de lítio em pH 3,5 com uréia. Para o desenvolvimento de D4, use tampão Tris-HCl com cloreto de lítio e uréia.

Para evitar problemas de desenvolvimento na direção D4, desenvolva as placas também na direção D5. Primeiro, a técnica de pós-marcação de P32 é utilizada para estudar a eficiência da elipticina bioativada mediada por p450 microssomal na formação de adutos de DNA. Os resultados mostram a formação de adutos de DNA covalente na desoxiguanosina do DNA do timo do bezerro na presença de microssomas hepáticos de rato e/ou humanos; no entanto, nenhum aduto é formado no grupo de controle.

Em seguida, estuda-se o potencial da elipticina ativada dependente da enzima peroxidase. A imagem mostra a formação de adutos de DNA covalente no DNA do timo de bezerro na presença de peroxidase de rábano, lactoperoxidase bovina e mieloperoxidase humana. De fato, os adutos de DNA também são formados a partir do DNA do fígado quando os ratos são tratados com 40 miligramas por quilograma de peso corporal de elipticina in vivo.

Curiosamente, a enzima CYP3A4 do citocromo p450 humano também mostra forte potencial para oxidar eficientemente a elipticina em metabólitos como 12-hidroxielipticina e 13-hidroxielipticina. Esses metabólitos podem se ligar facilmente ao DNA para formar os adutos. Em seguida, os métodos de enriquecimento da nuclease P1 e n-butanol são usados para estudar a formação de adutos de DNA após a ativação da 3-nitrobenzantrona com redutase citosólica, como NQ01 de ratos e humanos.

Os resultados mostram a formação de até cinco adutos de DNA do timo do bezerro, DNA obtido do citosol hepático humano e também do fígado de camundongos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar a estabilidade dos sistemas enzimáticos utilizados.

A atividade enzimática pode diminuir se não for armazenada no gelo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da bioquímica, a bioquímica da carcinogênese química, explorarem a natureza do fenômeno a partir dos processos de iniciação do desenvolvimento do câncer em organismos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a potência de produtos químicos ambientais ou drogas a serem ativadas enzimaticamente para metabolizar adutos genéticos de DNA covalente

Este processo representa grande importância para o desenvolvimento de tratamentos baseados no câncer. Não se esqueça de que você está trabalhando com produtos químicos que podem ser extremamente perigosos. Potenciais agentes cancerígenos, produtos químicos radioativos, por exemplo, fósforo ATP.

Portanto, precauções como luvas de látex de laboratório e folhas de acrílico devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.