Específicos e detecção precisa do Using PCR convencional em amostras de tecido de folhas cítricas cítricas Greening patógeno Candidatus liberibacter spp.

O objetivo geral deste procedimento é detectar com precisão o patógeno do greening dos citros Candidatus liberibacter spp. no tecido foliar dos citros. Este método permite que os citricultores e pesquisadores identifiquem com rapidez e precisão a presença do patógeno responsável por causar o greening dos citros.

O procedimento de demonstração será de Ian Palmer, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Este método é eficiente, econômico e adaptável para análise quantitativa. Além disso, pode ser realizado com um nível mínimo de experiência e equipamento de laboratório.

Primeiro, use uma tesoura limpa para cortar uma folha inteira fresca de uma árvore cítrica e coloque em um saco plástico limpo para sanduíches. Em seguida, resfrie um almofariz e pilão, adicionando uma pequena quantidade de nitrogênio líquido. Em seguida, use a tesoura para cortar pequenos pedaços do tecido da folha, com aproximadamente uma polegada quadrada de tamanho.

Coloque os pedaços de folhas na argamassa para congelá-los imediatamente. Comece rapidamente a moer o tecido da folha com a argamassa, até que o nitrogênio líquido evapore e um pó verde fino permaneça. Em seguida, resfrie uma espátula de metal em nitrogênio líquido, por 10 a 15 segundos.

Em seguida, use a espátula fria para retirar o tecido moído da argamassa em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ML. Use uma pipeta de 1000 ml para adicionar 600 ml de solução de lise de núcleos à amostra. Em seguida, vórtice a amostra por um a três segundos.

Incubar o tubo a 65 graus Celsius, em banho-maria por 15 minutos. Quando o período de incubação terminar, use uma pipeta de 10 ml para adicionar 3 ml de solução de RNA ao licato para remover o RNA. Em seguida, misture o conteúdo do tubo invertendo-o duas a cinco vezes.

Incube a 37 graus Celsius por 15 minutos em uma incubadora de gabinetes. Após 15 minutos, adicione 200ML de solução de precipitação de proteína à amostra. Vortex o tubo em alta velocidade por 20 segundos.

Em seguida, centrifugue a amostra a 13000G por três minutos. Durante o curso da centrifugação, adicione 600 ml de isopropanol, mantido à temperatura ambiente, a um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Após o término da centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo da centrífuga para o tubo que contém isopropanol.

Descarte o pellet. Inverta o tubo para que o DNA fique visível como um fio. Em seguida, centrifugue a amostra a 13000G por um minuto em temperatura ambiente.

Transvasar o sobrenadante após centrifugação. Em seguida, adicione 600ML de etanol a 70% ao pellet. Inverta o tubo várias vezes para lavar o pellet.

Centrifugue o tubo a 13000G por um minuto. Após o término da centrifugação, aspire cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, inverta o tubo com a tampa aberta sobre um papel absorvente para secar ao ar por 15 minutos.

Depois de seco, adicione 100ML de solução de reidratação de DNA ao pellet. Incube a suspensão de DNA a 65 graus Celsius em banho-maria por uma hora. Bata no tubo periodicamente durante a mistura.

Adicione 1ML de água purificada em uma microcubeta. Leia a água em branco no espectrofotômetro. Em seguida, adicione 1ML da amostra na microcubeta.

Coloque a microcubeta no espectrofotômetro e obtenha a concentração de DNA. Constitua a reação de PCR adicionando todos os reagentes e 100 nanogramas de DNA genômico em um tubo de PCR de 50ML. Misture os reagentes agitando suavemente o tubo, seguido de uma centrifugação rápida.

Coloque o tubo de PCR no termociclador e execute o programa. Para preparar o gel de agarose, pese 0,4 gramas de pó de agarose. Em seguida, adicione o pó de agarose a um frasco Erlenmeyer de 200ML, ajustando o volume para 50ML com tampão 1X TAE.

Microondas a mistura de agarose em alta por cerca de 1,5 minutos. Agitando a cada 30 segundos até que a agarose se dissolva completamente. Em seguida, adicione 2,5 ml de 10 miligramas por mililitro de brometo de etídio à agarose líquida.

Em seguida, agite o frasco para misturar o brometo de etídio e despeje rapidamente o gel de agarose líquido em um molde de gel nivelado. Insira imediatamente um pente de gel padrão de 12 dentes. Deixe o gel esfriar por cerca de 20 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, remova o pente de gel.

Agora coloque o gel solidificado na unidade de eletroforese preenchida com tampão 1X TAE. Carregue a amostra total de DNA amplificado e 5ML de DNA posteriormente em poços separados no gel. Inicie a unidade de eletroforese, a uma velocidade constante de 90 volts por 35 minutos.

Em seguida, remova o gel da unidade de eletroforese. Em seguida, coloque o gel em um transiluminador UV. Capture as fotografias dos padrões de bandas de gel no transiluminador em 302 nanômetros.

Para identificar a bactéria greening, os DNAs genômicos amplificados por PCR obtidos de amostras infectadas e não infectadas são eletroforesados. No gel, essas bandas correspondentes a 500 pares de bases indicam a presença de uma região específica do DNA ribossômico Las16S na bactéria CL asiaticas. Essas bandas correspondentes a 700 pares de bases indicam a presença de LAA2/LAJ5 e inserção presente na sequência de DNA do beta operon ribossômico 16S na bactéria.

Essas bandas distintas em 400 pares de bases indicam a amplificação apenas do gene F-box dos citros, que se refere ao controle interno da amplificação. Para considerar nossos resultados válidos, é necessária a presença dessa banda. Pelo contrário, a presença de apenas uma banda em 400 pares de bases, mas a falta das outras bandas em 500 e 700 pares de bases indicam um tecido cítrico saudável.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de quatro horas se for executada corretamente. Este procedimento pode ser adaptado para permitir a realização de métodos mais quantitativos, como RTQPCR para detectar a quantidade de patógeno presente.