Identificação de células satélite de músculo esquelético por imunofluorescência com anticorpos de laminina e Pax7

O objetivo geral deste protocolo é identificar células satélites musculares esqueléticas adultas por meio de imunofluorescência. Este método pode responder a questões-chave relacionadas ao número e distribuição de células-tronco musculares em condições fisiológicas e patológicas. A principal vantagem da técnica é que se pode identificar células-tronco musculares em seu ambiente fisiológico com manipulação limitada.

Demonstrando o procedimento estará Faiza Naz, uma pós-doutoranda do meu laboratório. Para começar, prepare um banho de nitrogênio líquido despejando nitrogênio líquido em um frasco Dewar. Em seguida, despeje 10 mililitros de metilbutano em um copo de plástico de 20 mililitros e transfira o copo para o banho de nitrogênio líquido.

Coloque o músculo tibial anterior dissecado na superfície plana de um pequeno êmbolo de seringa de plástico. Em seguida, cubra o músculo dissecado com algumas gotas de composto de temperatura de corte ideal ou OCT. Remova o béquer de metilbutano do banho de nitrogênio líquido e descongele a superfície usando os cabos de uma tesoura. Mergulhe rapidamente o tecido coberto com OCT no metilbutano derretido para congelá-lo.

Em seguida, use uma pinça para separar o tecido embutido do êmbolo e transferi-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, armazene o tubo da microcentrífuga no nitrogênio líquido. Para iniciar o seccionamento do criostato, adicione uma gota de composto OCT no centro do suporte da amostra de um criostato e deixe-o solidificar parcialmente.

Em seguida, cole o tecido embutido no composto OCT com o tornozelo voltado para baixo e o joelho para cima. Em seguida, monte o suporte da amostra no criostato e corte o tecido em intervalos de 10 micrômetros. Colete de quatro a oito criosseções em cada lâmina revestida de gelo.

Seque as seções em temperatura ambiente por três horas, depois colete as lâminas em uma caixa de lâminas e guarde-as a 80 graus Celsius negativos. Em seguida, remova uma lâmina da caixa de lâminas e aqueça-a até a temperatura ambiente. Em seguida, use uma caneta bloqueadora de líquidos para marcar uma área ao redor das criosseções para evitar que os líquidos escorra para o lado.

Em uma capela, adicione 300 a 500 microlitros de paraformaldeído a 4% na área marcada. Incube a lâmina em temperatura ambiente por 10 minutos para fixar as seções. Em seguida, enxágue o paraformaldeído da lâmina com PBS em um recipiente de lâmina.

Para iniciar a recuperação do antígeno, encha um recipiente de lâminas com 200 mililitros de tampão citrato e transfira a lâmina para o recipiente. Em seguida, transfira o recipiente deslizante para uma panela de pressão em alta pressão por 10 minutos. A etapa de recuperação do antígeno é opcional se as seções forem secas à temperatura ambiente por 30 minutos e prosseguirem imediatamente.

Então a etapa de recuperação do antígeno não é necessária. Mas se as seções forem secas à temperatura ambiente por mais de três horas e armazenadas a menos 80 graus Celsius, a etapa de recuperação do antígeno é necessária. Em seguida, resfrie o recipiente deslizante em água corrente por 10 minutos.

Em seguida, transfira a lâmina para um novo recipiente com 200 mililitros de PBST e enxágue com PBST. Adicione lenços umedecidos em água à bandeja, depois observe a lâmina enxaguada com uma caneta PAP e coloque-a na bandeja. Adicione 200 microlitros de solução de bloqueio à lâmina.

Em seguida, tampe a bandeja e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. A etapa de bloqueio é muito importante porque o anticorpo Pax7 usado é um anticorpo monoclonal de camundongo. A etapa de bloqueio do mouse no mouse reduz as associações inespecíficas.

Em seguida, enxágue a lâmina com PBST no recipiente da lâmina e coloque-a de volta na bandeja. Adicione 200 microlitros de mistura de anticorpos primários à lâmina e incube em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, enxágue a lâmina com PBST, adicione 200 microlitros de mistura de anticorpos secundários e incube no escuro em temperatura ambiente por uma hora.

Após o período de incubação, enxágue a lâmina com PBST. Diluir o DAPI num recipiente para lâminas e incubar a lâmina no recipiente durante três minutos. Em seguida, enxágue o DAPI com PBST por cinco minutos.

Por fim, monte o slide com a mídia de montagem e aplique uma lamínula. Neste estudo, as células satélites são visualizadas com sucesso em seções musculares adultas em repouso sob um microscópio fluorescente. O ruído de fundo geralmente visto com tecido muscular adulto e certos tipos de fibras é reduzido usando o bloqueio de mouse contra mouse.

Os sinais de imunocoloração específicos são aprimorados pelo uso de anticorpos secundários conjugados com corantes Alexa brilhantes. Um microscópio confocal de dois fótons captura uma imagem mais nítida em comparação com o microscópio fluorescente de campo amplo. O mesmo protocolo também pode ser aplicado ao tecido muscular de camundongos juvenis, embriões de camundongos e tecidos musculares adultos lesionados.

Tanto os tecidos musculares juvenis quanto os embrionários apresentam células satélites mais ativadas ou precursores miogênicos Pax7 com núcleos relativamente maiores. Assim, torna-se mais fácil visualizar as células satélites de camundongos mais jovens do que de camundongos adultos. No tecido muscular lesionado, mais células positivas para Pax7 ativadas são visíveis.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o ruído proveniente da autofluorescência e da imunoligação inespecífica de camundongo para camundongo não pode ser totalmente eliminado, mas com este protocolo o ruído pode ser amplamente reduzido. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar células satélites em criosseções musculares.