Name: Específicos e detecção precisa do Using PCR convencional em amostras de tecido de folhas cítricas cítricas Greening patógeno Candidatus liberibacter spp. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a detectar Candidatus liberibacter spp. em tecido foliar cítrico usando PCR convencional e extração de DNA genômico. Este método eficiente permite identificação rápida do patógeno causador do greening para agricultores e pesquisadores.

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Conceituação, H.C. e z. p. F.; Investigação, H. C., J. C e z. p. F; Recursos, z. p. F.; Escrevendo - projecto Original, I. r. P.; Escrita – revisão e edição, I. r. P., J. C., C. H., S. L. T. e z. p. F.; Visualização, H. C.; Supervisão, z. p. F.; Financiamento de aquisição, z. p. F e F. p. L.
Projeto apoiado pela Carolina do Sul melhorar professor qualidade ensino superior estado subvenção intitulado, conhecimento de processos de planta realçando médio notas ciência dos professores, estruturas e funções através do engajamento em pesquisa de Ciências de planta (planta Ciência)
Fundos premiados pelo United Sates departamento de educação (CFDA número 84.367B)
Os autores gostaria de agradecer Dr. Nian Wang da Universidade da Flórida para fornecer amostras de DNA genômicas de infectados Valência Citrus sinensis .

1. isolar o DNA genômico de tecidos vegetais, usando um Kit de extração de genômica
<ol><li>Obter o tecido foliar cítricas cortando uma toda nova folha de uma árvore citros usando a tesoura limpa e coloque a folha em um saco plástico limpo. Nota: A bolsa contendo o tecido foliar deve ser colocada em um frigorífico de 4 ° C ou em gelo em um recipiente isolado logo que possível após a coleta para evitar a deterioração.</li>
	<li>Adicione uma pequena quantidade de nitrogênio líquido para acalmar um almofariz e um pilão. Enquanto eles são de arrepiar, use uma tesoura para cortar um pequeno pedaço de tecido foliar, aproximadamente 1 polegada quadrada em tamanho. Coloque o tecido cortado o almofariz congelá-lo instantaneamente. Adicione mais nitrogênio líquido, se necessário. Nota: Luvas isoladas devem ser sempre usadas durante a manipulação de nitrogênio líquido.</li>
	<li>Triture rapidamente o tecido de planta em um pó fino, usando a argamassa. Continue a moagem até o nitrogênio líquido evapora-se completamente, e continua a ser um pó fino de verde.</li>
	<li>Brevemente relaxar uma espátula de metal em nitrogênio líquido para 10-15 s e, em seguida, colher o tecido do chão dentro a argamassa em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, utilizando a espátula.</li>
	<li>Adicione 600 µ l de solução de lise de núcleos (consulte Tabela de materiais) usando um 1000 µ l Pipetar e vortex a amostra para 1-3 s, então incubar em banho de água de 65 ° C por 15 min.</li>
	<li>Adicionar 3 µ l de solução de RNase o lisado usando uma pipeta de 10 µ l, inverta o tubo 2 - 5 vezes para misturar e incubar a 37 ° C numa incubadora do armário por 15 min. Nota: Deixe a mistura arrefecer à temperatura ambiente antes de prosseguir.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de solução de precipitação de proteínas, vórtice em alta velocidade por 20 s e, em seguida, centrifugar por 3 min a 13.000 x g, para formar uma bolinha firme. Enquanto a amostra está sendo centrifugada, adicione 600 µ l de isopropanol de temperatura para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta de µ l 1000, remova cuidadosamente o sobrenadante da amostra centrifugada, transferindo-o para o tubo de microcentrifugadora fresca 1,5 mL contendo isopropanol. A pelota agora pode ser descartada. Nota: Não poluir o sobrenadante com proteína, deixando uma quantidade minúscula de sobrenadante acima a pelota.</li>
	<li>Inverter o tubo, até que o DNA torna-se visível como uma massa de fios como fio e, em seguida, centrifugar a 13.000 x g por 1 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Decante o sobrenadante, adicionar 600 µ l de etanol 70% para a pelota, inverta o tubo várias vezes para lavar o DNA e centrifugar a 13.000 x g por 1 min.</li>
	<li>Cuidadosamente Aspire o etanol, deixando o pellet de DNA solta, em seguida, abra e inverter o tubo, descansando sobre papel absorvente. Ar seco à temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Adicionar 100 µ l de solução de reidratação de DNA ao pellet de DNA secas e, em seguida, incubar o DNA em um banho de água de 65 ° C durante 1 h, enquanto mistura periodicamente tocando o tubo.</li>
	<li>Coloque 1 µ l de água filtrada em uma microcuvette e inseri-lo em um espectrofotômetro para ser usado como um espaço em branco. Calcule a concentração de DNA presente colocando 1 µ l de amostra sobre o microcuvette, e inserindo o Espectrofotômetro. Concentração de DNA (ng / µ l) pode ser calculado como (260- um320) × diluição fator × 50 ng / µ l. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. A amostra pode ser armazenada a 4 ° C.</li>
</ol>2. realizar PCR em amostras de DNA genômico
<ol><li>Combine 10 µ l 2 x PCR Master Mix (ver tabela de materiais), 1 µ l para a frente da primeira demão (pM 10 / µ l), 1 µ l reverso da primeira demão (pM 10 / µ l) (ver tabela 2 para sequências da primeira demão), 100 ng de DNA genômico extraído da amostra e purificado de água (volume final de até 20 µ l) em um 50 µ l do PCR tubo, filme para misturar e brevemente centrífuga.</li>
	<li>Insira o tubo de PCR o thermocycler e executar em conformidade (ver tabela 1). Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Se necessário, armazene amostra a 4 ° C, após a reação é completa.</li>
</ol>3. electrophorese o DNA amplificado em um Gel de Agarose
<ol><li>Pesar 0,4 g de pó de agarose e adicioná-lo juntamente com 1 buffer de x TAE a um limpo 200 mL frasco de Erlenmeyer, enchendo até 50 mL.</li>
	<li>Microondas em alta por 1,5 min, agitando a cada 30 s, até agarose é totalmente dissolvido. Nota: Luvas isoladas devem ser usadas durante a manipulação de agarose líquido para evitar queimaduras.</li>
	<li>Adicionar 2,5 µ l de brometo de etídio 10mg/mL para o líquido do agarose e agitar a mistura e, em seguida, despeje o gel de agarose líquido em um molde de gel de nível. Inserir rapidamente pentes padrão 12-dente gel depois de derramar.</li>
	<li>Permitir que o gel para esfriar por 20 min em temperatura ambiente e, em seguida, remover o gel de pentes e colocar o gel em uma caixa de gel nível preenchida com 1 x TAE buffer.</li>
	<li>Utilizando uma micropipeta, carrega as amostras de DNA amplificadas totais em poços. Adicione 5 µ l de DNA da escada (ver Tabela de materiais) em um poço separado de suas amostras.</li>
	<li>Electrophorese as amostras por 35 min em uma constante de 90 V, retire o gel e coloque em um transiluminador UV.</li>
	<li>Fotografar e analisar o gel de borda padrão enquanto estiver usando transiluminação UV no 302 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

Huan Chen, Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Ming Chang, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu e Zheng Qing Fu declaram sem conflitos de interesse.

É fundamental que todos os passos são seguidos exatamente para alcançar as melhores condições experimentais. Tecido de folha inteira foi usado durante esta demonstração; no entanto, o protocolo pode ser modificado para incluir teoricamente qualquer tipo de tecido de planta. Anteriormente, investigadores extraído DNA genômico de tecido de veia foliar, ao invés de tecido foliar inteira e alcançado semelhantes resultados11. Se a banda correspondente ao gene de citrinos caixa não comparecer, ...

Cítrica greening, também conhecida como Greening, causou uma perda significativa de árvores de citrinos. Um caso representativo é Flórida, onde a doença está prevista para causar uma redução de 70% na produção de caixas de laranja Florida de 244 milhões de caixas na temporada 1997-1998 para 70 milhões de caixas a partir da temporada de 2016-20171. Mais de 90% das árvores cítricas na Flórida são infectadas2, e estima-se que a indústria de citros Florida perde cerca de 1 bilhão de dólares cada ano devido a doenças cítricas, onde cítrica greening desempenha um papel importante3. Cítrica greening é espalhada principalmente pelos psilídeos cítricos asiáticos invasivo Diaphorina citri, mas também pode ser transmitida por enxertia de tecido infectado. A doença causa amarelecimento das veias, manchas assimétrica folha amarela, desfolha prematura, dieback do galho, cárie de raiz e morte da planta. Importante, a doença causa a planta cítrica produzir flores fora de época, que raramente produzem frutos. A fruta que é produzida por plantas cítricas infectadas é imaturos, verde e amargo sabor4.
A finalidade desse método é exatamente e precisamente identificar a bactéria motile Candidatus liberibacter spp., o agente causador da cítrica greening, vivendo dentro do floema de árvores cítricas infectados5. DNA genômico é extraído do tecido da folha inteira, que contém a bactéria viva. Este DNA genômico extraído é usado como um modelo para o PCR convencional, onde oligonucleotídeos complementares a sequência de rDNA 16S da bactéria são utilizados para amplificar esta sequência. Oligonucleotídeos complementares a um gene de caixa cítrico são usados como um controle interno de amplificação. Nós escolhemos usar esse método, porque provou ser bem sucedido na anterior pesquisa6.
Este método tem a vantagem de ser simples, relativamente barato e capaz de ser realizado em qualquer laboratório de bioquímica normalmente equipado. Além disso, PCR continua a ser o método mais exato e preciso para detectar este patógeno, devido à dificuldade de cultivo deste patógeno7e capacidade do patógeno sobreviver e reproduzir-se durante anos dentro de um hospedeiro assintomático8. Muitos ensaios PCR de especialidade diferentes foram usados para detectar com sucesso este patógeno; no entanto, PCR convencional permanece o ensaio mais simples para a deteção de preciso e específico, especialmente dentro de hospedeiros assintomáticos8.

<table><tbody><tr><td>Kit de Purificação de DNA Genômico Wizard</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Fonte de Núcleos Soluções de Lise, RNase, Precipitação de Proteínas e Reidratação de DNA</td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td><td>Air Products</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler pro com painel de controle</td><td>Microondas Eppendorf</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W</td><td>Centrífuga</td> de mesa Panasonic <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 banho-maria digital</td><td>Fisher scientific</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>Espátula de metal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z283274</td><td></td></tr><tr><td>Almofariz e pilão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td></td></tr><tr><td>LSE Misturador de vórtice</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 10 &mu; L pontas</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 200 &mu; L pontas</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 1250 &mu; Pontas L</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr><tr><td>Kit de pipetador de volume variável</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>&mu; cubeta</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de fundição empilhável e pentes</td><td>Carolina</td><td>213655</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Fonte de alimentação básica</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT System</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487EDU</td><td></td></tr><tr><td>Bioespectrômetro básico</td><td>Eppendorf</td><td>6135000009</td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL Tubos de PCR</td><td>Fisher scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Água, grau PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ Escada de DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

específicos e detecção precisa do using pcr convencional em amostras de tecido de folhas cítricas cítricas greening patógeno candidatus liberibacter spp.

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Cítrica greening, também conhecida como Greening, é uma doença de citrino destrutiva devastando fazendas cítricas globalmente. Esta doença causa manchas assimétrica folha amarela, veia amarelamento, desfolha, cárie de raiz e, finalmente, a morte da planta cítrica. Quando infectadas, as plantas cítricas têm atrofiado crescimento e produzem flores fora de época. Estas flores raramente produzem frutos, e aqueles que produzem frutas cítricas pequenas, amargas, de forma irregular que não são desejáveis. Esta doença é transmitida pelos asiáticos citrinos psilídeos, Diaphorina citri e o enxerto de tecido infectado de citrino. O patógeno tem um período de incubação longo e variável dentro da planta de citros — às vezes anos, antes que os sintomas apareçam. Tentativas de cultura esse patógeno em vitro foram infrutíferas, possivelmente devido a baixa e desigual concentração do patógeno dentro infectado tecido cítrico, ou porque é difícil replicar o ambiental condições favorável para o crescimento de o patógeno. É muito difícil identificar a doença antes que ela se espalhou, devido ao seu longo período de incubação e a incapacidade dos investigadores à cultura do patógeno. Como resultado, a doença só se torna aparente depois de repente destruindo todo rendimento do agricultor um citrino. Apresentado aqui é um método para a deteção de precisa e específica do patógeno ecologização citros, Candidatus liberibacter spp. usando um kit de extração de DNA genômico e PCR. Este método é simples, eficiente, rentável e adaptável para análise quantitativa. Esse método pode ser adaptado para uso em qualquer tecido de citrino; no entanto, potencialmente é limitada pela quantidade de patógenos presentes no tecido. No entanto, esse método permitirá citros agricultores identificar plantas cítricas infectadas anteriormente e conter a disseminação desta doença destrutiva antes de ele pode espalhar ainda mais.

Um resultado positivo produz uma banda distinta correspondentes a 500 bp para Candidatus Liberibacter asiaticus Lss/Las6066, e/ou uma banda distinta, correspondente a 700 bp para Laa2/Laj5, inserida a β ribosomal 16S operon9. A banda de controle interno de amplificação também deve aparecer em 400 bp. Esta banda corresponde a amplificação do gene cítricas caixa 10e deve apar...

Cítrica Greening é uma doença particularmente destrutiva afetando culturas cítricas globalmente. Apresentado aqui é um método simples usando PCR e extração de DNA genômica de tecido foliar de citrinos para a identificação precisa e exacta do patógeno ecologização citros, Candidatus liberibacter spp.

Específicos e detecção precisa do Using PCR convencional em amostras de tecido de folhas cítricas cítricas Greening patógeno Candidatus liberibacter spp.

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar com precisão o patógeno do greening dos citros Candidatus liberibacter spp. no tecido foliar dos citros. Este método permite que os citricultores e pesquisadores identifiquem com rapidez e precisão a presença do patógeno responsável por causar o greening dos citros.O procedimento de demonstração será de Ian Palmer, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Este método é eficiente, econômico e adaptável para análise quantitativa. Além disso, pode ser realizado com um nível mínimo de experiência e equipamento de laboratório.Primeiro, use uma tesoura limpa para cortar uma folha inteira fresca de uma árvore cítrica e coloque em um saco plástico limpo para sanduíches. Em seguida, resfrie um almofariz e pilão, adicionando uma pequena quantidade de nitrogênio líquido. Em seguida, use a tesoura para cortar pequenos pedaços do tecido da folha, com aproximadamente uma polegada quadrada de tamanho.Coloque os pedaços de folhas na argamassa para congelá-los imediatamente. Comece rapidamente a moer o tecido da folha com a argamassa, até que o nitrogênio líquido evapore e um pó verde fino permaneça. Em seguida, resfrie uma espátula de metal em nitrogênio líquido, por 10 a 15 segundos.Em seguida, use a espátula fria para retirar o tecido moído da argamassa em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ML. Use uma pipeta de 1000 ml para adicionar 600 ml de solução de lise de núcleos à amostra. Em seguida, vórtice a amostra por um a três segundos.Incubar o tubo a 65 graus Celsius, em banho-maria por 15 minutos. Quando o período de incubação terminar, use uma pipeta de 10 ml para adicionar 3 ml de solução de RNA ao licato para remover o RNA. Em seguida, misture o conteúdo do tubo invertendo-o duas a cinco vezes.Incube a 37 graus Celsius por 15 minutos em uma incubadora de gabinetes. Após 15 minutos, adicione 200ML de solução de precipitação de proteína à amostra. Vortex o tubo em alta velocidade por 20 segundos.Em seguida, centrifugue a amostra a 13000G por três minutos. Durante o curso da centrifugação, adicione 600 ml de isopropanol, mantido à temperatura ambiente, a um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Após o término da centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo da centrífuga para o tubo que contém isopropanol.Descarte o pellet. Inverta o tubo para que o DNA fique visível como um fio. Em seguida, centrifugue a amostra a 13000G por um minuto em temperatura ambiente.Transvasar o sobrenadante após centrifugação. Em seguida, adicione 600ML de etanol a 70% ao pellet. Inverta o tubo várias vezes para lavar o pellet.Centrifugue o tubo a 13000G por um minuto. Após o término da centrifugação, aspire cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, inverta o tubo com a tampa aberta sobre um papel absorvente para secar ao ar por 15 minutos.Depois de seco, adicione 100ML de solução de reidratação de DNA ao pellet. Incube a suspensão de DNA a 65 graus Celsius em banho-maria por uma hora. Bata no tubo periodicamente durante a mistura.Adicione 1ML de água purificada em uma microcubeta. Leia a água em branco no espectrofotômetro. Em seguida, adicione 1ML da amostra na microcubeta.Coloque a microcubeta no espectrofotômetro e obtenha a concentração de DNA. Constitua a reação de PCR adicionando todos os reagentes e 100 nanogramas de DNA genômico em um tubo de PCR de 50ML. Misture os reagentes agitando suavemente o tubo, seguido de uma centrifugação rápida.Coloque o tubo de PCR no termociclador e execute o programa. Para preparar o gel de agarose, pese 0,4 gramas de pó de agarose. Em seguida, adicione o pó de agarose a um frasco Erlenmeyer de 200ML, ajustando o volume para 50ML com tampão 1X TAE.Microondas a mistura de agarose em alta por cerca de 1,5 minutos. Agitando a cada 30 segundos até que a agarose se dissolva completamente. Em seguida, adicione 2,5 ml de 10 miligramas por mililitro de brometo de etídio à agarose líquida.Em seguida, agite o frasco para misturar o brometo de etídio e despeje rapidamente o gel de agarose líquido em um molde de gel nivelado. Insira imediatamente um pente de gel padrão de 12 dentes. Deixe o gel esfriar por cerca de 20 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, remova o pente de gel.Agora coloque o gel solidificado na unidade de eletroforese preenchida com tampão 1X TAE. Carregue a amostra total de DNA amplificado e 5ML de DNA posteriormente em poços separados no gel. Inicie a unidade de eletroforese, a uma velocidade constante de 90 volts por 35 minutos.Em seguida, remova o gel da unidade de eletroforese. Em seguida, coloque o gel em um transiluminador UV. Capture as fotografias dos padrões de bandas de gel no transiluminador em 302 nanômetros.Para identificar a bactéria greening, os DNAs genômicos amplificados por PCR obtidos de amostras infectadas e não infectadas são eletroforesados. No gel, essas bandas correspondentes a 500 pares de bases indicam a presença de uma região específica do DNA ribossômico Las16S na bactéria CL asiaticas. Essas bandas correspondentes a 700 pares de bases indicam a presença de LAA2/LAJ5 e inserção presente na sequência de DNA do beta operon ribossômico 16S na bactéria.Essas bandas distintas em 400 pares de bases indicam a amplificação apenas do gene F-box dos citros, que se refere ao controle interno da amplificação. Para considerar nossos resultados válidos, é necessária a presença dessa banda. Pelo contrário, a presença de apenas uma banda em 400 pares de bases, mas a falta das outras bandas em 500 e 700 pares de bases indicam um tecido cítrico saudável.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de quatro horas se for executada corretamente. Este procedimento pode ser adaptado para permitir a realização de métodos mais quantitativos, como RTQPCR para detectar a quantidade de patógeno presente.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Fonte: Gulla, S., et al. Análise em Tandem-Repetição Multi-locus da Bactéria Yersinia ruckeri com patígenos de peixes por PCR multiplex e eletroforese capilar. J. Vis. Exp. (2019).Esse protocolo extrai DNA genômico da Yersinia ruckeri suspendendo colônias isoladas em água ultrapura e aplicando calor para lisar as células. A centrifugação separa o sobrenadante contendo DNA dos detritos celulares, produzindo DNA molde adequado para genotipagem baseada em PCR e análise epidemiológica.

Extração de DNA Genômico de Tecido Foliar Vegetal Infectado por Bactérias Patogênicas

Fonte: Chen, H., et al. Detecção específica e precisa do patógeno de enverdimento dos cítricos Candidatus liberibacter spp. Usando PCR convencional em amostras de tecido de folhas cítricas. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a extração de DNA genômico total de tecido foliar cítrico infectado por uma bactéria patogênica. O protocolo permite a recuperação confiável de DNA para a detecção subsequente baseada em PCR do patógeno limitado pelo floema.

Extração de DNA Total de Folhas para Detecção de Infecção Bacteriana

A quantificação do crescimento de patógenos é uma ferramenta poderosa para caracterizar várias respostas imunes de Arabidopsis thaliana (doravante: Arabidopsis). O método descrito aqui apresenta um ensaio otimizado de infiltração de seringa para quantificar a Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 crescimento em folhas adultas de Arabidopsis.

Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patossistema

PCR aninhado é uma técnica simples, sensível e específica que pode ser aplicada a escala que DNA extrai para sondar para Borrelia burgdorferi, o agente causador da doença de Lyme. A experiência inicial da PCR usa primeiras demão gene-específico para gerar amplicons longo, que em seguida tornar-se modelos para uma reação subsequente usando iniciadores internos.

Detectando a doença de Lyme espiroqueta, a Borrelia Burgdorferi, em carrapatos usando PCR aninhado

Este trabalho relata o protocolo para um ensaio de identificação rápida por Bemisia tabaci baseado na tecnologia de amplificação isotérmica mediada por laço (lâmpada). O protocolo exige formação mínima do laboratório e pode, portanto, ser implementado no local nos pontos de entrada para as importações de vegetais como os portos e aeroportos.

Um ensaio de amplificação isotérmica (lâmpada) mediada por Loop para identificação rápida de Bemisia tabaci

Desenvolvemos um método para detectar zoospores Phytophthora capsici em fontes de água usando um método de extração de DNA de papel filtro juntamente com um ensaio de amplificação isotérmica mediada em loop (LAMP) que pode ser analisado no campo ou no laboratório.

Detecção de Phytophthora capsici em água de irrigação usando amplificação isotérmica mediada por loop

Neste trabalho, foi desenvolvido um método de detecção rápido, sensível e portátil de Candidatus Liberibacter asiaticus baseado na amplificação da recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a.

Detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus implantável em campo usando amplificação de recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a

Nós projetamos, fabricamos e validamos um instrumento que processa rapidamente tecidos de brotos cítricos ricos em floema. Em comparação com os métodos atuais, o extrator de tecido de budwood (BTE) aumentou o rendimento da amostra e diminuiu os custos de mão de obra e equipamentos necessários.

Automatização do processamento de brotos cítricos para detecção de patógenos a jusante por meio de engenharia de instrumentos

Este manuscrito descreve um novo dispositivo de infusão direta de plantas para triagem da eficácia de moléculas contra a bactéria (Candidatus Liberibacter asiaticus) ou seu inseto vetor (Diaphorina citri, Kuwayama) que, em combinação, estão associadas à doença dos citros de Huanglongbing.

Dispositivo de Infusão Direta para Entrega de Moléculas em Plantas

Neste protocolo, um ensaio combinado de amplificação da polimerase recombinase CRISPR/Cas12a é ilustrado para a detecção do patógeno invasor da planta, Fusarium oxysporum f. sp. cubense raça tropical 4.

Ensaio CRISPR/Cas12a de amplificação da polimerase recombinase combinada para detecção de Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Aqui, descrevemos um procedimento simples e rápido para detectar DNA de patógenos de abelhas, como Lotmaria passim e Nosema ceranae, usando uma lise celular pronta para amplificação, amplificação da polimerase recombinase e ensaios CRISPR/Cas12a.

Detecção de DNA no local de parasitas tripanossomatídeos e Nosema ceranae por meio de lise alcalina acoplada ao sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Aprenda a detectar Candidatus liberibacter spp. em tecido foliar cítrico usando PCR convencional e extração de DNA genômico. Este método eficiente permite identificação rápida do patógeno causador do greening para agricultores e pesquisadores.

Específicos e detecção precisa do Using PCR convencional em amostras de tecido de folhas cítricas cítricas Greening patógeno Candidatus liberibacter spp. (Vídeo) | JoVE Journal

Específicos e detecção precisa do Using PCR convencional em amostras de tecido de folhas cítricas cítricas Greening patógeno Candidatus liberibacter spp.

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